专利名称：一种检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种牛型结核分枝杆菌抗体的检测试纸及其制备方法，特别是涉及
一种检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸及其制备方法。
背景技术：
自从1882年Kock发现结核分枝杆菌以来，已报道的分枝杆菌有100多种。有 关分枝杆菌的分类有很多，国际上通常将分枝杆菌分为典型结核分枝杆菌(tuberculosis mycobacterium， TM)，禾口非结核分枝杆菌(non-tuberculosis mycobacterium， NTM)。 TM 包括人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲结核分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，又称 为结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)，该群中DNA相关 性约为85% 100%，分类地位相近；NTM指MTBC和麻风分枝杆菌以外的所有其它分 枝杆菌。 结核是由MTBC中细菌引起的人畜共患传染病，近年来全球发病率逐年上升， 特别是近年来发现由牛结核分枝杆菌引起的人类结核已成为值得关注的公共卫生问题。 研究表明，结核病牛可通过痰液、乳汁、粪便等向外排出结核杆菌污染环境，因此，动 物检疫是控制结核病的重要环节。 牛结核病抗体检测的方法很多，例如ELISA和免疫传感器技术等。但在实践 中，这些方法的使用暴露出一些共同的劣势，例如实验必须在专门的实验室中进行； 需要电源和特殊的仪器；操作人员必须经过专门培训；实验系统不容易标准化，不容 易在基层推广，为使结果可信，需要进行多次预试验和设立多项对照；试验操作步骤繁 琐，至少需要2小时以上。 表面脂蛋白83(cell surface lipoprotein MPB83, MPB83)和主要分泌性免疫蛋白 70(major secreted immunogenic protein mpb70， MPB70)是牛分枝杆菌主要的特异性分泌抗 原，并可在其中高水平表达(如MPB70可占牛结核分枝杆菌培养滤液蛋白的10X)，而在 人型结核分枝杆菌H37Rv株中仅有少量产生，至今尚未证明MPB83在结核分枝杆菌复合 群以外的分枝杆菌中存在。因此，MPB83和MPB70具有显著的种特异性。
MPB70编码基因大小约583bp，蛋白分子量约为22KDa，是感染动物体内T细 胞识别的一种血清优势抗原，BCG接种牛的T细胞不识别MPB70。 MPB83编码基因大 小约603bp，蛋白分子量约为30KDa，是牛分枝杆菌的免疫主导蛋白，也是牛结核菌素的 有效成分，能诱导很强的迟发型变态反应，剌激T淋巴细胞增殖和抗体产生。MPB70和 MPB83的氨基酸序列具有61%的同源性，单克隆抗体验证了二者具有某些共同的抗原决 定簇。但与MPB70不同的是，MPB83是牛分枝杆菌表面相关性脂蛋白，其基因片段中 含有一段典型的脂蛋白序列，并且在N端插有5个独特的氨基酸(Behr MR.et al.Mutations in Mycobacterium tuberculosis Rv0444c， the gene encoding anti-SigK， explain high level expression of MPB70 and MPB83 in Mycobacterium bovis[J].Mol microbia12006， 62(5):
41251-1263.)。 6Kda早期分泌性蛋白(6kDa early secretory antigenic target, ESXA)禾P 10Kda培 养滤液蛋白(lOkDa culture filtrate antigen, ESXB)是近几年研究较多的两种结核分枝杆 菌蛋白抗原，是存在于致病性结核分枝杆菌培养滤液中的早期分泌蛋白，均由BCG缺 失的基因片段(RD1)所编码(Van pinxteren， Laurens A.H， et al.Diagnosis of Tuberculosis Based on the Two Specifi c Antigens ESAT-6and ESXB[J].Clinical and diagnostic laboratory immunology, 2000， 7(2): 155-160)，序列有25%的同源性，诱导强烈的T淋巴细胞增殖 活化和细胞因子分泌。 免疫胶体金技术是近年来迅速发展的快速检测技术，该技术与其它方法比较， 优势在于检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按 照说明书即可操作，并可迅速观察结果，很适合突发事件现场和基层使用。
目前，将胶体金免疫层析技术用于体外检测牛结核分枝杆菌在国内尚属空白。 美国CHEMBIO DIAGNOSTICS公司应用ESXA、 ESXB和MBP83混合抗原研制了一种体 外免疫胶体金诊断试剂产品——PrimaTB STAT-PAK，本发明将MPB83、 MPB70、 ESXA 和ESXB配比混合作为检测抗原尚属首次，具有高特异性和高敏感性。
发明内容
