专利名称：：He4单克隆抗体和它们的使用方法
技术领域：
：本发明涉及能够结合人附睾蛋白4(HE4)的抗体和使用此类抗体的方法，特别地在用于诊断卵巢癌和用于鉴定具有增加的患卵巢癌的可能性的患者的方法中使用此类抗体的方法。
背景技术：
：卵巢癌代表了在全球范围内影响妇女的异质疾病群。存在几种形式的卵巢癌，包括卵巢的上皮癌、生殖系癌(germ-linecancer)和卵巢基质癌(ovarianstromalcancer)。上皮卵巢癌代表了该疾病的最常见形式。大约5_10%的上皮卵巢癌代表了疾病的遗传类型，3种常见模式得到公认单独的卵巢癌；与分别在染色体17q21和13ql2上的BRACl和BRCA2基因连锁(geneticlinkage)有关的卵巢和乳腺癌；以及卵巢和结肠癌。卵巢癌的最重要的危险因素是患病的一级亲属(例如，患卵巢癌的母亲、姊妹或女儿)。参见，例如，Patridge等人(1999)CA-ACancerJournalforClinicians49:297-320。在2005年，估计存在22，000例诊断为卵巢癌的新病例和16，000例卵巢癌引起的死亡。通常参见www,cancer,org上的美国癌症学会网站；www.cancer,gov上的美国国立癌症研究所网站。卵巢癌是主要影响具有63岁的中位诊断年龄的绝经后妇女的疾病。然而，疾病可影响所有年龄组的妇女。www,seer,cancer,gov上的美国国立癌症研究所的Surveillance，Epidemiology,andEndResults(SEER)计划。卵巢癌分期的分类基于超出卵巢的疾病的定位对扩散的程度。1期卵巢癌局限在1个或2个卵巢中。2期疾病牵涉1个或2个卵巢中的肿瘤，并且伴有盆腔蔓延。在3期卵巢癌中，肿瘤存在于1个或2个卵巢中，并有通过显微镜确认的骨盆外腹膜转移和/或局部淋巴结转移。4期卵巢癌的特征在于超出腹膜腔的远端转移。由于缺乏标志小肿瘤存在的特异性临床症状，因而通常在疾病的晚期诊断出卵巢癌。对于年龄低于50岁的妇女，低于40%的卵巢癌被检测到，此时肿瘤定位至1个或2个卵巢，并且此时疾病的预后最好。对于年龄超过50岁的妇女，该数值下降至低于15%。大约68%的患卵巢癌的所有年龄组的妇女直至远端转移出现才被诊断出来。通常参见w胃.seer,cancer,gov上的美国国立癌症研究所的Surveillance,Epidemiology,andEndResults(SEER)计戈丨J。卵巢癌通过从卵巢上皮局部脱落入腹膜腔内，然后植入腹膜和局部侵入肠和膀胱来进行扩散。参与卵巢癌的淋巴结的存在在被诊断的卵巢癌的所有分期中是明显的。阳性淋巴结的百分数随疾病的发展而显著增加(即，1期，24%；2期，50%；3期，74%；4期，73%)。Id.卵巢癌患者的存活率是疾病被诊断出时所处的分期的函数，对于晚期疾病，5年存活率减少。超过90%的经诊断患有1期卵巢癌的妇女在诊断后存活至少5年。当疾病直至4期(即，远端转移)才被诊断时，5年存活率下降至低于30%。Id.上皮卵巢癌是疾病的最常见形式。存在4个公认的上皮卵巢癌的主要组织学分类，包括血清亚型、子宫内膜样(endometrioid)亚型、透明细胞(clearcell)亚型和粘蛋白(mucinous)亚型。卵巢癌发病机理知之甚少，但据认为产生自卵巢表面上皮。参见Bell(2005)Mod.Pathol.18(Suppl2):S19_32。提供卵巢癌的危险的最大减少的生命因素(lifefactor)包括经产(multiparity)、口服避孕药的使用和母乳喂养，其全都阻止排卵。因为排卵导致上皮损伤，接着进行修复和可能的炎症反应，该过程在整个妇女育龄中的无间断重复导致细胞损伤和增加卵巢癌的危险。参见，例如，Ness等人(1999)J.Natl.CancerInst.91:1459-1467。然而，对于卵巢癌通过确定的前驱病变(precursorlesion)，例如对于子宫颈癌(cervicalcarcinoma)和结肠癌的公认的那些进行渐近演变，还未得到公认。因此，大量的研究一直以来关注于理解卵巢癌的分子基础和理解卵巢癌的不同组织学亚型之间的基本差异。这些研究已利用基因表达分析来提供该理解并且已鉴定了系列在诊断应用中用于评估的潜在生物标记。参见例如Ono等人(2000)CancerRes.605007-11；Welsh等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA981176-1181；Donninger等人(2004)Oncogene238065-8077；和Lee等人(2004)Int.J.Oncol.24(4):847_851。