专利名称：一种诊断猪瘟抗体的间接酶联免疫吸附测定方法
技术领域：
本发明涉及检测猪瘟抗体的方法，特别是利用原核表达结构蛋白E2诊断猪瘟抗体的间接酶联免疫吸附(ELISA)测定方法。
背景技术：
猪瘟(Hog Cholera，HC或Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Hog CholeraVirus，HCV)引起的猪的一种高度传染性病毒病，可引起猪急性发病、高热稽留、大量内出血，死亡率很高，是一种危害性极大的动物疾病，给世界各国的养猪业造成巨大的经济损失。因此，人们比较关注与猪瘟病毒有关基因结构以及猪瘟疫苗研制。研究表明，猪瘟病毒结构蛋白E2抗原区的基因结构，其中E2基因编码的外膜糖蛋白gp55是主要的免疫抗原蛋白，抗原位点主要集中在N端部部分区域。在我国广泛应用猪瘟兔化弱毒苗，使得急性猪瘟的发生减少，温和性猪瘟增多，以高温稽留为主要特征，若只靠临床症状，病理剖检很难确诊，必须采用更为准确的方法来进行诊断才能达到免疫检测的目的，实验室常用的诊断方法有琼脂扩散试验，免疫荧光试验，血清中和试验等，均可用来检测病毒抗原或抗体。实验室可根据需要选择不同的方法来检测抗体，其中血清学诊断检测猪瘟病毒抗体是诊断猪瘟的重要工具，也是免疫猪抗体水平检测的主要手段，最常用的是ELISA检测方法，但目前ELISA检测所用的抗原为细胞培养的病毒，猪瘟病毒在细胞培养上浓度低，导致该法生产的猪瘟抗原产量有限，成本较高，难以满足国内猪瘟诊断和免疫检测的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以重组蛋白为抗原建立间接酶联免疫吸附(ELISA)检测抗体的方法。
该方法步骤包括将猪瘟病毒结构蛋白E2基因中编码抗原的基因片段连接到质粒pGEM-T Easy载体上，获得重组质粒；将重组质粒纯化，与表达载体pPROEX-HTb相连，并转入大肠杆菌；培养转化的大肠杆菌，使带有所述基因片段的表达载体在大肠杆菌中表达；将表达的蛋白经包涵体提取、变性后，纯化、复性；以复性后的融合蛋白为抗原，间接酶联免疫吸附检测猪血清样本中抗体；根据测定值对样本的抗性进行判断。
本发明的有益效果在于a)用基因工程方法进行改造表达出的重组蛋白做抗原，具有成本低廉，操作简单，易于培养，生产周期短等优点。
b)用大肠杆诱导表达菌BL21(DE3)表达E2蛋白，表达量为菌体总蛋白量的35％，表达量较高，由于选用了带有六个组氨酸标记的pPROEX-HTb载体易于蛋白的纯化；c)间接ELISA检测猪瘟抗体，操作简单，耗时短，成本低，适合于大量动物血清的普查；d)针对我国猪瘟流行的实际状况以及疫苗生产工艺和动物免疫情况，与正向血凝试验作比较，确立判断标准。对我国动物猪瘟血清的诊断具有实际应用价值。
具体实施例方式
a)病毒RNA的提取从中国兽药监察所获得猪瘟兔化弱毒兔脾组织，采用博大公司总RNA提取试剂盒按使用说明进行操作。
b)反转录提取的总RNA 12μL，下游引物(5′CTGCCAACCGCCGTCTATCTT3′)1μL，65℃预热10min，冰浴5min后加入5倍的反转录缓冲液4μL，dNTP 2μL，AMV1μL，总体积20μL，42℃反应1小时。
c)PCR和nPCR扩增目的基因E2取反转录产物5μL，10倍的PCR缓冲液5μL，MgCl23μL，dNTP 4μL，引物(上游引物5′TGTATTAGACCAGACTGG3′，下游引物5′CTGCCAACCGCCGTCTATCTT3′)各1μL，Taq酶0.5μL，加水至50μL进行扩增。反应条件为95℃，50s；48℃，60s；72℃，120s，共35个循环，72℃延伸10min。nPCR(套式PCR)取一扩产物1μL，加入套式扩增用引物(上游引物5′GCGGATCCCGATACTTGGCATCATTGCAT3′，下游引物5′GCCTCGAGCCCCAACTTACAGTAGAATA3′)各1μL，其余步骤同上。
上述反转录和PCR及nPCR扩增中所用引物及dNTP、Taq酶均购自大连宝生物工程有限公司。