本发明目的是提供一种检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸 (Immuno-Chromatographic Assay, ICA)。 为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案 一种检测牛型结核分枝杆菌 抗体的免疫层析试纸(ICA试纸)，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫一端的含有金黄 色葡萄球菌蛋白A(SPA)标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝
酸纤维膜(NC膜)和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维膜包被有
相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有牛型结核分枝杆菌重组MPB70、 MPB83、 ESXA和ESXB，所述质控线含有能与所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体。
所述检测包被抗原来自本发明的发明人对牛型结核分枝杆菌MPB70、 MPB83、 ESXA和ESXB四种蛋白进行的分别克隆表达，优选为MPB70、 MPB83、 ESXA和ESXB 四种蛋白的混合配比抗原；所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异性抗体为以金黄色葡萄球 菌蛋白A为抗原免疫动物得到的抗体，所述免疫动物的选择是多种多样的，如羊、兔、 猴、鸡或鼠等常用的免疫动物；所述检测线含有MPB70的浓度为l-3mg/mL、 MPB83的 浓度为l-3mg/mL、 ESXA和ESXB的浓度为l-3mg/mL，其中ESXA和ESXB的抗原比例 为l : 1-1 : 1.8，所述质控线含有的能与金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体的浓度 可为3-5mg/mL。 所述吸水垫和样品垫均由吸水材料制备。 检测样品时可将上述检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的样品垫直接 浸于样品中；为使使用更加方便，所述检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的背 面还紧密连接一背板，背板材料的选择是多种多样的，如塑料、树脂或聚氯乙烯板(PVC 板)等，再将该带有背板的免疫层析试纸装入试剂盒中，该试剂盒对应于样品垫的部位设 有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
本发明的第二个目的是提供一种制备上述检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层 析试纸的方法。 本发明所提供的制备上述检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的方法， 包括以下步骤 1)制备牛型结核分枝杆菌MPB70、 MPB83、 ESXA和ESXB抗原，将牛型结核 分枝杆菌MPB70、 MPB83、 ESXA和ESXB抗原配比混合溶液喷到纤维素膜上形成检测 线，将能与金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体溶液喷到所述纤维膜的另一区域形成 质控线，然后将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离所述测试带的一端；
2)制备金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针溶液，将玻璃纤维膜或聚 脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，得到金标垫，将其粘贴在步骤l)得到的纤维素膜的靠 近所述检测线的一端； 3)将在步骤2)中得到的金标垫上远离所述检测线的一端粘贴样品垫，得到检测 检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸。 在上述检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的制备方法中，步骤1)中所 述检测包被抗原来自本发明的发明人对牛型结核分枝杆菌MPB70、 MPB83、 ESXA和 ESXB四种蛋白进行的分别克隆表达，优选为MPB70、 MPB83、 ESXA和ESXB四种 蛋白的混合配比抗原；所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异性抗体为以金黄色葡萄球菌蛋白 A为抗原免疫动物得到的抗体，所述免疫动物的选择是多种多样的，如羊、兔、猴、鸡 或鼠等常用的免疫动物；所述检测线含有MPB70的浓度为l-3mg/mL、 MPB83的浓度 为l-3mg/mL、 ESXA和ESXB的浓度为l-3mg/mL，其中ESXA和ESXB的抗原比例为 1:1-1: 1.8，所述质控线含有的能与金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体的浓度可 为3-5mg/mL。所述步骤1)中的MPB70、 MPB83、 ESXA禾P ESXB四种蛋白的混合配比抗原可