卵巢癌通常根据明显的临床症状的存在，最明显地腹痛、附件肿块(adnexalmass)、腹部气胀和尿急的存在来检测。这样，通常在晚期检测到卵巢癌，此时预后和临床结果不良。卵巢癌的早期(即，1期)检测导致大约90%的治愈率(使用标准手术和化学疗法)；因此存在对在早期(此时治疗将最有效)检测卵巢癌的临床需要。不幸的是，目前检测早期卵巢癌的筛查方法不足。目前卵巢癌筛查的实践利用CA125和经阴道超声(超声检查)。CA125的升高的血清水平与卵巢癌相关，经阴道超声的随后使用帮助检测卵巢癌的存在。卵巢疾病的确认基于侵入性方法例如剖腹手术(laparotomy)。然而，由于有限的灵敏度、有限的特异性和小于3%的弱阳性预测值的问题，CA125的使用对于一般群体筛查是无效的。Bast(2003)JClinOncol.21(lOSuppl):200_205。因此，对于无症状患者群体中卵巢癌的一般筛查的推荐存在争议。参见www,cancer,rov上的国立癌症研究所网站。对于高危患者，用于卵巢癌的检测的一般可接受的方法包括骨盆检查的使用、CA125血清测试的使用以及经阴道超声(超声检查).Patridge等人(1999)CA-ACancerJournalforClinicians49:297_320。CA125是通常在上皮细胞表面上表达的良好表征的肿瘤标记，并且通常在正常患者的血清中检测为35U/mL。通常在大约85%的卵巢癌患者中检测到提高的CA125血清水平(>35U/mL)；剩余的15%的卵巢癌患者具有正常的CA125血清水平。此外，CA125只在50%的1期卵巢癌患者中提高，从而限制了其在卵巢癌的早期检测中的临床应用。然而，提高的CA125血清水平用于监测治疗性干预后疾病的复发，这代表了目前由FDA批准的CA125的用途。此外，提高的CA125血清水平预示着进一步可检测的卵巢癌。一般群体中卵巢癌的低流行率对可促进疾病的早期检测的筛查测试的发展产生了重大的挑战。用于具有低流行率的疾病例如卵巢癌的筛查方法通常导致高比例的假阳性比真阳性，这限制了此类筛查程序的临床应用。假定显著的危险与可能的卵巢癌的手术探查(surgicalexploration)相关，那么临床上有用的筛查测试应当指对于每一个确实患有卵巢癌的妇女的查出进行不超过10个妇女(S卩，至少10%的阳性预测值(PPV))的手术。Skates等人(2004)J.Clin.Oncol.22:4059_4066。PPV高度依赖于特定疾病或病状的流行率并且由于疾病患病率的不同将发生显著的变化。因此，对于低患病率疾病，例如卵巢癌，具有相对低的PPV的筛查诊断测试仍然具有显著的临床功用。潜在的卵巢癌筛查程序必须就卵巢癌的低患病率进行调整，并且就生物标记的表现和临床需要对其进行评估。参见，例如，Skates等人(2004)J.Clin.Oncol.224059-4066；Bast等人(2005)Int.J.Gynecol.Cancer15:274_281；和Rosen等人(2005)Gyn.Oncol.99:267_277。尽管进行了鉴定用于卵巢癌的检测，特别地早期检测的生物标记或成组的生物标记的努力，但目前还不存在足够的满足临床需要的筛查或诊断测试。目前可获得的方法例如CA125的检测展示了不可接受的高假阳性率。来自美国国立癌症研究所的当前推荐指出“没有足够的证据证实使用血清标记例如CA125、经阴道超声或骨盆检查进行的卵巢癌的筛查可导致卵巢癌引起的死亡率的减少”(NCISummaryofEvidence(Level4,5)；标明日期2005年2月)。鉴于目前可获得的筛查技术的假阳性的严重危险，NCI不支持卵巢癌的一般筛查方法的建立。这样，对于卵巢癌不存在标准化的筛查测试。卵巢癌例如上皮卵巢癌(EOC)的5年存活率很大程度上取决于诊断时疾病的分期；增加的存活率与早期检测(即，1或2期)相关。然而，绝大部分卵巢癌直至3或4期才被诊断出来，此时预后不良。因此，需要在早期鉴定更多的卵巢癌。允许卵巢癌的早期鉴定的生物标记的表征具有改善许多患者的临床结果的潜能。一个这样的候选生物标记是人附睾蛋白4(HE4)。HE4是首先在人附睾组织中观察到的并且在某些癌症(包括卵巢和乳腺癌)中过表达的分泌型和糖基化蛋白。随后的研究已显示HE4蛋白也存在于女性生殖道和其他上皮组织中。HE4基因存在于人染色体20ql2_13.1上，并且已发现20ql2染色体区域在卵巢癌症中频繁扩增。参见,例如，Bouchard等人(2006)于oncology,thelancet.com7167-174中；Galagono等人(2006)Mod.Patholo.19:847_583；Drapin等人(2005)CancerResearch65(6):2162_9；Lu等人(2004)Clin.CancerRes.103291-3300；HellstrOm等人(2003)CancerResearch63:3695-3700;和Bingle等人(2002)Oncogene21:2768-2773，其全部以其全文通过引用合并入本文。