专利名称：N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶电泳活性染色的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种酶的活性染色，尤其是涉及一种N-乙酰-P-D-氨基葡萄糖苷酶电泳活性染 色的检测方法。
背景技术：
酶作为诊断指标具有简便、快速的特点。NAGase是几丁质级联催化降解途径的关键酶之 一，广泛存在于动物、植物及微生物体内。在甲壳动物体内，NAGase与食物消化、幼体的孵 化、周期性蜕皮、抗菌防护等密切相关；人体内，NAGase与糖尿病、肾病、乳腺癌、胃癌等 疾病有关，已作为生化指标供这些疾病的诊断参考及检测。
目前，国内外关于NAGase的活力分析体系与方法研究已趋成熟完善，酶活力分析主要以 对硝基苯-N-乙酰-(3-D-氨基葡萄糖苷(pNp-P-D-GlcNAc)为底物，在偏酸性条件下，酶催化 底物水解的能力。该法能有效、简便、快速检测NAGase存在与活力大小，但该法对于酶的纯 化制备、酶在生物体不同组织内、不同生长生理期的电泳活性染色是不适用的。迄今为止， 国内外关于NAGase活性染色的研究还没有系统地建立。1998年，Peter等([l] peters G, Saborowski R， Mentldn R, Buchholz F. Isoforms of N-acetyl國(3隱D隱gluGosaminidase from the Antarctic krill, Euphausia superba:purification and antibody production[J]Comparative Biochemistry and Physiology Part B 120(1998) 743-751 )报道萘酚AS-BI-N-乙酰-(5-D-氨基葡萄 糖苷为底物，用Fast Garnet GBC显色对NAGase进行电泳活性染色。具体步骤13 mg萘酚 AS-BI-N-乙酰-卩-D-氨基葡萄糖苷溶于2 ml乙二醇单甲醚，45 mg Fast Garnet GBC振荡溶于2 ml 0.2mol/lCPB， pH5.5。再将凝胶置于混合液中，在35 。C下反应15-30 min直至显色明显。最 后将凝胶放入脱色液(25%甲醇,10%乙酸)漂洗至背景色为暗黄色。国内也有使用该法用于组 织染色的报道([2]黄幼蓉，苗德林.P-N-乙酰葡萄糖胺酶组织化学改良法在胃癌诊断中的应用 [J].重庆医科大学学报，1994, 19(2): 146-147)。但该法存在使用的底物量大，成本较高，反 应吋间较长等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种N-乙酰-(3-D-氨基葡萄糖苷酶电泳活性染色的检测方法。 本发明包括以下步骤1) 配制材料，配制材料包括配制反应液、染色液和酶液；
2) 活性染色，活性染色包括以下步骤
(1) 配制Native-PAGE;
(2) 上样将提取的对4下NAGase粗酶液上样；
(3) 电泳在层析柜内低温电泳；
(4) 反应电泳完取胶，用蒸馏水冲洗后，放入反应液中，反应后，用蒸馏水洗涤,-
(5) 染色放入染色液内染色，取出用蒸馏水洗涤，放置在水中保存；
(6) 扫胶结果即可快速检测NAGase的活性条带。
在步骤l)中，所述配制反应液是在底物l mg萘酚AS-BI-N-乙酰-(3-D-氨基葡萄糖苷 (SIGMA，N4006)力卩0.2 ml 95%乙醇助溶后，再加O.l mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液溶解至20 ml; 所述配制染色液是将20 mg Fast Blue BB salt溶于IO ml 0.01 mol / L的Tris-HCl缓冲液；所述 Fast Blue BB salt可采用厦门泰京生物技术有限公司产的Fluka44670，所述Tris-HCl缓冲液的 pH最好为7.5， 4°C;所述配制酶液是用O.Ol mol/L的Tris-HCl缓冲液pH 7.5抽提凡纳滨对虾 NAGase粗酶液。
在步骤2) (1)中，所述Native-PAGE中含10。/。分离胶，5%浓縮胶。 在步骤2) (3)中，所述低温电泳的电流最好为恒流20mA，低温电泳的时间最好为4h。 在步骤2) (4)中，所述放入反应液中最好放入37'C保温的反应液中，反应5 10min后， 用蒸馏水洗涤2 3次。
在步骤2) (5)中，所述放入染色液内染色最好是在4"C下染色5min，取出用蒸馏水洗 涤2 3次。
本发明利用N-乙酰-(3-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase,EC 3.2丄52)在中性条件下将基质液 中的萘酚AS-BI-N-乙酰-p-D-氨基葡萄糖苷水解，产生萘酚AS-BI能与不同的色基重氮盐偶合 成不同的色调和牢度的偶氮染料，定性检测N-乙酰-p-D-氨基葡萄糖苷酶在生物组织存在。
本发明提供一种快速灵敏、简便鉴定NAGase凝胶电泳的固蓝BB盐活性染色方法，以对
虾提取的粗NAGase酶液为样品，直接将粗酶制品上样进行凝胶电冰。电泳完成后，将凝胶放
在萘酚AS-BI-N-乙酰-P-D-氨基葡萄糖苷反应液中浸泡5min，然后再在固蓝BB盐染色液中，在
4'C的条件下染色5min，即可将凝胶中的酶分子定位带显示出来。这种固蓝BB盐的活性染色
方法耗时短，与考马斯亮蓝染色相比，可以清楚确定酶蛋白的存在。本方法较之使用底物量
少，采用不同偶氮染料，故无须脱色，操作更简便快捷，是对NAGase电泳活性染色方法的改