d)目的基因与pGEM-T Easy载体的连接、转化、质粒提取及纯化均按照有关文献(Molecular cloning and nucleotide sequence of hog chleravirus.Virology，1989，171555-567)记载进行。重组质粒经PCR、限制酶鉴定为阳性的质粒，送大连宝生物工程有限公司测序。其中，克隆载体pGEM-TEasy购自Promega公司，目的基因选用猪瘟病毒结构蛋白(gp55)编码基因E2中包含主要抗原区的序列片段(长度360bp)。
e)猪瘟病毒E2基因主要抗原区表达质粒的构建将测序正确的重组质粒及表达载体pPROEX-HTb(购自大连宝生物工程有限公司)分别纯化回收，回收的目的基因与表达载体用T4DNA连接酶在16℃连接10小时，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21(一种克隆外源基因用的宿主菌，购自大连宝生物工程有限公司)，用碱裂解法小量提取重组质粒，利用PCR，限制酶酶切鉴定阳性重组质粒。
f)重组质粒在大肠杆菌中的表达将含重组质粒的BL21(DE3)重组菌接种于含100μg/mL氨苄西林钠的2×YT培养基中，剧烈振摇至OD600为0.6-1.0时，加入IPTG至终浓度为1.5mmmol/L，37℃诱导表达。收集菌液分别将上清和沉淀进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹试验(Western-blotting)分析，检测表达产物。
g)表达产物的检测SDS-PAGE收集菌液离心后分别取上清和沉淀，加入2×上样缓冲液于沸水中煮5min。积层胶为5％，分离胶为10％，每孔上样20μL，电压120V。电泳结束后考马斯亮蓝R250染色，脱色分析。
Western-blotting将转移缓冲液浸泡1小时的滤纸、海绵、硝酸纤维素膜依次放入电转仪中，180mA转移3小时，转移结束后，剪下硝酸纤维素膜上的标准分子量Marker，氨基黑染色观察转移结果。硝酸纤维素膜用封闭液浸泡过夜，用PBST(含吐温20的磷酸盐缓冲液)洗涤三次，加入猪瘟阳性血清37℃结合2小时，PBST洗涤三次，加入辣根过氧化物酶标兔抗猪二抗37℃结合1小时，PBST洗涤三次，显色。
h)包涵体的制备
用0.1倍培养液体积的洗液(20mmmol/L Tris-HCl，10mmmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，1％Triton X-100，pH7.5)重悬沉淀，冷却至4℃，加入溶菌酶(购自美国Novagen公司)至终浓度100μg/mL，30℃温育15min，超声裂解至液体不粘稠，4000g离心10min，收集包涵体，用洗液重复洗涤两次。
i)包涵体的溶解计算包涵体湿重，加入含十二烷酰肌氨酸(N-lauroylsarcosine)的裂解缓冲液(50M CAPS，pH11.0)重悬包涵体，使包涵体的终浓度为10-20mg/mL，吹打至均一，使包涵体裂解，室温放置15min，4000g离心10min，收集上清备用。
j)E2融合蛋白的纯化采用亲和层析不同pH梯度洗脱法进行，4mL上述上清中加入1mL 50％NTAHisBind(琼脂糖)凝胶，室温振摇1h，装入层析柱中，用4mL洗液(8mol/L尿素，0.1mol/L NaH2PO4，0.01mol/L Tris-HCl，pH6.3)洗两次，收集洗脱液。再用1mL不同pH值的洗脱液(8mol/L尿素，0.1mol/L NaH2PO4，0.01mol/LTris-HCl，pH5.9和pH4.5)各洗2次，分别收集洗脱液，进行SDS-PAGE，保存含E2融合蛋白的洗脱液置-70℃备用。
k)纯化后E2融合蛋白的复性采用稀释透析法进行，具体步骤为将纯化获得的蛋白液稀释至一定浓度，置于蛋白液稀液50倍体积的含0.1mmol/L DTT(二硫苏糖醇)复性液(20mmol/LTris-HCl，pH8.5)中透析，4℃，3h换液一次，重复换液一次。换不含DTT复性液再透析3h，重复一次，以除去DTT。在蛋白液中加入还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽，使得还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽在蛋白液中的终浓度分别为1mmol/L和0.2mmol/L，4℃透析过夜。