因此，卵巢癌细胞中HE4的过表达表明该蛋白可在用于检测卵巢癌或用于鉴定具有增加的患卵巢癌的可能性的患者的方法中用作生物标记。根据上述内容，在本领域内存在对能够检测生物标记例如HE4的表达的抗体的需要，所述生物标记的过表达可表示卵巢癌或增加的患者患卵巢癌的可能性。此类抗体可用于诊断卵巢癌或鉴定具有增加的患卵巢癌的可能性的患者的方法中。发明概述提供了用于诊断卵巢癌和鉴定具有增加的患卵巢癌的可能性的患者的组合物和方法。组合物包括能够结合人附睾蛋白4(HE4)的单克隆抗体。本文还包括此类单克隆抗体的抗原结合片段和变体、能够产生此类抗体的杂交瘤细胞系以及包含本发明的单克隆抗体的试剂盒。本发明的组合物用于诊断癌症的方法和用于鉴定具有增加的患卵巢癌的可能性的患者的筛查方法。用于在患者中诊断卵巢癌的方法通常包括通过两抗体(two-antibody)或“夹心”ELISA技术检测HE4蛋白在患者身体样品中的过表达，如本文中所描述的。用于鉴定具有增加的患卵巢癌的可能性的患者的筛查方法通常包括在患者身体样品中检测多个在卵巢癌中选择性过表达的生物标记的表达。生物标记的过表达表示增加的患者患卵巢癌的可能性。本发明的方法可包括例如“两步骤”分析法，其中进行第一测定步骤来检测第一生物标记(例如，HE4)或第一组生物标记的表达。如果第一生物标记或第一组生物标记过表达，则进行第二测定步骤来检测第二生物标记或第二组生物标记的表达。第一和第二生物标记或组生物标记的过表达表示增加的患者患卵巢癌的可能性。本发明的方法可利用公开的HE4抗体来检测患者样品中HE4的表达。本发明的组合物和方法还可用于其他类型的癌症包括但不限于乳腺癌的诊断或检测。本发明的组合物还包括分离的多肽，所述多肽包含能够结合HE4单克隆抗体的表位。此类多肽用于产生HE4抗体的方法。还提供了编码HE4表位的氨基酸序列的分离的核酸分子。附图概述图1提供了在下文描述的夹心ELISA测定中使用称为363A90.1和363A71.1的HE4单克隆抗体获得的HE4(使用来自55岁以上的患者的样品(A)和不同年龄的患者样品(B))的接受者操作特性(ReceiverOperatingCharacteristic)(ROC)曲线。发明详述提供了用于在患者中诊断卵巢癌和用于鉴定具有增加的患卵巢癌的可能性的患者的组合物和方法。组合物包括能够结合HE4(已显示在卵巢癌细胞中过表达的蛋白质)的单克隆抗体。还公开了产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。还提供了包含本文中描述的单克隆抗体的试剂盒。本组合物特别地用于在患者中诊断卵巢癌的“夹心”ELISA法和用于鉴定具有增加的患卵巢癌的可能性的患者的筛查法，如下面详细描述的。本发明的组合物包括特异性结合HE4或其变体或片段的单克隆抗体。特别地，提供了称为363A90.1和363A71.1的HE4抗体。产生HE4单克隆抗体363A90.1和363A71.1的杂交瘤细胞系于2007年2月2日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas,Virginia,20110-2209并且分别赋予专利保藏号PTA-8196和PTA-8195。在国际承认用于专利程序的微生物菌种保藏布达佩斯条约的条款下维持这些保藏。这些保藏只是为了方便本领域技术人员而进行的而不是在35U.S.C.§112下要求保藏的承认。本文中还公开了具有单克隆抗体363A90.1和363A71.1的结合特征的抗体。此类抗体包括但不限于在竞争结合测定中与这些抗体竞争的抗体以及结合能够结合单克隆抗体363A90.1或363A71.1的表位的抗体。还提供了单克隆抗体363A90.1和363A71.1的保持特异性结合HE4的能力的变体和片段。组合物还包括产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系和包含至少一种本文中公开的单克隆抗体的试剂盒。“抗体”和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体展示对抗原的结合特异性，但免疫球蛋白包括抗体和缺乏抗原特异性的其他抗体样分子。后一种类型的多肽例如通过淋巴系统以低水平产生和通过骨髓瘤以增加的水平产生。术语“抗体”广泛地包括抗体的天然发生形式和重组抗体例如单链抗体、嵌合和人源化抗体和多特异性抗体以及前述所有形式的片段和衍生物，所述片段和衍生物具有至少抗原结合位点。