按下述方法制备 1)扩增序列1的基因； 2)将目的片段与表达载体相连转入大肠杆菌； 3)筛选阳性克隆； 4)诱导表达得到目的蛋白。 所述步骤1)中的干燥温度可为30-45°C，优选为37t:，干燥时间可为2.5-3.5小 时。 步骤2)中牛型结核分枝杆菌抗原特异性抗体标记的免疫胶体金探针溶液的制备 方法可包括以下步骤 A.将HAuCl4配制成0.01X水溶液，取100mL加热至沸，搅动下准确加入1.6mL 的1 %柠檬酸三钠(Na3C6H507 2H20)水溶液，继续加热煮沸(优选为10-12分钟)，直到 液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液，冷却后用水恢复至原体积；
B.将步骤1)获得的胶体金溶液的pH值调至8.5-9.5，每lOOmL胶体金溶液加入 终浓度为12yg/mL的金黄色葡萄球菌蛋白A，搅拌25-35分钟，加入5mL10^BSA，搅 拌20-30分钟，再加入lmL 10% PEG20000，搅拌20-30分钟，先在20,000-23,500rpm下 离心25-35分钟，弃上清，用0.05-0.1M的四硼酸钠溶液洗涤沉淀，并将其保存于8-10mL
60.05-0.1M的四硼酸钠溶液中，得到嗜金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针溶液。
在上述金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针溶液的制备方法中，可 用K2C03溶液或HC1溶液调pH值为8.5-9.5，所述调节pH值的K2C03溶液的浓度可为 0.15-0.25M，优选为0.2M;所述调节pH值HC1溶液的浓度可为0.08-0.12mol/L，优选为 0.1mol/L。为弥补因加热蒸发损失的水分，可用水将胶体金溶液恢复至原体积。
为使金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针与玻璃纤维膜或聚脂膜更 好地结合，可向步骤2)中的金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针溶液中添加 0.05-0.1g/mL蔗糖；为使金标垫更易与纤维素膜粘贴，可将金标垫在-2(TC至-5(TC冷冻 10-12小时，并将其冷冻抽干后，再与纤维素膜粘贴。
所述吸水垫和样品垫均由吸水材料制备。 检测样品时可将上述检测牛型结核分枝杆菌抗原的免疫层析试纸的样品垫直接 浸于样品中；为使使用更加方便，所述检测牛型结核分枝杆菌抗原的免疫层析试纸的背 面还紧密连接一背板，背板材料的选择是多种多样的，如塑料、树脂或聚氯乙烯板(PVC 板)等，再将该带有背板的免疫层析试纸装入试剂盒中，该试剂盒对应于样品垫的部位设 有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。 在实际应用中，所述纤维素膜可为硝酸纤维素膜(NC膜)或醋酸纤维素膜，宽度 控制在2.5-3.0mm为宜；所述吸水垫可为吸水纸，宽度为20-40mm，厚度为0.1-0.2mm ; 所述金标垫的宽度为5-10mm ;所述样品垫为玻璃纤维膜，宽度为20-40mm。
本发明提供了一种检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸及其制备方法。 该试纸利用了免疫胶体金技术及双抗夹心检测法，用其检测牛型结核分枝杆菌抗体的基 本原理是用牛型结核分枝杆菌抗原包被纤维素膜，用以捕捉标本中的结核分枝杆菌抗 体，然后用标记了金黄色葡萄球菌蛋白A的免疫胶体金探针进行检测。本发明的免疫 层析试纸具有以下优点l)敏感性及特异性高实验室考核结果显示，本发明的免疫层 析试纸可用于检测牛型结核分枝杆菌血清标本，并且不与其它生物发生交叉反应；2)检 测方法简单、快速检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技 术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，标本中的牛结核分枝杆菌抗体经过约 5分钟的纸层析后，即可出现肉眼可见的沉淀线，从而为牛结核病的诊断隔离争取了时 间，很适合突发事件现场和基层使用；3)制备方法简单，成本低廉，易于进行工业化生 产。本发明将在牛型结核分枝杆菌抗体的检测及其相关疾病的诊断和治疗中发挥重要作 用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的正面和纵截面结构示意图
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法；所述百分含量如无特别说
明均为质量/体积百分含量或体积/体积百分含量。
材料
硝酸纤维膜(NC膜)、样品垫和吸水滤纸，购自Millipore公司。
塑料背板，购自北京燕华公司。 实施例l、牛型结核分枝杆菌MPB70、 MPB83、 ESXA和ESXB的制备 1、利用PCR方法对MPB70全DNA进行扩增，其引物是 1:5' -CGCGGATCCATGAAGGTAAAGAACACAATTGC-3'; 2:5' -CCCAAGCTTTTACGGAGGCATTAGCACGCTGT-3'。 利用PCR方法对MPB83全DNA进行扩增，其引物是 1:5' -CGCGGATCCATGATCAACGTTCAGGCAAACC-3'; 2:5' -CCCAAGCTTTTACAGCACCGTATCGATCATG-3'。 利用PCR方法对ESXA全DNA进行扩增，其引物是 1:5' -CGCGGATCCATGACCATCAACTATCAATTCGG-3'; 2:5' -CCCAAGCTTTTAGGCCCAGCTGGAGCCGAC-3'。 