专利名称：检测表皮生长因子受体基因位点突变的荧光定量pcr试剂盒的制作方法
专利说明检测表皮生长因子受体基因位点突变的荧光定量PCR试剂盒 本发明属于分子生物学领域，涉及一种检测基因突变的荧光定量PCR试剂盒，适用于各种癌组织中的表皮生长因子受体基因突变的检测。经大量的研究证实存在表皮生长因子受体基因18-21号外显子突变的肺癌患者，对吉非替尼的治疗非常敏感，因此如何快速检测出哪些病人具有这种特异性的改变，已经成为临床医生的迫切需要。而在这4个外显子的突变中，存在两个热点外显子上的突变，即19号外显子上的片段缺失和21号外显子上的碱基置换(引自1.Lynch TJ，Bell DW，Sordella R，et al.Activating mutations in theepidermal growth factor receptor underlying responsiveness ofnon-small-cell lung cancer to gefitinib.N Engl J Med.350(21)2129-39.2.Paez JG，Janne PA，Lee JC，et al.EGFRmutations in lung cancercorrelation with clinical responseto gefitinib therapy.Science.304(5676)1497-500.3.Pao W，Miller V，Zakowski M，et al.EGF receptor gene mutations arecommon in lung cancers from″never smokers″and are associatedwith sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib.ProcNatl Acad Sci U S A.101(36)13306-11.)本发明中的试剂盒即是针对这两个热点突变的检测而设计的。
目前，在临床上检测EGFR基因突变的方法主要是传统的直接测序法，另外还有一种采用三组特殊设计的四引物对DNA进行扩增的普通PCR的方法。以下将分别阐述他们的不足之处。
直接测序法的结果虽然具有客观性和特异性，但是它却存在诸多弊端1.检测周期长(从标本送检到得出结果最短要24个小时左右)。
2.操作过程复杂，且要涉及到PCR扩增后的操作，因此易被污染，造成结果的不理想(详见F项)。
3.测序结果的判读较复杂、费时(当样本量大时，此点尤为突出，详见F项)。
4.检测的敏感性不够高Katsuhiko等人发现，如果突变基因的含量占基因组DNA总量的10％以下时，则用直接测序法检测不到突变样本的存在(引自Endo K，konishi A，Sasaki H et al.Epidermal growth factor receptor gene mutation in non-small cell lungcancer using highly sensitive and fast TaqMan PCR assay.LungCancer.50(3)375-84)。
5.一次实验检测的样本量有限，最多只能24例。
6.不安全整个实验过程要用到多种有毒物质，如EB、丙烯酰胺等，对操作者和环境都有危害。
7.费用较高(每个位点的检测约需200元)。采用三组特殊设计的四引物对DNA进行扩增的普通PCR的方法的不足之处主要在于1.只能检测EGFR基因的点突变，而在肺癌患者中EGFR基因突变的常见类型不仅包括21号外显子上的点突变还包括19号外显子上的缺失突变。
2.引物设计复杂，反应过程繁琐，需要多次进行PCR反应。
3.只能用作定性检测。本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种能快速、准确地检测各种癌组织中表皮生长因子受体基因常见位点突变的荧光定量PCR试剂盒。
本发明采用以下技术措施一种快速、准确检测表皮生长因子受体基因特定位点突变的荧光定量PCR试剂盒。该试剂盒包括荧光定量PCR反应预混液(PCR Master Mix)、荧光定量反应液A、荧光定量反应液B(荧光定量反应液的特征是均含有正、反引物和荧光探针)、阳性对照样品A、阳性对照样品B、阳性对照样品C。
荧光定量反应液A检测的是表皮生长因子受体基因19号外显子上的2种缺失突变(2235-2249位点15个碱基的缺失；2240-2257位点18个碱基的缺失)。其正向引物序列为SEQ ID NOA1、反向引物序列为SEQ ID NOA2、荧光探针序列分别为SEQ ID NOA3和SEQ ID NOA4。荧光探针SEQ ID NOA3的5′端标记FAM(荧光报告基团)，3′端标记TAMRA(荧光淬灭基团)；荧光探针SEQ IDNOA4的5′端标记HEX(荧光报告基团)，3′端标记TAMRA(荧光淬灭基团)。
荧光定量反应液B检测的是表皮生长因子受体基因21号外显子上的2个点突变(2573位点的碱基置换突变和2582位点的碱基置换突变)。其正向引物序列为SEQ ID NOB1、反向引物序列为SEQ IDNOB2、荧光探针序列分别为SEQ ID NOB3和SEQ ID NOB4。荧光探针SEQ ID NOB3的5′端标记FAM(荧光报告基团)，3′端标记TAMRA(荧光淬灭基团)；荧光探针SEQ ID NOB4的5′端标记TET(荧光报告基团)，3′端标记TAMRA(荧光淬灭基团)。
阳性对照样品A是从存在表皮生长因子受体基因19号外显子上2235-2249位点缺失突变的肺癌患者的肺癌组织中提取的基因组DNA。
