专利名称：免疫学测定法、试剂盒及展开溶剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学测定法，免疫学测定用试剂盒以及用于所述测定法和试剂盒的 免疫层析用试验片和展开溶剂。
背景技术：
在根据免疫学测定法测定被检物(如血液中的被检物)的情况中，存在下列问题 血液中的红细胞等将细胞分离基质的细孔堵塞使携带了抗体等的乳胶粒子或金属胶体粒 子等不溶性载体不易流出，或者因为红细胞的溶血妨碍染料判定，或者血红蛋白容易引起 非特异性反应等。为了解决这个问题，在特开2006-177970号公报中公开有，令免疫层析用试验片 的多孔性分离基质的细胞分离结构中持有特征，或令所述多孔性分离基质中含浸有甘露 醇。但是，关联提案中没能避免将免疫层析用试验片的结构复杂化，并且很难说溶血的问题 得到了完全解决。虽然多孔性分离基质中含浸的甘露醇例如已知根据其可被用作MAP液成 分，而具有防止红细胞溶血作用，但如果在免疫学测定法中使用足以防止溶血的浓度，可以 说就会发生被检物的检测时间变长和易引起非特异性反应的新问题。
发明内容
本发明的目的是，因为所述原因，提供在短检测时间且可抑制非特异性反应的免 疫学测定法。本发明的其它目的是提供了通过使血液中的被检物在测定系统内与甘露醇及表 面活性剂共存，从而可在防止溶血反应同时以短检测时间抑制非特异性反应而检测的免疫 学测定方法。本发明又一目的是，提供用于所述测定法的试剂盒以及免疫层析用试验片和展开 溶剂。本发明更多目的及优点将由以下说明来明晰。根据本发明，本发明的所述目的及优点第一通过免疫学测定方法达成，所述免疫 学测定方法的特征在于，是用免疫层析用试验片免疫学测定被检物的方法，所述免疫层析用试验片包含 固定有与被检物特异性结合的第1抗体或第1抗原的膜载体、 固定有与被检物特异性结合的第2抗体或第2抗原的不溶性载体、及 可分离细胞的多孔性分离基质，其中， 将所述多孔性分离基质用表面活性剂预先浸润，然后 将通过所述第2抗体或第2抗原与所述被检物特异性结合的所述不溶性载体用 含甘露醇的展开溶剂展开。根据本发明，本发明的所述目的及优点第二通过免疫学测定方法达成，所述免疫学测定方法的特征在于，是用免疫层析用试验片免疫学测定被检物的方法，所述免疫层析用试验片包含 固定有与被检物特异性结合的第1抗体或第1抗原的膜载体、 固定有与被检物特异性结合的第2抗体或第2抗原的不溶性载体、及 可分离细胞的多孔性分离基质，其中，将通过所述第2抗体或第2抗原与所述被检物特异性结合的所述不溶性载 体用兼含甘露醇和表面活性剂二者的展开溶剂展开。根据本发明，本发明的所述目的及优点第三通过免疫学测定方法达成，所述免疫 学测定方法的特征在于，是用免疫层析用试验片免疫学测定被检物的方法，所述免疫层析用试验片包含 固定有与被检物特异性结合的第1抗体或第1抗原的膜载体、 固定有与被检物特异性结合的第2抗体或第2抗原的不溶性载体、及 可分离细胞的多孔性分离基质，其中， 将所述多孔性分离基质用表面活性剂预先浸润，然后 将通过所述第2抗体或第2抗原与所述被检物特异性结合的所述不溶性载体用 兼含甘露醇和表面活性剂二者的展开溶剂展开。根据本发明，本发明的所述目的及优点第四通过免疫学测定用试剂盒达成，所述 免疫学测定用试剂盒的特征在于包含免疫层析用试验片与含甘露醇的展开溶剂的组合 所述免疫层析用试验片包含■固定有与被检物特异性结合的第1抗体或第1抗原的膜载体、■固定有与被检物特异性结合的第2抗体或第2抗原的不溶性载体、及■用表面活性剂浸润过的可分离细胞的多孔性分离基质； 所述含甘露醇的展开溶剂用于展开通过所述第2抗体或第2抗原与所述被检物 特异性结合的所述不溶性载体。