抗体衍生物可包括缀合至抗体的蛋白质或化学部分。术语“抗体”以最广泛的意义使用，其涵盖完全装配的抗体、可结合抗原的抗体片段(例如，Fab'、F'(ab)2、Fv、单链抗体、双抗体(diabody))和包含前述的重组肽。如本文中所使用的，“HE4抗体”是指特异性结合任何HE4同种型，特别地HE4同种型Tl(SEQIDNO=D或其变体或片段的任何抗体，包括单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体和保持亲本抗体的抗原结合功能的其片段。已知HE4蛋白的5个同种型，称为T1-T5，如下面表1中所描述的。本领域技术人员将认识至丨J，本发明的HE4单克隆抗体可结合多于一种HE4同种型，只要各同种型包含特定HE4抗体的相关表位序列。表1:HE4同种型<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本发明的HE4抗体最佳是单克隆抗体。本文中使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均一的抗体的群体(即，包含个体抗体的群体除了可以以少量存在的可能的天然发生的突变外是同一的)获得的抗体。“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是大约150，000道尔顿的由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。各轻链通过一个共价二硫键与重链连接，然而二硫键的数目在不同的免疫球蛋白同种型(isotype)的重链中是变化的。各重链和轻链还具有有规律间隔的链内二硫桥。各重链在一端具有可变结构域(Vh)，之后是许多恒定结构域。各轻链在一端具有可变结构域以及在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。特定的氨基酸残基据认为形成了轻链和重链可变结构域之间的界面。术语“可变的”是指可变结构域的某些部分在抗体间在序列上广泛不同并且用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，可变性不是均勻分布在整个抗体的可变结构域中。其集中在轻链和重链可变结构域中的称为互补决定区(CDR)或高变区的3个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为构架(FR)区。天然重链和轻链的可变结构域各自包含4个FR区，主要采取通过3个CDR(其形成环形连接)连接的ρ-折叠(p-sheet)构型，和15在一些情况下形成ρ-折叠结构的部分。各链中的⑶R通过FR区与来自另一条链的CDR紧密地结合在一起，促成了抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，NIHPubl.No.91-3242，第I卷，第647-669页(1991))。恒定结构域不直接参与抗体对抗原的结合，但展示不同的效应子功能，例如抗体在抗体依赖性细胞毒性中的参与。术语“高变区”，当在本文中使用时，意指负责抗原-结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变结构域中的残基24-34(Li)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变结构域中的31-35(Hl),50-65(H2)禾口95-102(H3)；Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5fiB.■PublicHealthService,NationalInstituteofHealth,25Bethesda,MD.[1991])和/或来自“高变环”的残基(即，轻链可变结构域中的残基26-32(Li)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变结构域中的2632(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Clothia和Lesk，J.Mol.Biol,196:901-917[1987])。“构架区”或“FR”残基是除了本文中认为的高变区残基外的可变结构域残基。