利用PCR方法对ESXB全DNA进行扩增，其引物是 1:5' -GGATCCATGGCAGAGATGAAGACCG-3'; 2:5' -AAGCTTTCAGAAGCCCATTTGCGAGG-3'。 以上引物均弓I入BamHI和HindIII酶切序列 2、将目的片段从T载体上切下，与经相同酶切的pET32a(+)载体相连，转入表 达型菌体BL21(DE3)中。 3、挑取阳性菌落，菌液和培养液的比例为l : 50，同时加入Amp(l : 1000)， 37°C、 250rpm摇床培养4小时，至菌液0D6。。 = 0.7-0.9，加入IPTG至终浓度lmM，继 续培养5小时，离心集菌。 4、用含30 %蔗糖，50mM Tris-HCl， lmM EDTA pH8.0的溶液重悬，冰浴 30min，离心集菌。 5、用超声缓冲液(50mMNaH2PO4pH7.8， 300mM NaCl)重悬菌体沉淀至适当浓 度，超声破碎60分钟，30秒间歇18秒，超声次数40次，功率35%。
6、 10000rpm离心15分钟，弃上清(需经SDS-PAGE证实不含目的蛋白后再弃 掉)，沉淀即为包涵体。 7、生理盐水重悬沉淀，10000rpm离心15分钟，弃上清(需经SDS-PAGE证实
不含目的蛋白后再弃掉)。 8、生理盐水重悬沉淀8000rpm离心15分钟，弃上清(需经SDS-PAGE证实不含 目的蛋白后再弃掉)。 9、生理盐水重悬沉淀，超声破碎60分钟，10000rpm离心15分钟，弃上清(需 经SDS-PAGE证实不含目的蛋白后再弃掉)。 10、将沉淀用10% Triton x-100重悬，磁力搅拌器搅拌30min， 8000rpm离心15
分钟，弃上清(需经SDS-PAGE证实不含目的蛋白后再弃掉)。 11、用含8M尿素的缓冲液(NaH2PO4 0.1M， Tris-HCl pH8.0， O.OIM)溶解沉淀。
12、 12000rpm离心15分钟，上清即为含重组蛋白的缓冲液，置含6M尿素的复 性液(100mMTris-HCl， 2mM EDTA pH8.0， 0.2M盐酸精氨酸，0.004M氧化型谷胱甘肽， 0.002M还原型谷胱甘肽)中透析4小时以上。
8
13、转置含4M尿素的复性液中透析4小时以上。
14、转置含2M尿素的复性液中透析4小时以上。
15、转置含1M尿素的复性液中透析4小时以上。
16、转置蒸馏水中中透析4小时以上。 17、获得复性的牛型结核分枝杆菌重组MPB70、 MPB83、 ESXA禾PESXB。
二、制备免疫胶体金探针
1、制备胶体金溶液采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，具体方法为将HAuCl4(购自Sigma公 司，lg/瓶包装)配制成0.01^水溶液，取100mL加热至沸腾，搅动下准确加入1.6mL的 1 %柠檬酸三钠(Na3C6H507.2H20)水溶液，液体颜色稳定成葡萄酒红色，即得到胶体金溶 液。冷却后用蒸馏水恢复至原体积，制成颗粒直径为25nm的胶体金颗粒。
2、确定胶体金偶联抗体饱和浓度 用0.2MK2CO3(或0.1MHCl)调节胶体金溶液pH 8.5-9.5，准备4支洁净试管，分 别加入lmL胶体金溶液。将金黄色葡萄球菌蛋白A(购于Amersham Pharmacia Biotech公 司)稀释为lmg/mL，分别向3支试管中加入5iU、 10iU、 15iU，另一支为对照，混匀后 于室温下放置5分钟，加入10XNaCl水溶液，混匀，静置10-20分钟后观察液体颜色。 胶体金溶液颜色不变时所含最少抗体量，即为稳定lmL胶体金所需抗体的最适浓度，以 此为基础增加20%抗体量，即为胶体金偶联抗体饱和浓度。结果表明维持胶体金溶液 颜色不变的抗体量为10 y 1，即10 ii g/mL，选择偶联抗体浓度为12 ii g/mL。
3、金标垫的制备 按上述方法配制含有浓度为12 ii g/mL的金黄色葡萄球菌蛋白A免疫胶体金探针 溶液50mL，搅拌30分钟(25-35分钟均可)，加lmL 10% PEG20000，搅拌25分钟(20-30 分钟均可)，20,000 23,500rpm离心25-30分钟，弃上清，将沉淀用四硼酸钠洗涤1次后 用四硼酸钠保存液收集沉淀5mL。取金标探针5mL加入0.5g蔗糖，充分溶解后均匀加在 玻璃纤维膜上，-35°C (-20。C -S(TC均可)放置11小时(10-12小时均可)，冻干机抽干， 得到金标垫。 三、牛型结核分枝杆菌抗体快速检测试纸的制备 如图1所示，本发明检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸由吸水垫4、硝 酸纤维膜3、金标垫2和玻璃纤维膜样品垫1四部分组成；硝酸纤维膜3上包被有检测线 5和质控线6。该试纸的制备方法包括以下步骤
1)NC膜3的包被用0.01M、 pH7.2的PB缓冲液(NaH2P(V2H2O0.39g， Na2HP04 1.07g，去离子水 1000mL)稀释MPB70、 MPB83、 ESXA和ESXB抗原，将经稀释的四种抗原溶液混合， 至每毫升溶液中MPB70、 MPB83、 ESXA和ESXB抗原的含量分别为2mg、 lmg、 3mg、 2.5mg，用于包被检测线。用0.01M pH 7.2PBS(NaH2P04 2H20 0.39g， Na2HP04 1.07g， NaC18.5g，去离子水lOOOmL)稀释羊抗人IgG(用人的IgG免疫羊获得，具体制备方法见