根据本发明，本发明的所述目的及优点第五通过免疫学测定用试剂盒达成，所述 免疫学测定用试剂盒的特征在于包含免疫层析用试验片与兼含甘露醇和表面活性剂二者 的展开溶剂的组合 所述免疫层析用试验片包含■固定有与被检物特异性结合的第1抗体或第1抗原的膜载体、■固定有与被检物特异性结合的第2抗体或第2抗原的不溶性载体、及■可分离细胞的多孔性分离基质； 所述兼含甘露醇和表面活性剂二者的展开溶剂用于展开通过所述第2抗体或 第2抗原与所述被检物特异性结合的所述不溶性载体。根据本发明，本发明的所述目的及优点第六通过免疫学测定用试剂盒达成，所述 免疫学测定用试剂盒的特征在于包含免疫层析用试验片与兼含甘露醇和表面活性剂二者 的展开溶剂的组合 所述免疫层析用试验片包含■固定有与被检物特异性结合的第1抗体或第1抗原的膜载体、
■固定有与被检物特异性结合的第2抗体或第2抗原的不溶性载体、及■用表面活性剂浸润过的可分离细胞的多孔性分离基质； 所述兼含甘露醇和表面活性剂二者的展开溶剂用于展开通过所述第2抗体或 第2抗原与所述被检物特异性结合的所述不溶性载体。本发明的技术特征可以认为是根据在测定系统内甘露醇和表面活性剂的共存而 持有的。根据本发明，本发明的所述目的及优点第七通过以含甘露醇为特征的免疫层析用 展开溶剂达成。本发明的更多目的及优点将从以下说明来明晰。附图简述
图1是免疫层析用试验片的示意图。实施方式能用于本发明的免疫学测定方法的表面活性剂，只要是作为生物化学用而被使用 的表面活性剂都是可行的。优选HLB为8 20的表面活性剂，更优选可列举HLB为8 20 的非离子性表面活性剂。具体可以举例的有，Triton X_100(商品名)聚乙二醇单-ρ-异 辛基苯基醚，Tween20 聚氧乙烯山梨坦单月桂酸酯，TweenSO 聚氧乙烯山梨坦单油酸酯， Nonidet P-40 =Nonidet P-40，兼性离子 3-14 :n_ 十四烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺 酸酯，CHAPS :3-[(3_胆酰胺基丙基)二甲基铵基]丙磺酸，十二烷基硫酸钠(SDS)等。这 些表面活性剂，能够单独使用或两种以上混合使用。尽管免疫层析的方法众所周知，还是将其原理用图1模式化显示。在图1的样品添加部位1中，滴入作为检查对象的针对被检物的检体的样品。样品添加部位1包含免疫层析用试验片，所述免疫层析用试验片包含可分离细胞 的多孔性分离基质。多孔性分离基质优选在样品滴下前预先用表面活性剂浸润。不特别 限定将多孔性分离基质用表面活性剂浸润的方法，例如可在将该基质浸渍于表面活性剂中 后，使用热干燥方法等。作为在本发明中可作为对象的检体，只要是含细胞或血细胞的检体即可，可例举 血液，尿，骨髓。并且，作为从检体中检测的被检物，可例举HBs抗原等的病毒表面抗原、PSA、 CEA、AFP等的肿瘤标记物、抗HIV抗体、抗HBV抗体、抗HCV抗体、抗螨过敏原抗体，抗杉花 粉过敏原抗体等的免疫球蛋白等，但并不只限于这些。这些检体优选用不破坏细胞或血细 胞的办法来取得。滴入样品添加部位1的样品，经过保持着固定有与被检物特异性结合的抗体或抗 原(分别称为第2抗体，第2抗原)的不溶性载体的标记物保持部位2，通过层析介质3，向 吸收部位5的方向展开。检测部位4固定有与被检物特异性结合的抗体或抗原(分别称为 第1抗体，第1抗原)。用于将被检物在层析介质3中展开且具有检测部位4的载体由膜载 体构成。在本发明中，作为所述层析介质，使用含甘露醇的展开溶剂。