专利名称：脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片的制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，特别是指一种脂肪细胞分化代谢产物抗 体芯片的制备方法
背景技术：
本项目主要应用与在糖尿病、动脉粥样硬化、高血压、肥胖等疾病的相 关蛋白领域创立抗体芯片检测技术平台，自主研发脂肪细胞分化代谢产物抗 体芯片检测试剂盒(抗体芯片)完全是由中国人自主开发，应用这一芯片， 可通过多种方式、多种渠道、多层面检测脂肪细胞分化代谢产物的效价和含
量，将检测灵敏度由ug提高到ng级，从而达到更准确、更全面的效果，其 检测结果即可定性也可定量。脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片检测试剂盒(抗 体芯片)对促进我国生物高技术前沿领域的发展具有重大鼓舞作用，对提升 我国生物芯片技术、产品和巿场的国际竞争力具有重大意义，此方法完全符 合分子免疫学原理。目前国外几乎所有的主要制药公司都不同程度地釆用了 生物芯片技术来寻找药物靶标，查检药物的毒性或副作用及进行药物产品的 定量和定性。用芯片技术进行大规模的药物筛选可以省略大量的动物试验， 缩短药物筛选所用时间，从而带动创新药物的研究和开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片的制备方法。
本发明的整体技术构思是利用细胞融合、亚克隆及酶联免疫吸附实验 进行特异性筛选技术，获得高效价、高特异性抗人脂肪细胞分化代谢产物单 克隆抗体，由于此单抗效价髙、特异性好，可直接应用于芯片的点样，结合 CY3标记的补体C3抗体与被检产品建立了完整的检测系统检测检测45种脂肪
分化代谢蛋白质含量的方法.此抗体芯片具有灵敏度高，特异性好、操作简单、高通量等优点，可用于临床和体检血清的监测和质控。 脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片的制备方法，它包括如下工艺步骤
(1) 单克隆抗体制备将具有较高活性Sp2/0细胞与致敏的脾细胞悬液 按1: 10-100比例混合，加入聚乙二醇(美国Sigma公司出品)使细胞彼此 融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基(美 国海克隆公司出品)进行细胞培养；
(2) 筛选单克隆细胞系待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔
培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体 含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的 抗体分狄孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位 测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；
(3) 单克隆抗体特异性筛选选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于 1: 10000的阳性孔的上清，与多厂家、多批次的脂肪细胞分化代谢产物进行 特异性和效价筛选。
(4) 单克隆抗体纯化保存使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪(美国通用公司 制造)将单克隆抗体细胞系培养的溶液在A280nm时收集，1.44 (吸光单位) 浓度为l-10mg/ml。
(5 ) CY3标记抗体用CY3荧光素标记补体C3抗体。
(6) 脂肪细胞分化代谢产物45种单克隆抗体微阵列点样 一张芯片点 48个点，每一种单抗一个点，每一个点的含量0. 01-lng/ml。
(7) 与45种之外的脂肪细胞分化代谢的蛋白质进行特异性筛选。
本发明的具体工艺步骤和各步骤中的工艺参数是
步骤(1)中具有高活性的Sp2/0细胞与致敏的脾细胞的比值按1:10的 比例混合，加入PEG使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中，第1 分钟滴加4. 5ml培养液；间隔2分钟滴加5ml培养液，然后加培养液50ml， 以HAT选择培养基按36 %的孔为1个细胞/孔进行细胞培养。
步骤(2)中是将细胞培养至覆盖0%~20%孔底时，吸取培养上清用酶 联免疫吸附实验方法检测抗体含量，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体 分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。
步骤(4)中使用AKTA蛋白纯化仪FPLC将单克隆抗体细胞系培养的溶在A280nra时收集，吸光单位=1. 44时浓度为lmg/ml。 步骤(5)中选用的是CY3对补体C3抗体的标记