“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata等人(1995)ProteinEng.8(10)1057-1062)；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶降解产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有单个抗原结合位点，和残留的“Fe”片段，其名称反映了其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原的F(ab')2片段。"Fv"是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在两链Fv类别中，该区域由紧密非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv类别中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可通过易曲的肽连接体共价连接，这样轻链和重链可以以类似于两链Fv类别中的二聚体结构的“二聚体”结构结合。在该构型中，各可变结构域的3个CDR相互作用以确定二聚体的表面上的抗原结合位点。共同地，6个⑶R赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或只包含3个对于抗原是特异性的CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，虽然以低于完整结合位点的亲和力结合。Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ChI)。Fab片段与Fab'片段的差异在于在重链(^1结构域的羧基端数个残基的添加，包括来自抗体铰链区的1个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中关于其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基的Fab'的名称。F(ab')2抗体片段最初产生为在它们之间具有铰链半胱氨酸的Fab‘片段对。本发明包括HE4抗体的片段，只要它们保持期望的全长抗体的亲和力。因此，例如，HE4抗体的片段将保持结合HE4抗原的能力。此类片段的特征在于与相应的全长抗体相似的特性，即，片段将特异性结合HE4。此类片段在本文中称为“抗原结合”片段。抗体的适当的抗原结合片段包含全长抗体的一部分，通常为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、F(ab')2和Fv片段以及单链抗体分子。“Fab”意指由轻链和重链的一部分组成的免疫球蛋白的单价抗原结合片段。F(ab')2意指包含两条轻链和两条重链的一部分的免疫球蛋白的双价抗原结合片段。“单链Fv”或“sFv”抗体片段意指包含抗体的Vh和\结构域的片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。参见，例如，美国专利4，946，778,5,260，203,5,455，030和5，856，456，通过引用合并入本文。一般地，Fv多肽还包含在Vh和\结构域之间的使sFv能够形成期望的结合抗原的结构的多肽连接#。#fsFv的胃i$，#HPluckthun(1994)ThePh￡irm￡icologyofMonoclonalAntibodies,第113卷，ed.RosenburgandMoore(Springer-Verlag,NewYork),第269-315页。抗体或抗体片段可从使用例如McCafferty等人.(1990)Nature348552-554(1990)和美国专利5，514，548中描述的技术产生的抗体噬菌体文库分离。Clackson等人.(1991)Nature352:624_628和Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222581-597分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。随后的公开物描述了通过链改组(Marks等人(1992)Bio/Technology10:779-783)以及作为用于构建非常大的噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等人(1993)Nucleic.AcidsRes.212265-2266)进行的高亲和力(nM范围)人抗体的产生。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的常规单克隆抗体杂交瘤技术的可行的备选。已发展不同的技术用于产生抗体片段。