甘露醇优选以1 15 重量％的比例含于展开溶剂中。通过使用所述甘露醇浓度的展开溶剂，能够在防止溶血的 同时抑制非特异性反应，从而在短时间内检测被检物。尚不知所述甘露醇浓度的溶剂作为免疫层析用展开溶剂。当检体中混入作为对象的被检物的情况时，被检物与第2抗体或第2抗原发生反 应，它们的复合体在检测部位4被第1抗原或第1抗体捕捉，呈现着色带。根据4中呈现的 带的色调等就可以粗略得知检体中所含被检物的量。在标记物保持部位2中使用的第2抗体或第2抗原，以及在检测部位4中使用的 第1抗原或第1抗体，只要是能与被检物的不同部位结合者即可。作为抗体，可使用与被检物特异性结合的抗体。抗体根据产生其的动物种类有 人、小鼠、大鼠、兔、山羊、马等，各有所定范围的免疫球蛋白。可为IgG、IgM、IgA、IgE、IgD 中的任一种，还可例举单克隆抗体、多克隆抗体，以及它们的片段(具有抗原结合能力的片 段、可为H链、L链、Fab、F(ab，)2等中的任一种。)。具体来说，可例举抗PSA抗体、抗AFP抗体、抗CEA抗体、抗HBs抗体、抗IgG抗体、 抗人IgE抗体等，及它们的片段(具有抗原结合能力的片段、例如F(ab)’ 2或Fab’等中的 任一种。)。其次，作为抗原，可使用与被检物特异性结合的抗原。可例举HBs抗原、HCV抗原、 螨过敏原、杉花粉过敏原等。再次，作为标记抗原或抗体的不溶性载体，可举的例子有金胶体粒子等的金属胶 体粒子，硒胶体粒子等的非金属胶体粒子，乳胶粒子等的着色树脂粒子，染料胶体粒子及着 色核糖体等的不溶性粒状物质等。作为标记抗原或抗体的酶，可例举过氧化物酶、碱性磷 酸酶、葡萄糖氧化酶等。而且，作为用于层析介质的膜载体，只要是能够通过毛细管现象吸收样品检体并 使其流动的膜载体，则没有特殊限定。例如，可选自含硝酸纤维素、乙酸纤维素、尼龙、聚醚 砜、聚乙烯醇、聚酯、玻璃纤维、聚烯烃、纤维素及它们的混合纤维的人工聚合体。如上所述，在本发明方法中所使用的免疫层析用试验片具有如下特征将多孔性 分离基质优选预先使用表面活性剂，更优选用HLB为8 20的表面活性剂来浸润。基于所 述特征，本发明提供了如下免疫层析用试验片，其含 固定有与被检物特异性结合的第1抗体或第1抗原的膜载体、 固定有与被检物特异性结合的第2抗体或第2抗原的不溶性载体、及 用表面活性剂浸润过的可分离细胞的多孔性分离基质。并且，根据本发明，作为用于实施所述本发明方法的试剂盒，同样提供了包含本发 明的所述免疫层析用试验片与以优选1 15重量％浓度含甘露醇的展开溶剂的组合的免 疫学测定试剂盒。而且，用于实施所述发明方法的试剂盒中同样提供了所述免疫学测定法 中所使用的表面活性剂及含甘露醇的展开溶剂的优选范围。实施例以下将根据实施例更进一步详述本发明。本发明不以任何方式受实施例的限定。实施例1 (1)向层析介质上的判定部的制备使用含硝酸纤维素的片(Millipore社制，商品名HF120，300_X 25mm)作为膜载 体(膜)。用含5重量％的异丙醇的磷酸缓冲液(pH7. 4)将抗小鼠源抗前列腺癌特异性抗 原(PSA)单克隆抗体(第1抗体)稀释至1. Omg/mL的浓度。取此溶液150 μ L以Imm的厚