进，对NAGase快速检测有重要意义。
图l为NAGase的Native-PAGE活性染色结果。在图1中，上样次序从左到右前4条带依次为 某日提取的虾壳膜粗酶液(15 ^， 20 nl，活力3.2241U)和内脏粗酶液(15 nl, 20 nl，活力 1.03448U)，第5泳道为某日提取的虾壳膜粗酶液(20 pl，活力4.1667U)，从图中可以看出染 色深浅与酶活力和量的多少正相关。
具体实施例方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
1) 配制材料，配制材料包括配制反应液、染色液和酶液。
配制反应液是在底物lmg萘酚AS-BI-N-乙酰-p-D-氨基葡萄糖苷(SIGMA，N4006)力叫.2 ml 95%乙醇助溶后，再加O.l mol/LpH7.5的磷酸缓冲液溶解至20ml。
配制染色液是将20 mg Fast Blue BB salt溶于IO ml 0.01 mol / L的Tris-HCl缓冲液；所述 Fast Blue BB salt可采用厦门泰京生物技术有限公司产的Fluka44670,所述Tris-HCl缓冲液的 pH最好为7.5， 4°C。
配制酶液是用O.Ol mol/L的Tris-HCl缓冲液pH 7.5抽提凡纳滨对奸NAGase粗酶液。
2) 活性染色，活性染色包括以下步骤
(1) 配制Native-PAGE: 10%分离胶，5%浓縮胶；
(2) 上样将提取的对虾NAGase粗酶液上样；
(3) 电泳在层析柜内低温电泳4h，恒流20mA;
(4) 反应电泳完取胶，用蒸馏水冲洗后，立即放入37。C保温的反应液中，反应5 10min 后，用蒸馏水洗涤2 3次；
(5) 染色放入新配制的预冷染色液内，4'C染色5min，取出用蒸馏水洗涤2 3次，放 置在水中保存；
(6) 扫胶结果即可快速检测NAGase的活性条带。
权利要求
1.N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶电泳活性染色的检测方法，其特征在于包括以下步骤1)配制材料，配制材料包括配制反应液、染色液和酶液；2)活性染色，活性染色包括以下步骤(1)配制Native-PAGE；(2)上样将提取的对虾NAGase粗酶液上样；(3)电泳在层析柜内低温电泳；(4)反应电泳完取胶，用蒸馏水冲洗后，放入反应液中，反应后，用蒸馏水洗涤；(5)染色放入染色液内染色，取出用蒸馏水洗涤，放置在水中保存；(6)扫胶结果即可快速检测NAGase的活性条带。
2. 如权利要求l所述的N-乙酰-P-D-氨基葡萄糖苷酶电泳活性染色的检测方法，其特征在 于在步骤l)中，所述配制反应液是在底物l mg萘酚AS-BI-N-乙酰-p-D-氨基葡萄糖苷 (SIGMA，N4006)力[]0.2 ml 95%乙醇助溶后，再加O.l mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液溶解至20 ml; 所述配制染色液是将20 mg Fast Blue BB salt溶于IO ml 0.01 mol / L的Tris-HCl缓冲液。
3. 如权利要求2所述的N-乙酰-卩-D-氨基葡萄糖苷酶电泳活性染色的检测方法，其特征在 于所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.5， 4'C。
4. 如权利要求l所述的N-乙酰-l3-D-氨基葡萄糖苷酶电泳活性染色的检测方法，其特征在 于在步骤l)中，所述配制酶液是用O.Ol mol/L的Tris-HCl缓冲液pH 7.5抽提凡纳滨对虫下 NAGase粗酶液。
5. 如权利要求l所述的N-乙酰-p-D-氨基葡萄糖苷酶电泳活性染色的检测方法，其特征在 于在步骤2) (1)中，所述Native-PAGE中含10。/。分离胶，5%浓縮胶。
6. 如权利要求l所述的N-乙酰-P-D-氨基葡萄糖苷酶电泳活性染色的检测方法，其特征在 于在步骤2) (3)巾，所述低温电泳的电流为恒流20mA，低温电泳的时间为4h。
7. 如权利要求l所述的N-乙酰-卩-D-氨基葡萄糖苷酶电泳活性染色的检测方法，其特征在 于在步骤2) (4)中，所述放入反应液中是放入37'C保温的反应液中，反应5 10min后，用 蒸馏水洗涤2 3次。
8. 如权利要求l所述的N-乙酰-P-D-氨基葡萄糖苷酶电泳活性染色的检测方法，其特征在 于在歩骤2) (5)中，所述放入染色液内染色是在4'C下染色5min，取出用蒸馏水洗涤2 3 次。
全文摘要
N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶电泳活性染色的检测方法，涉及一种酶的活性染色。提供一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶电泳活性染色的检测方法。配制材料包括配制反应液、染色液和酶液；活性染色，活性染色包括以下步骤配制Native-PAGE；将提取的对虾NAGase粗酶液上样；在层析柜内低温电泳；电泳完取胶，用蒸馏水冲洗后，放入反应液中，反应后，用蒸馏水洗涤；放入染色液内染色，取出用蒸馏水洗涤，放置在水中保存；结果即可快速检测NAGase的活性条带。使用底物量少，采用不同偶氮染料，无须脱色，操作更简便快捷，是对NAGase电泳活性染色方法的改进，对NAGase快速检测有重要意义。
文档编号G01N1/30GK101666723SQ20091011257
公开日2010年3月10日 申请日期2009年9月23日 优先权日2009年9月23日
发明者烨 王, 谢晓兰, 陈清西, 魏晓倩, 黄乾生 申请人:厦门大学