l)E2融合蛋白检测猪瘟抗体间接ELISA方法的建立用方阵试验测定纯化复性后抗原的最佳工作浓度。然后进行如下操作①包被以包被缓冲液(0.05M Na2CO3/NaHCO3，pH9.6)将表达产物稀释至工作浓度，加入96孔酶标板，每孔50μL，4℃过夜，PBST洗三遍，拍干。
②封闭每孔加50μL封闭液(含5％蔗糖，10％马血清的PBST)，37℃封闭45min，PBST洗三遍，拍干。
③与一抗(待测血清)结合将作为一抗的待测血清(兰州兽医研究所提供)及阴性和阳性对照血清倍比稀释后加入96孔酶标板，每孔50μL，37℃结合1h，PBST洗五遍，拍干。
④与二抗(IgG/HRP)结合将兔抗猪IgG/HRP(辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG，购自Sigma公司)为二抗，用PBST做1∶1500稀释，每孔加50μL，37℃避光结合1h，PBST洗五遍，拍干。
⑤显色每孔加50μL H2O2/OPD，37℃避光反应15min。
⑥终止每孔加50μL 1.25mol/L H2SO4，测定OD492。
⑦结果判定阳性对照孔的OD值(P)，阴性对照孔的OD值(N)，若P/N≥2.1，试验成立，测定各孔的OD值(P)，阴性对照孔的OD值(N)，计算P/N。，P/N≥2.1为阳性，P/N＜2.1为阴性。
用该方法检测了3份感染猪瘟病毒的兔血清OD492，结果见表1对猪血清进行了检测，共检测100份猪血清，同正向血凝法相比较，正向血凝法检测效价为1∶16以上(免疫合格)动物的阳性符合率达80％。
以上试验结果表明，用原核表达结构蛋白E2诊断猪瘟抗体的间接ELISA方法对动物血清鉴别具有一定的应用价值。
表1 检测三份感染猪瘟病毒的兔血清OD492
权利要求
1.一种检测猪瘟抗体的方法，包括以下步骤将猪瘟病毒结构蛋白E2基因中编码抗原的基因片段连接到质粒pGEM-T Easy载体上，获得重组质粒；将重组质粒纯化，与表达载体pPROEX-HTb相连，并转入大肠杆菌；培养转化的大肠杆菌，使带有所述基因片段的表达载体在大肠杆菌中表达；将表达的蛋白经包涵体提取、变性后，纯化、复性；以复性后的融合蛋白为抗原，间接酶联免疫吸附检测猪血清样本中抗体；根据测定值对样本的抗性进行判断。根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原区基因片段为N端区中编码外膜糖蛋白gp55的基因。
2.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为BL21。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述纯化采用亲和层析法。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述复性采用0.1mmlol/L的二硫苏糖醇(DDT)复性液，且使最终蛋白液中的还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽浓度分别为1mmlol/L和0.2mmlol/L。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述间接酶联免疫吸附检测中，用方阵试验测定所述抗原的工作浓度后，包被、封闭、与抗体结合、显色、终止显色反应、测定OD492值以及比较阳性对照与阴性对照的OD492值。
6.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述阳性对照与阴性对照的OD492值之比小于2.1定为阴性，大于等于2.1定为阳性。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种以重组蛋白为抗原建立间接酶联免疫吸附(ELISA)检测抗体的方法。该方法步骤包括，将猪瘟病毒结构蛋白E
文档编号G01N33/573GK1540350SQ20031010341
公开日2004年10月27日 申请日期2003年10月31日 优先权日2003年10月31日
发明者刘湘涛, 谢庆阁, 魏旭文, 马军武 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所