《免疫化学研究进展》，李成文著，中国科学技术出版社，1993年)至浓度为4mg/mL， 用于包被质控线。用BIODOT公司XYZ3000喷膜机分别喷于2.5mm厚的硝酸纤维素膜 (购自Millipore公司)上，形成相互分离的检测线5和质控线6， 37。C干燥3h(2.5-3.5h均可)。 2)牛型结核分枝杆菌抗体快速检测试纸的制备 将吸水垫4用双面胶粘贴在包被的硝酸纤维膜3的一端；将包被的NC膜3用双 面胶粘贴在步骤2中制备的金标垫2的一端；在金标垫2上用双面胶粘贴玻璃纤维膜样品 垫l;再最后将它们用双面胶粘贴在塑料背板上，按所需大小切割，即为检测牛型结核 分枝杆菌抗体的免疫层析试纸，加干燥剂后密封保存。
四、检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试剂盒的制备 为了方便使用，将步骤三制备的牛型结核分枝杆菌抗体快速检测的免疫层析试 纸的下面再紧密连接一塑料背板，再将该带有背板的试纸装入试剂盒中，加干燥剂后密 封保存。该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于对照带和测试带的部位设有 五、牛型结核分枝杆菌快速检测试纸的使用方法和原理 测定时将试纸条样品垫l浸入液体标本中，样品垫l即吸取液体向上端移动，流 经金标垫2时使干片上的免疫金复合物溶液，并带动其向硝酸纤维膜3渗移。若标本中 有待测特异抗体，其可与免疫金复合物的抗体结合，此抗原抗体复合物流至检测线5即 被固相抗原所获，在膜上显出红色反应线条。过剩的免疫金复合物继续前行，至质控线6 与固相羊抗人IgG结合，而显出红色质控线条。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显 示质控线条。 实施例2、牛型结核分枝杆菌抗体的检测及与其它相关细菌血清样品的交叉试验
—、其它相关细菌血清样品的交叉试验 用购自军事医学科学院微生物流行病研究所微生物检验研究中心的大肠埃希氏 菌(保藏号270014)、沙门氏菌(保藏号460046)、痢疾志贺氏菌(保藏号51258)、绿脓假 单胞菌(保藏号10101)、鼠疫菌(保藏号410050)、布鲁氏菌(保藏号55227)、金黄色葡萄 球菌(保藏号26067)的抗血清样品作为样品检测液备用，以牛型结核分枝杆菌抗血清检测 液为对照。 结果报告以血清效价l : 40以上为阳性诊断标准，仅于质控观测窗口 "C"(质控线)处出现l条红色沉淀线(对照)，为与嗜肺军团菌无交叉反应；于检测观 测窗口 "T"(检测线)和质控观测窗口 "C"(质控线)处出现2条红色沉淀线(样品和 对照)，为与嗜肺军团菌有交叉反应；如质控观测窗口 "C"(质控线)处未出现红色沉淀 线，则说明检测试纸失效，此时无论检测观测窗口 "T"(检测线)处是否出现沉淀线， 检测结果不成立。 用实施例1制备的包被牛型结核分枝杆菌MPB70、 MPB83、 ESXA和ESXB抗
原和羊抗人IgG的免疫层析试纸对上述抗血清样品进行检测，结果对照为阳性，其它检 测样品为阴性，证明本发明的免疫层析试纸可用于牛型结核分枝杆菌抗体的快速检测， 特异性高。 实施例3、实验室考核
1、样品制备 将购自军事医学科学院微生物流行病研究所微生物检验研究中心的嗜肺军团 菌1-10型、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、绿脓假单胞菌、鼠疫菌、布鲁氏
10菌、金黄色葡萄球菌的抗血清样品用生理盐水按l : 40比例稀释后作为样品检测液备 用。 2、实验方法 取实施例1制备的装有本发明检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的试 剂盒，分别于点样口中加入上述样品检测液3滴(约150ul)， 2分钟后开始观察结果，15 分钟观察终止。 结果报告仅于质控观测窗口 "C"(质控线)处出现l条红色沉淀线为阴 性，即无牛型结核分枝杆菌抗体检出；于检测观测窗口 "T"(检测线)和质控观测窗口 "C"(质控线)处出现2条红色沉淀线为阳性，即有牛型结核分枝杆菌抗体检出；如质 控观测窗口 "C"(质控线)处未出现红色沉淀线，则说明检测试纸失效，此时无论检测 观测窗口 "T"(检测线)处是否出现沉淀线，检测结果不成立。
3、实验结果 本发明的检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的实验室考核结果如表l 所示，由表l可以看出，本发明的检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸可以检出 牛型结核分枝杆菌抗体，且不与大肠埃希氏菌、沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、绿脓假单胞 菌、鼠疫菌、布鲁氏菌、金黄色葡萄球菌发生交叉反应。上述检测结果证明本发明的免 疫层析试纸可用于牛型结核分枝杆菌抗体的快速检测，并具有较高的灵敏度及特异性。
表1本发明检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸(胶体金法)的实验室考
核结果
细菌株号血清型样品稀释度i : 40
牛型结核分枝杆菌C70-8+
大肠埃希氏菌270014-
沙门氏菌460046-
痢疾志贺氏菌51258—
绿脓假单胞菌10101-
鼠疫菌410050-
布鲁氏菌55227-
金黄色葡萄球菌26067- 序列表
<160>8
<210>1
11