7度涂于膜上，在50°C干燥30分钟。干燥后，在含0.5重量％的酪蛋白(和光纯药工业(株) 制)的磷酸缓冲液(PH7. 4) IOOmL中于室温浸渍30分钟，进行封闭。封闭后，使用含0.05 重量％的1^扰1120的磷酸缓冲液(pH7. 4)洗净，令其在室温下干燥一夜，从而制备了层析介 质(固定有第1抗原的膜载体)。(2)标记物溶液的制备在0. 5ml金胶体分散液(田中贵金属工业(株)制LC40nm)中，加入0. Iml使用 磷酸缓冲液(PH7.4)稀释至0. lmg/m 1浓度的小鼠源抗PSA单克隆抗体(第2抗体)，于室 温静置10分钟。接着，加入0. ImL含10重量％牛血清白蛋白(以下称BSA)的磷酸缓冲液 (pH7. 4)，再于室温静置10分钟。其后，经充分搅拌后，以8，000 X g离心15分钟，除去上清 后，加入了 0. ImL含1重量％ BSA的磷酸缓冲液(pH7. 4)。按照以上顺序制备了标记物溶 液。(3)免疫层析用试验片的制备向所述制备的标记物溶液300 μ L中加入300 μ L、10重量％的海藻糖水溶液和 1. 8mL的蒸馏水，将其均勻添加于15mm X300mm的玻璃纤维盘(Millipore社制)后，使用 真空干燥机干燥，制作了标记保持部件(固定有第2抗体的不溶性载体)。样品盘(多孔性分离基质)中则使用了血细胞分离膜(Pou 1社制 300mmX 30mm) 令此样品盘均勻吸收3mL的含0. 1重量％ Triton (注册商标)X-100 (HLB =13)的20mM的Tris-HCl缓冲液(pH8. 0)后，于40°C中干燥1小时。其次，向垫片构成的基材贴合所述制备的层析介质、标记物保持部件、添加样品部 分使用的所述样品盘、用于吸收展开了的样品和标记物的吸收盘。然后，用剪裁机裁成了 5mm的宽度，作为免疫层析用试验片。(4)展开用溶剂的制备制备向含有1重量％的BSA和150mM的NaCl的HEPES缓冲液(pH8. 0) IOmL中添 加D-甘露醇(和光纯药工业(株)制)至10重量％的物质作为了展开用溶剂。(5)测定使用所述制作的免疫层析用试验片，根据以下方法测定了血液中PSA存在与否。S卩，将血液中PSA浓度未达到0. Ing/mL的阴性检体和PSA浓度为4ng/mL的阳性 检体作为被检体，将25 μ L被检体载于免疫层析用试验片的样品盘上，接着将100 μ L的展 开溶剂载于样品盘上令其展开，15分钟后进行了目测判定。将能确认测试线的红线的作为 “ + ”，能确认红线但颜色非常淡的作为“ 士 ”，不能确认红线的作为“_”，因为溶血而无法测 定的作为“无法判定”。其结果示于表1。另外，溶血的有无示于表2。实施例2 除了将在实施例1中使吸收于样品盘的表面活性剂从Triton(注册商标)Χ-100 变更为Tween20(HLB = 17)以外，使用与实施例1相同的方法进行了测定。结果示于表1。 另外，溶血的有无示于表2。实施例3 除了将在实施例1中使吸收于样品盘的表面活性剂从Triton(注册商标)X-100 变更为7〒1V—>NK-4(HLB = 9)以外，使用与实施例1相同的方法进行了测定。结果 示于表1。另外，溶血的有无示于表2。
权利要求
免疫学测定方法，其特征在于，是用免疫层析用试验片免疫学测定被检物的方法，所述免疫层析用试验片包含●固定有与被检物特异性结合的第1抗体或第1抗原的膜载体、●固定有与被检物特异性结合的第2抗体或第2抗原的不溶性载体、及●可分离细胞的多孔性分离基质，其中，●将所述多孔性分离基质用表面活性剂预先浸润，然后●将通过所述第2抗体或第2抗原与所述被检物特异性结合的所述不溶性载体用含甘露醇的展开溶剂展开。
2.免疫学测定方法，其特征在于，是用免疫层析用试验片免疫学测定被检物的方法， 所述免疫层析用试验片包含 固定有与被检物特异性结合的第1抗体或第1抗原的膜载体、 固定有与被检物特异性结合的第2抗体或第2抗原的不溶性载体、及 可分离细胞的多孔性分离基质，其中，将通过所述第2抗体或第2抗原与所述被检物特异性结合的所述不溶性载体用 兼含甘露醇和表面活性剂二者的展开溶剂展开。