阳性对照样品B是从存在表皮生长因子受体基因19号外显子上2240-2257位点缺失突变的肺癌患者的肺癌组织中提取的基因组DNA。
阳性对照样品C是从存在表皮生长因子受体基因21号外显子上2573位点碱基置换突变的肺癌患者的肺癌组织中提取的基因组DNA。
在本发明中提供的两端都标有荧光发光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5′端报告基团发出的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3′端淬灭基团淬灭，所以体系中没有荧光信号的变化。而一旦它与突变后的模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板相结合的探针，其5′-3′外切酶活性就会将探针切断，荧光报告基团远离荧光淬灭基团，这样就破坏了两荧光基团之间的FRET，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做突变样本具体含量的定量检测。
本发明与以上两种方法比较，用FQ-PCR检测EGFR基因的突变具有以下优势1.检测时间短(从标本送检到得出结果可在12个小时以内完成)。
2.操作过程简单，并且从PCR反应开始，就是在封闭的体系中完成扩增和实时测定，大大降低了污染的可能性，因此也就降低了结果偏差的几率(比较如下所示)。
3.本技术对标本DNA获取的质量要求较低，无论是石蜡组织还是新鲜组织，都能取得理想的检测结果；直接测序法一般需要新鲜冰冻组织，检测步骤繁琐送检标本-提取DNA-定性PCR扩增-验证PCR产物-纯化PCR产物-直接测序；四引物普通PCR法送检标本-提取DNA-多次普通PCR反应-凝胶电泳
4.结果判读明确、直观(比较如下所示)；若需要亦可对结果进行定量分析。直接测序法结果的判读需将测序峰形图人工读出序列，再将所读出的序列结合基因库中的原始序列一起分析，从而得到结果。四引物普通PCR法结果的判读需要将每一个样本的条带均与Marker比较，从而得到一个定性的结果，因此该法在结果的判读上很费时，而且不够精确。荧光定量PCR法结果的判读在域值线以上有扩增曲线的标本均为阳性标本，结果判读非常简单，直观。如
图1、图4所示。
5.检测的敏感性高Livark等发现，在大多数情况下，对基因组DNA而言，它的最低检出限一般在pg级(Livark KJ，and Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitativePCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method 2001 Methods 25，402-408.)，也就是说即使只有微量的癌组织发生突变亦能检测出来。
6.检测的样本量大，一次实验最多可检测384例；四引物普通PCR法一次试验最多可检测96例。
7.安全整个体系中不包含有毒有害物质，对操作员和环境都无危害。
8.费用较直接测序法低(每个位点约需50元)。图1是部分阳性样本(9、12、13、38)的FQ-PCR图2是9号标本的测序图；图3是阳性样本(2、36、40)的FQ-PCR图；图4是部分阳性样本(7、29、32、42)的FQ-PCR图。收集中山大学附属肿瘤医院病理科2002年6月～2005年4月临床病理诊断为非小细胞肺癌(NSCLC)的71例女性患者的蜡块组织。所有患者术前均未接受过吉非替尼治疗。从蜡块中提取基因组DNA供以下的实验应用。
实施例1 用荧光定量PCR检测EGFR基因19号外显子上的2种缺失突变(2235-2249位点15个碱基的缺失；2240-2257位点18个碱基的缺失)设计能特异性检测15个碱基缺失和18个碱基缺失的探针各一条及公用引物一对SEQ ID NOA1 CTGGATCCCAGAAGGTGAGAAASEQ ID NOA2 AGCAGAAACTCACATCGAGGATTTSEQ ID NOA3 FCCGTCGCTATCAAAACATCTCCGAAP(检测15个碱基缺失的探针，F代表FAM基团，P代表TAMRA基团)SEQ ID NOA46TCGCTATCAAGGAATCGAAAGCCAACP(检测18个碱基缺失的探针，6代表HEX基团，P代表TAMRA基团)。
然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测反应体系为15μl，正、反引物各0.15μl(20μM)，探针各0.2μl(20μM)，模板DNA 2.5μl(100-300ng/μl)，2*Taqman universal PCR Master Mix(购自美国应用生物公司)7.5μl，ddH2O 4.3μl。荧光定量反应在ABI7900检测仪上进行。
结果为在71例样本中共检测出6例样本有15个碱基的缺失(阳性样本号为9、12、13、33、38、55)，部分阳性样本见图1；及3例样本有18个碱基的缺失(阳性样本号为2、36、40)，见图3。
实施例2 用荧光定量PCR检测EGFR基因21号外显子上的2个点突变(2573位点的碱基置换突变和2582位点的碱基置换突变)首先设计能特异性检测2573位点碱基置换突变和2582位点碱基置换突变的探针各一条及公用引物一对SEQ ID NOB1 AACACCGCAGCATGTCAAGASEQ ID NOB2 CCTTACTTTGCCTCCTTCTGCATSEQ ID NOB3 FTTTGGCCCGCCCAAAATCTGTP(检测2573位点突变的探针，(F代表FAM基团，P代表TAMRA基团)。SEQ ID NOB47CGCACCCAGCTGTTTGGCCP(检测2582位点突变的探针，(7代表TET基团，P代表TAMRA基团)。