<211>582 <212>DNA <213>牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovisAF2122/97) <400>1 atgaaggtaa agaacacaat tgcggcaacc agtttcgcgg cggccggcct ggcggctctg 60 gcggtggctg tctcaccgcc ggcggccgca ggcgatctgg tgggcccggg ctgcgcggaa 120 仏CgCggC昭CC础CCC3C tgggccggcc tcggtgc昭g g础gtcgra ggacccggtc 180 gcggtggcgg cctcgaacaa tccggagttg acaacgctga cggctgcact gtcgggccag 240 ctcaatccgc aagtaaacct ggtggacacc ctcaacagcg gtcagtacac ggtgttcgca 300 ccgacc^cg cggrattog c鄉ctgccg gratcracga tcgacg昭ct c^g3cc础 360 tcgtcactgc tgaccagcat cctgacctac cacgtagtgg ccggccaaac cagcccggcc 420 aacgtcgtcg gcacccgtca gaccctccag ggcgccagcg tgacggtgac cggtcagggt 480 aacagcctca aggtcggtaa cgccgacgtc gtctgtggtg gggtgtctac cgccaacgcg 540 acggtgtaca tgattgacag cgtgctaatg cctccggcgt 582 <210>2 <211>603 <212>DNA <213>牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovisAF2122/97) <400>1 啤atc^cg ttc昭gcc^ 3CCggCCgC3 gc昭cg昭cc tcgc昭crat cgcgattgcg 60 ttctogcgg gttgttcg昭racra^ccc gtgtcgc鄉aracc昭ccc ga^ccggcg 120 acragcccgg cggcgcccgt lacracggcg gra吨gctg 3CCCCgC昭C ggacctgatt 180 ggtcgtgggt gcgcgcaata cgcggcgcaa aatcccaccg gtcccggatc ggtggccgga 240 啤gcgc鄉acccggtcgc laccgcggct tcc^c^cc cg啤ctc昭laccctgacc 300 tcggctctgt cgggc鄉ct g^cccggat gtg础ctgg tcgacaccct c^cggcggc 360 g敏araccg ttttcgcccc racc^cgcc grattcgara昭ctgccggc ggcraclatc 420 gatcaactca agactgacgc caagctgctc agcagcatcc tgacctacca cgtgatagcc 480 ggccaggcga gtccgagcag gatcgacggc acccatcaga ccctgcaagg tgccgacctg 540 acggtgatag gcgcccgcga cgacctcatg gtcaacaacg ccggtttggt atgtggcgga 600 gttcacaccg ccaacgcgac ggtgtacatg atcgatacgg tgctgatgcc cccggcacag 660 taa 663 <210>3 <211>288 <212>DNA <213>牛型结核分枝杆 (Mycobacterium bovisAF2122/97) <400>1 atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga 60 aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca 120 gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc 180
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20 25 30 Gly Asp Leu Val Gly Pro Gly Cys Ala Glu Tyr Ala Ala Ala Asn
35 40 45 Pro Thr Gly Pro Ala Ser Val Gin Gly Met Ser Gin Asp Pro Val
50 55 60 Ala Val Ala Ala Ser Asn Asn Pro Glu Leu Thr Thr Leu Thr Ala
65 70 75 Ala Leu Ser Gly Gin Leu Asn Pro Gin Val Asn Leu Val Asp Thr
80 85 90 Leu Asn Ser Gly Gin Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Ala Ala
95 100 105 Phe Ser Lys Leu Pro Ala Ser Thr lie Asp Glu Leu Lys Thr Asn
110 115 120 Ser Ser Leu Leu Thr Ser lie Leu Thr Tyr His Val Val Ala Gly
125 130 135 Gin Thr Ser Pro Ala Asn Val Val Gly Thr Arg Gin Thr Leu Gin
140 145 150
240 288
60 120 180 240 300 303:0184] Gly Ala Ser Val Thr Val Thr Gly Gin Gly Asn Ser Leu Lys Val :0185] 155 160 165