3.免疫学测定方法，其特征在于，是用免疫层析用试验片免疫学测定被检物的方法， 所述免疫层析用试验片包含 固定有与被检物特异性结合的第1抗体或第1抗原的膜载体、 固定有与被检物特异性结合的第2抗体或第2抗原的不溶性载体、及 可分离细胞的多孔性分离基质， 其中，眷将所述多孔性分离基质用表面活性剂预先浸润，然后 将通过所述第2抗体或第2抗原与所述被检物特异性结合的所述不溶性载体用兼含 甘露醇和表面活性剂二者的展开溶剂展开。
4.权利要求1 3中任一项的免疫学测定方法，其中所述表面活性剂的HLB在8 20 的范围内。
5.权利要求1 3中任一项的免疫学测定方法，其中所述展开溶剂以1 15重量％的 浓度含甘露醇。
6.免疫学测定用试剂盒，其特征在于包含免疫层析用试验片与含甘露醇的展开溶剂的 组合 所述免疫层析用试验片包含■固定有与被检物特异性结合的第1抗体或第1抗原的膜载体、 ■固定有与被检物特异性结合的第2抗体或第2抗原的不溶性载体、及 ■用表面活性剂浸润过的可分离细胞的多孔性分离基质； 所述含甘露醇的展开溶剂用于展开通过所述第2抗体或第2抗原与所述被检物特异 性结合的所述不溶性载体。
7.免疫学测定用试剂盒，其特征在于包含免疫层析用试验片与兼含甘露醇和表面活性 剂二者的展开溶剂的组合 所述免疫层析用试验片包含■固定有与被检物特异性结合的第1抗体或第1抗原的膜载体、 ■固定有与被检物特异性结合的第2抗体或第2抗原的不溶性载体、及 ■可分离细胞的多孔性分离基质； 所述兼含甘露醇和表面活性剂二者的展开溶剂用于展开通过所述第2抗体或第2抗 原与所述被检物特异性结合的所述不溶性载体。
8.免疫学测定用试剂盒，其特征在于包含免疫层析用试验片与兼含甘露醇和表面活性 剂二者的展开溶剂的组合 所述免疫层析用试验片包含■固定有与被检物特异性结合的第1抗体或第1抗原的膜载体、 ■固定有与被检物特异性结合的第2抗体或第2抗原的不溶性载体、及 ■用表面活性剂浸润过的可分离细胞的多孔性分离基质； 所述兼含甘露醇和表面活性剂二者的展开溶剂用于展开通过所述第2抗体或第2抗 原与所述被检物特异性结合的所述不溶性载体。
9.权利要求6 8中任一项的免疫学测定用试剂盒，其中所述表面活性剂的HLB在8 20的范围内。
10.权利要求6 8中任一项的免疫学测定用试剂盒，其中所述展开溶剂以1 15重 量％的浓度含甘露醇。
11.免疫层析用展开溶剂，其特征在于含甘露醇。
12.免疫层析用展开溶剂，其特征在于兼含甘露醇和表面活性剂二者。
13.权利要求12的免疫层析用展开溶剂，其中所述表面活性剂的HLB在8 20的范围内。
14.权利要求11或12的免疫层析用展开溶剂，其中所述展开溶剂以1 15重量％的 浓度含甘露醇。
全文摘要
本发明抑制非特异性反应的同时在短时间内正确进行被检物的检测。本发明是免疫学测定方法，其为用免疫层析用试验片免疫学测定被检物的方法，所述免疫学测定用试验片包含固定有与被检物特异性结合的第1抗体或第1抗原的膜载体、固定有与被检物特异性结合的第2抗体或第2抗原的不溶性载体、以及可分离细胞的多孔性分离基质，其中，将所述多孔性分离基质用表面活性剂预先浸润，然后将通过所述第2抗体或第2抗原与被检物特异性结合的所述不溶性载体用含甘露醇的展开溶剂展开；包含所述免疫层析用试验片与所述展开溶剂的组合的试剂盒。
文档编号G01N33/531GK101952722SQ20098010272
公开日2011年1月19日 申请日期2009年2月27日 优先权日2008年3月6日
发明者伊藤大辅, 岩本久彦, 望月一芳, 木谷佳子, 柘植理公 申请人:田中贵金属工业株式会社