步骤(6)中选用脂肪细胞分化代谢产物微阵列点样 一张芯片点45个 点，检测范围0. 01 ~ 10 ng/ml。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于所获得的抗人脂肪 细胞分化代谢产物45种单克隆抗体分别经AKTA蛋白纯化仪FPLC纯化，其效 价高、特异性非常好，可直接将有限稀释的抗体点于芯片上，与标记的补体 C3抗体和检测样本进行杂交，借助目前先进的芯片检测仪器进行检测。此技 术与传统的检测方法比较，具有快速、操作便捷、高通量检测的特点；并可 快速、准确地进行定性和定量检测。
本发明所公开的方法是将高纯度脂肪细胞分化代谢产物经细胞融合、克 隆化培养、以及大量的组织细胞原位特异性筛选从而获得高效价、高特异性 的抗人脂肪细胞分化代谢产物单克隆抗体，此抗体可直接应用于临床检测和 基础研究。单克隆抗体在生物学和医学研究领域中具有极大的应用价值，是 亲和层析中重要的配体，是免疫组化中主要的抗体，是免疫检验中的新型试 剂，是生物治疗的导向武器。作为脂肪细胞分化代谢产物的检测试剂，抗人 脂肪细胞分化代谢产物单克隆抗体可以充分发挥其优势。单克隆抗体的特异 性强，可将抗原抗体反应的特异性大大提高，减少了可能的交叉反应，使试 验结果可信度更大。单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应 结果便于质量控制，利于标准化和规范化。
其各项指标如下
1、 单克隆抗体细胞系来源于一个细胞。
2、 阳性克隆孔酶联免疫吸附实验效价大于1: 10000
3、 阳性克隆孔特异性表达45种脂肪细胞分化代谢产物抗体如下 脂肪因子(adipokines) : TNF-cc、 ASP、 leptin、 PAI—1、 IL—6、 resistin、
adiponectin、 visfatin、 RBP-4、 GLUT-4、 LPL、 PGAR、UCPs、 PPAR-y 、
C/EBP、 ADD1、 SREBP1、 NPY
与疾病相关的因子MC-4R、 POMC、 cx-MSH、 AgRP、 orexin、 GH、 IGF-1、 Acrp30、 VEGF、 HBEGF、 HGF、 Aug II 、 ACE、 AGT、 FA transporter eN0S、 iNOS各分化阶段标志因子ACC、FAS、ME、 ATP-citratelyase、 AP2、apoE、 peril ipin、
ACBP、 PEPCK、 A2-adr国rec印tor。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述
脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片的制备方法，其特征在于它包括如下工 艺步骤
(1 )单克隆抗体制备将具有较高活性Sp2/0细胞与致敏的脾细胞悬液 按1: 10-100比例混合，加入聚乙二醇(美国Sigma公司出品)使细胞彼此 融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基(美
国海克隆公司出品)进行细胞培养；
(2) 筛选单克隆细胞系待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔
培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体 含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的 抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位 测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；
(3) 单克隆抗体特异性筛选选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于 1: 10000的阳性孔的上清，与多厂家、多批次的脂肪细胞分化代谢产物进行
特异性和效价筛选。
(4) 单克隆抗体纯化保存使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪(美国通用公司 制造)将单克隆抗体细胞系培养的溶液在A28()nm时收集，1.44 (吸光单位) 浓度为1-10mg/ml。
(5 ) CY3标记抗体用CY3荧光素标记补体C'3抗体。
(6) 脂肪细胞分化代谢产物45种单克隆抗体微阵列点样 一张芯片点 48个点，每一种单抗一个点，每一个点的含量0. 01-lng/ml。
(7) 与45种之外的脂肪细胞分化代谢的蛋白质进行特异性筛选。
步骤(1 )单克隆抗体制备将具有较髙活性Sp2/0细胞与致敏的脾细胞 悬液按1: 10-100比例混合，加入聚乙二醇(美国Sigraa公司出品)使细胞 彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基 (美国海克隆公司出品)进行细胞培养；步骤(2)进行完毕后釆用酶联免疫吸附实验方法测定抗血清，该方法由
如下操作步骤组成
a、 包被
以50mmol/L 、 pH=9的碳酸盐缓冲液将步骤(1 )中的高纯度脂肪细胞分 化代谢产物45种分别1: 500稀释，包被96孔聚乙烯板，真空抽干，密封4 'C保存备用。