:0186] Gly Asn Ala Asp Val Val Cys Gly Gly Val Ser Thr Ala Asn Ala :0187] 170 175 180
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:0193] <213>牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovisAF2122/97)
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:0198] Val Ser Gin Asp Thr Ser Pro Lys Pro Ala Thr Ser Pro Ala Ala :0199] 35 40 45
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14
lie Asp Thr Val Leu Met Pro Pro Ala Gin
215 220 <210>7 <211>95 <212>PRT <213>牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis AF2122/97) Met Thr Glu Gin Gin Trp Asn Phe Ala Gly lie Glu Ala Ala Ala 15 10 15 Ser Ala lie Gin Gly Asn Val Thr Ser lie His Ser Leu Leu Asp
20 25 30 Glu Gly Lys Gin Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly
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95 <210>8 <211>100 <212>PRT <213>牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis AF2122/97) Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gin Glu Ala 15 10 15 Gly Asn Phe Glu Arg lie Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gin lie Asp
20 25 30 Gin Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gin Gly Gin Trp Arg Gly
35 40 45 Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gin Ala Ala Val Val Arg Phe Gin Glu
50 55 60 Ala Ala Asn Lys Gin Lys Gin Glu Leu Asp Glu lie Ser Thr Asn
65 70 75 lie Arg Gin Ala Gly Val Gin Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gin
80 85 90 Gin Gin Ala Leu Ser Ser Gin Met Gly Phe
95 100
1权利要求
一种检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫一端的含有金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有结核分枝杆菌抗原，所述质控线含有能与所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体。
2. 根据权利要求1所述的检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸，其特征在于 所述检测包被抗原来自本发明的发明人对牛型结核分枝杆菌MPB70、 MPB83、 ESXA和 ESXB四种蛋白进行的分别克隆表达，优选为MPB70、 MPB83、 ESXA和ESXB四种 蛋白的混合配比抗原；所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异性抗体为以金黄色葡萄球菌蛋白 A为抗原免疫动物得到的抗体，所述免疫动物的选择是多种多样的，如羊、兔、猴、鸡 或鼠等常用的免疫动物；所述检测线含有MPB70的浓度为l-3mg/mL、 MPB83的浓度 为l-3mg/mL、 ESXA和ESXB的浓度为l-3mg/mL，其中ESXA和ESXB的抗原比例为 1:1-1: 1.8，所述质控线含有的能与金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体的浓度可 为3-5mg/mL。
3. 根据权利要求2所述的检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸，其特征在于所述结核分枝杆菌抗原为MPB70、 MPB83、 ESXA和ESXB四种蛋白的混合配比抗原
4. 根据权利要求1所述的检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸，其特征在于 所述检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的背面紧密连接一背板。