然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测反应体系为15μl，正、反引物各0.15μl(20μM)，探针各0.2μl(20μM)，模板DNA0.5μl(100-300ng/μl)，2*Taqman universal PCR Master Mix(购自美国应用生物公司)7.5μl，ddH2O 6.3μl。荧光定量反应在ABI7900检测仪上进行。
结果为72例样本中共检测出12例样本有2573位点的碱基置换突变，图4为部分的阳性样本；无样本存在2582位点的碱基置换突变。
由此看出FQ-PCR法不仅是快速、高效的，而且其结果的判读非常明确、直观，结果亦是可靠、特异的(结果可靠性的验证可见该实验的实验数据)。
检测表皮生长因子受体基因位点突变的荧光定量PCR试剂盒<110>邵建永<120>检测表皮生长因子受体基因位点突变的荧光定量PCR试剂盒<160>8<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1ctggatccca gaaggtgaga aa22<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>2agcagaaact cacatcgagg attt 24<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>3ccgtcgctat caaaacatct ccgaa 25<210>4<211>
<212>DNA<213>人工序列<400>4tcgctatcaa ggaatcgaaagccaac 26<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列
<400>5aacaccgcag catgtcaaga 20<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>6ccttactttg cctccttctg cat 23<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>7tttggcccgc ccaaaatctg t 21<210>8<211>
<212>DNA<213>人工序列<400>8cgcacccagc tgtttggcc19
权利要求
1.一种检测表皮生长因子受体基因位点突变的荧光定量PCR试剂盒，它包括荧光定量反应预混液、荧光定量反应液A、荧光定量反应液B、阳性对照样品A、阳性对照样品B、阳性对照样品C，其中荧光定量反应液A其正向引物序列为SEQ ID NoA1 CTGGATCCCAGAAGGTGAGAAA，反向引物序列为SEQ ID NoA2 AGCAGAAACTCACATCGAGGATTT，荧光探针序列为SEQ ID NoA3 CCGTCGCTATCAAAACATCTCCGAA和SEQ ID NoA4 TCGCTATCAAGGAATCGAAAGCCAAC；荧光定量反应液B其正向引物序列为SEQ ID NoB1 AACACCGCAGCATGTCAAGA，反向引物序列为SEQ ID NoB2 CCTTACTTTGCCTCCTTCTGCAT，荧光探针序列分别为SEQ ID NoB3 TTTGGCCCGCCCAAAATCTGT和SEQ ID NoB4 CGCACCCAGCTGTTTGGCC；阳性对照样品A是从存在表皮生长因子受体基因19号外显子上2235-2249位点缺失突变的肺癌患者的肺癌组织中提取的基因组DNA；阳性对照样品B是从存在表皮生长因子受体基因19号外显子上2240-2257位点缺失突变的肺癌患者的肺癌组织中提取的基因组DNA；阳性对照样品C是从存在表皮生长因子受体基因21号外显子上2573位点碱基置换突变的肺癌患者的肺癌组织中提取的基因组DNA。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于荧光定量反应液A中的荧光探针SEQ ID NoA3的5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA，荧光探针SEQID NoA4的5′端标记荧光报告基团HEX，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA；荧光定量反应液B中的荧光探针SEQ ID NoB3的5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA，荧光探针SEQID NoB4的5′端标记荧光报告基团TET，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，涉及一种检测基因突变的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括荧光定量PCR反应预混液、荧光定量反应液A、荧光定量反应液B(荧光定量反应液的特征是均含有正、反引物和荧光探针)、阳性对照样品A、阳性对照样品B、阳性对照样品C。本发明具有以下特点检测时间短，操作过程简单，对标本DNA获取的质量要求较低，结果判读明确、直观，检测的敏感性高，检测的样本量大，安全，费用较直接测序法低。
文档编号G01N33/52GK1884580SQ20061003560
公开日2006年12月27日 申请日期2006年5月25日 优先权日2006年5月25日
发明者邵建永, 张海芳 申请人:邵建永