b、 封闭
每孔加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液200 pl洗涤、内含1%山羊血清；
c、 加样
每孔加入细胞融合一周后的培养上清50jul (l:5000稀释)，每板设一正 常对照、阳性对照及空白(磷酸盐缓冲液)，洗涤；
d、 加入酶标二抗每孔lOO(il,洗涤；
e、 显色
每孔加入底物100jul;
f、 比色
以空白调零，405nm波长测定光密度(O.D);
g、 结果判断P/N-测定标本O.D均值/阴性血清O.D均值，P/N>2. l为阳性。
步骤a中的聚乙烯板规格为200jal/孔、真空抽干温度为4。C，洗涤釆用 0. 05%的Tween-20磷酸盐缓冲液洗涤3次。
步骤b中的工艺参数为每孔加入p^7. 4、含1%山羊血清磷酸盐缓冲液200 Hl,温度为37°C、时间l小时，洗涤3次。
步骤c中的工艺条件为每孔加入1:5000稀释后的细胞融合一周后的培养 上清50yl，每板设一正常对照、阳性对照及空白(磷酸盐缓冲液)，温度为 37°C、时间为l小时，洗涤3次。
步骤d中的工艺条件加入酶标二抗每孔lOO)al,温度为37°C、时间为1 小时，洗涤3次。
步骤e中的工艺条件为室温、时间为IO分钟，然后使用终止液终止反应， 经酶标仪在波长450nm处读取光密度值。
步骤(3)依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞再 行克隆化，与多批次脂肪细胞分化代谢产物经ELISA筛选呈阳性表达。然后确定高分泌、高特异性细胞株扩大培养或冻存。
步骤(4 )使用AKTA蛋白纯化仪FPLC将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，吸光单位=1. 44时浓度为lmg/ml。步骤(5 )中选用的CY3标记补体C3抗体
步骤(6)中选用的脂肪细胞分化代谢产物单克隆抗体微阵列点样 一张芯片点45个点，检测范围0. 01 ~ 10 ng/ml。
步骤(7)中选用的与其它脂肪细胞分化代谢产物进行特异性筛选。此脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片经30批次的脂肪细胞分化代谢产物产品的特异性筛选表达均为阳性，与11种18批次的其它脂肪细胞分化代谢产物进行特异性筛选阳性表达为0。表明此芯片特异性很高，适合提供给医疗及科研机构进行脂肪细胞分化代谢产物的鉴定和质控评价，此抗体还可制成免疫组化或酶联免疫吸附实验试剂盒开展医学基础研究。
权利要求
1、脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片的制备方法，其特征在于它包括如下工艺步骤(1)单克隆抗体制备将具有较高活性Sp2/0细胞与致敏的脾细胞悬液按1∶10-100比例混合，加入聚乙二醇(美国Sigma公司出品)使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基(美国海克隆公司出品)进行细胞培养；(2)筛选单克隆细胞系待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；(3)单克隆抗体特异性筛选选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于1∶10000的阳性孔的上清，与多厂家、多批次的脂肪细胞分化代谢产物进行特异性和效价筛选。(4)单克隆抗体纯化保存使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪(美国通用公司制造)将单克隆抗体细胞系培养的溶液在A280nm时收集，1.44(吸光单位)浓度为1-10mg/ml。(5)CY3标记抗体用CY3荧光素标记补体C3抗体。(6)脂肪细胞分化代谢产物45种单克隆抗体微阵列点样一张芯片点48个点，每一种单抗一个点，每一个点的含量0.01-1ng/ml。(7)与45种之外的脂肪细胞分化代谢的蛋白质进行特异性筛选。
2、 根据权利要求l所述的脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片的制备方法，其特 征在于所述的步骤(1 )将具有较高活性Sp2/0细胞与致敏的脾细胞悬液按1: 10-100比例混合，加入聚乙二醇(美国Sigma公司出品)使细胞彼此融合， 在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基(美国海克 隆公司出品)进行细胞培养。(6)脂肪细胞分化代谢产物单克隆抗体微阵列 点样 一张芯片点45个点，检测线性范围0.01-10 ng/ml。