5. —种制备权利要求1所述的检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的方法，包 括以下步骤A. 制备牛型结核分枝杆菌抗原，将结核分枝杆菌抗原溶液喷到纤维素膜上形成检测 线，将能与金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体溶液喷到所述纤维膜的另一区域形成 质控线，然后将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离所述测试带的一端；B. 制备金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针溶液，将玻璃纤维膜或聚脂膜 浸入该免疫胶体金探针溶液，得到金标垫，将其粘贴在步骤l)得到的纤维素膜的靠近所 述检测线的一端；C. 将在步骤2)中得到的金标垫上远离所述检测线的一端粘贴样品垫，得到检测牛型 结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤1)所述检测包被抗原来 自本发明的发明人对牛型结核分枝杆菌MPB70、 MPB83、 ESXA和ESXB四种蛋白进行 的分别克隆表达，优选为MPB70、 MPB83、 ESXA和ESXB四种蛋白的混合配比抗原； 所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异性抗体为以金黄色葡萄球菌蛋白A为抗原免疫动物得 到的抗体，所述免疫动物的选择是多种多样的，如羊、兔、猴、鸡或鼠等常用的免疫动 物；所述检测线含有MPB70的浓度为l-3mg/mL、 MPB83的浓度为l-3mg/mL、 ESXA和 ESXB的浓度为l-3mg/mL，其中ESXA和ESXB的抗原比例为1 : 1-1 : 1.8，所述质控 线含有的能与金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体的浓度可为3-5mg/mL。
7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤l)中的干燥温度为 30-45°C，干燥时间为2.5-3.5小时；步骤2)中牛型结核分枝杆菌抗原特异性抗体标记的免 疫胶体金探针溶液的制备方法包括以下步骤A. 将HAuCl4配制成0.01 %水溶液，取lOOmL加热至沸，搅动下准确加入1.6mL的 1 %柠檬酸三钠(Na3C6H507 2H20)水溶液，继续加热煮沸(优选为10-12分钟)，直到液 体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液，冷却后用水恢复至原体积；B. 将步骤1)获得的胶体金溶液的pH值调至8.5-9.5，每lOOmL胶体金溶液加入终浓 度为12 ii g/mL的金黄色葡萄球菌蛋白A，搅拌25-35分钟，加入5mL 10% BSA，搅拌 20-30分钟，再加入lmL 10% PEG20000，搅拌20-30分钟，先在20,000-23,500rpm下离 心25-35分钟，弃上清，用0.05-0.1M的四硼酸钠溶液洗涤沉淀，并将其保存于8-10mL 0.05-0.1M的四硼酸钠溶液中，得到金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针溶液。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于在所述金黄色葡萄球菌蛋白A标 记的免疫胶体金探针溶液的制备方法中，用K2C03溶液或HC1溶液调pH值为8.5-9.5， 所述调节pH值的K2C03溶液的浓度为0.15-0.25M ;所述调节pH值HC1溶液的浓度为 0.08-0.12mol/L。
9. 根据权利要求5-8任一项所述的检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸的制备 方法，其特征在于向所述步骤2)中的牛型结核分枝杆菌抗原特异性抗体标记的免疫胶 体金探针溶液中添加0.05-0.lg/mL蔗糖；将金标垫在-2(TC至-5(TC冷冻10-12小时，并将 其冷冻抽干后，再与纤维素膜粘贴；在所述步骤3)获得的检测牛型结核分枝杆菌抗体的 免疫层析试纸的背面紧密粘贴一背板；所述纤维素膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜； 所述吸水垫为吸水纸；所述样品垫为玻璃纤维膜。
全文摘要
本发明公开了一种检测牛型结核分枝杆菌抗体的免疫层析试纸及其制备方法。该试纸包括样品垫、紧密连接于所述样品垫一端的含有金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有牛型结核分枝杆菌抗原，所述质控线含有能与所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体。本发明的免疫层析试纸具有简便性、敏感性、特异性和快速性的优点，适于临床和现场使用。
文档编号G01N33/558GK101692089SQ20091017745
公开日2010年4月7日 申请日期2009年9月29日 优先权日2009年9月29日
发明者何君, 朱虹, 李岩伟, 檀华, 端青, 赵海 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所