常规地，通过完整抗体的蛋白水解降解来产生此类片段(参见，例如，Morimoto等人(1992)JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107_117(1992)和Brennan等人(1985)Science229:81)。然而，此类片段现在可通过重组宿主细胞来直接产生。例如，可从上面论述的抗体噬菌体文库分离抗体片段。备选地，Fab'-SH片段可从大肠杆菌(E.coli)直接回收，然后经化学偶联来形成F(ab')2片段(Carter等人(1992)Bio/Technology10163-167)。根据另一个方法，F(ab')2片段可直接从重组宿主细胞培养物分离。用于产生抗体片段的其他技术对于本领域技术人员来说是显然的。优选本发明的抗体是天然单克隆的。如上面所指出的，“单克隆抗体”意指从基本上均一的抗体的群体(即，包含个体抗体的群体除了可以以少量存在的可能的天然发生的突变外都是同一的)获得的抗体。关于抗体的类别或来源，该术语不受限制。该术语包括完整的免疫球蛋白以及片段例如Fab、F(ab')2、Fv和保持抗体的抗原结合功能的其他片段。单克隆抗体是高度特异性的，其抗单个抗原位点，即如本文下面定义的，HE4蛋白内的特定表位。此外，与通常包括抗不同决定子(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂不同，各单克隆抗体抗抗原上的单一决定子。修饰词“单克隆”是指从基本上均一的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，按照本发明使用的单克隆抗体可通过最早由Kohler等人(1975)Nature256:495描述的杂交瘤方法来制备，或可通过重组DNA方法(参见，例如美国专利4，816，567)来制备。“单克隆抗体”还可通过使用例如Clackson等人(1991)Nature352:624_628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222581-597；和美国专利5，514，548中描述的技术从噬菌体抗体文库分离。单克隆抗体可使用Kohler等人(1975)Nature256:495_496的方法或其改进方法来制备。一般地，用含有抗原的溶液免疫小鼠。可通过在盐溶液，优选地佐剂例如弗氏完全佐剂中混合或乳化含有抗原的溶液，然后胃肠外注射该混合物或乳状液来进行免疫。本领域内已知的任何免疫方法可用于获得本发明的单克隆抗体。在免疫动物后，取出脾(和任选地，几个大淋巴结)，并且将其分离成单个细胞。可通过将细胞悬浮液应用于用目的抗原涂铺的板或孔来筛选脾细胞。表达对于抗原是特异性的膜结合免疫球蛋白的B细胞(即，产生抗体的细胞)结合板并且不被冲洗掉。然后诱导所得的B细胞或所有分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，从而形成产生单克隆抗体的杂交瘤，然后在选择培养基上进行培养。通过连续稀释将所得的细胞涂板并且就特异性结合目的抗原(并且不结合不相关抗原)的抗体的产生对其进行测定。然后体外(例如，在组织培养瓶或空心纤维反应器中)或体内(作为小鼠的腹水)培养选择的分泌单克隆抗体(mAb)的杂交瘤。还可使用重复免疫多位点技术(ItepetitiveImmunizationsMultipleSitestechnology)(RIMMS)产生单克隆抗体。参见，例如，Kilpatrick等人(1997)Hybridoma16(4):381_389;Wring等人(1999)J.Pharm.Biomed.Anal.19(5):695_707；和Bynum等人(1999)Hybridomal8(5):407_411，其全部以其全文通过引用合并入本文。作为杂交瘤的使用的备选，可在细胞系例如CHO细胞系中产生抗体，如美国专利5，545，403,5,545，405和5，998，144中公开的；通过引用合并入本文。简而言之，用分别能够表达轻链和重链的载体转染细胞系。通过转染分开的载体上的两个蛋白，可产生嵌合抗体。另一个有利方面是抗体的正确糖基化。还可通过用生物标记蛋白筛查重组的组合免疫球蛋白文库(例如，抗体噬菌体展示文库)，从而分离结合生物标记蛋白的免疫球蛋白文库成员来鉴定和分离单克隆抗体。用于产生和筛查噬菌体展示文库的试剂盒可商购获得(例如，PharmaciaRecombinantPhageAntibodySystem,目录号27-9400-01；禾口StratageneSurfZAPPhageDisplayKit,目录号240612)。此外，可在例如美国专利5，223，409、PCT发明者J·W·格勒克,R·L·齐克,T·J·费希尔申请人:三路影像公司