3、 根据权利要求1或2所述的脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片的制备方法， 其特征在于所述的步骤(1)进行完毕后采用酶联免疫吸附实验方法测定抗血 清，该方法由如下操作步骤组成a、 包被以50mmol/L 、 pH=9的碳酸盐缓冲液将步骤(1 )中的高纯度脂肪细胞分 化代谢产物45种每一种1: 500稀释，包被96孔聚乙烯板，真空抽干，密封rc保存备用。b、 封闭每孔加入pH为7. 4的磷酸盐缓冲液200 iu 1洗涤、内含1%山羊血清；c、 加样每孔加入细胞融合一周后的培养上清50-100 m 1 ( 1: 5000-10000稀释), 每板设一正常对照、阳性对照及空白(磷酸盐缓冲液〕，洗涤；d、 加入酶标二抗每孔100-200jul,洗涤；e、 显色每孔加入底物50-100 nl;f、 比色以空白调零，405mn波长测定光密度(O.D);g、 结果判断P/N—则定标本O.D均值/阴性血清O.D均值，P/N>2. l为阳性。
4、 根据权利要求3所述的脂肋细胞分化代谢产物抗体芯片的制备方法， 其特征在于所述的步骤c中的工艺条件为每孔加入1: 5000-10000稀释后的培 养上清50-100|il,每板设一正常对照、阳性对照及空白(磷酸盐缓冲液)， 温度为37'C、时间为l小时，洗涤3次。
5、 根据权利要求3所述的脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片的制备方法， 其特征在于所述的步骤e中的工艺条件为室温、时间为10分钟，然后使用终 止液终止反应，经酶标仪在波长450nm处读取光密度值。
6、 根据权利要求1所述的脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片的制备方法， 其特征在于所述的步骤(1)中具有高活性的Sp2/0细胞与致敏的脾细胞的比 值按1: 10-100的比例混合，30-60秒内逐渐加入45%PEG (分子量4000 ), 静止90-120秒，使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中，第l分钟 滴加4. 5rall640培养液；间隔2分钟滴加5ml1640培养液、然后加1640培养 液至50ml, 1500rpm/分钟离心10分钟，以HAT选择性培养基(美国海克隆公 司出品)按20-50 %的孔为1个细胞/孔进行细胞培养。
7、 根据权利要求1所述的脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中是将细胞培养至覆盖0% ~20%孔底时，吸取培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，依抗体的分泌'隋况筛选出 高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，然后进行抗原特异的免疫组 织化学测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。
8、 根据权利要求1所述的脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片的制备方法， 其特征在于所述的步骤(3)中选用的多厂家30批次的脂肪细胞分化代谢产 物与此单克隆抗体呈阳性表达。
9、 根据权利要求1所述的脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片的制备方法， 其特征在于所述的步骤(4 )中使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪将小鼠IgG单克隆 抗体腹水溶液在A28Qnm时收集，吸光单位=1. 44时浓度为1-10mg/ml。
10、 根据权利要求1所述的脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片的制备方法， 其特征在于所述的步骤(5 )对其C3补体的抗体进行CY3标记。
11、 根据权利要求1所述的脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片的制备方法， 其特征在于所述的步骤(6)脂肪细胞分化代谢产物单克隆抗体微阵列点样 一张芯片点45个点，检测范围0.01-10 ng/ml。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，特别是指一种脂肪细胞分化代谢产物抗体芯片的制备方法。其中细胞融合、筛选单克隆细胞系、单克隆抗体特异性筛选、单克隆抗体纯化保存、补体C3抗体的标记、单克隆抗体的矩阵点样、芯片的杂交等工艺步骤，解决了传统技术存在的费时、费力、结果重复性差等技术问题。此芯片可直接应用于医疗及科研机构对心脑血管疾病、动脉硬化等疾病进行检测和预防的研究，在临床诊断领域中具有极高的应用价值，单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。目前国外几乎所有的医疗机构都不同程度地采用了生物芯片技术来进行疾病的诊断和预防。用芯片技术进行大众人群的体检和临床诊断具有省时、省力、简便、快速的特点，是现代社会发展的趋势。
文档编号G01N33/577GK101634657SQ20091013424
公开日2010年1月27日 申请日期2009年4月14日 优先权日2009年4月14日
发明者锐 张, 彬 李 申请人:李 彬;张 锐