专利名称：一种检测n-酰化高丝氨酸内酯的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测N-酰化高丝氨酸内酯的方法。
背景技术：
嗜水气单胞菌在自然界中具有广泛的病原性，是人兽共患病的重要病源菌。自然 存在于水样环境中，严重威胁着水产业。该菌的致病性与其产生多种毒力因子有关，毒力因 子主要有外肠毒素，内毒素，溶血素，细胞毒素，蛋白酶等。Quorum Sensing(QS)系统是指细菌根据特定信号分子的浓度可以检测周围环境 中自身或其他细菌的数量变化，当信号分子达到一定的浓度阈值时，能启动菌体中相关基 因的表达来适应环境中的变化的现象。许多革兰氏阴性细菌产生酰基高丝氨酸内酯类化合 物(acyl-homoserine lactones，简称AHL)信号分子，AHL通过类LuxI蛋白合成，并与胞内 的类LuxR受体蛋白结合，形成受体-自体诱导物复合体，当该复合体与目的基因启动子结 合，就能激活该基因的转录。这类自体诱导物在高细胞密度时能自由地通过细胞膜，在细胞 外累积。LuxR类蛋白含有两个结构域，其氨基端含有一特定区域负责结合AHLs分子并调节 蛋白的寡聚化，而梭基端含有一高度保守的螺旋-转角-螺旋结构能与DNA结合从而调控 基因的转录。绝大多数水产细菌性病原菌的毒性效应表达均是由AHLs浓度来调控的，并表 现正反馈效应。水产细菌性病原菌种类繁多，通过病鱼体征、病原菌变化、水质指标等来预 警细菌疾病的爆发缺乏预见性与准确性，但于这类病原菌共有的群体感应机制，均通过特 定信号分子(G-菌N-酰化高丝氨酸内酯AHLs)的活性浓度来调控病原菌的“毒性开关”， 不同病原菌可能在毒性效应上存在差异，但由于AHLs存在化学结构共性与受体特异性，通 过对AHLs活性浓度实施监测则可以准确预警细菌性疾病的爆发。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种与N-酰化高丝氨酸内酯受体偶联的纳米磁珠。本发明所提供的与N-酰化高丝氨酸内酯受体偶联的纳米磁珠，按照包括如下步 骤的方法制备用偶联缓冲液悬浮活化磁珠，再加入N-酰化高丝氨酸内酯受体，在25°C反 应3 h，得到N-酰化高丝氨酸内酯受体偶联的磁珠；所述偶联缓冲液按照如下方法配制得 到将PH值为7.4,1 χ PBS缓冲液和Tween-20混合，得到偶联缓冲液，pH值为7.4,1 χ PBS缓冲液与Tween-20的体积比为IOOml 0. 05ml ；每IOOml所述pH值为7. 4,1 χ PBS 缓冲液按照如下方法配制得到将1. 9ml浓度为0. 2mol/L的NaH2PO4水溶液和8. Iml浓度 为0. 2mol/L的Na2HPO4水溶液混合，用水定容至100ml，得到所述pH值为7. 4、1 χ PBS缓 冲液。上述与N-酰化高丝氨酸内酯受体偶联的纳米磁珠制备方法中，所述N-酰化高丝 氨酸内酯受体与所述活化磁珠的投料比为5μ g 10μ gN-酰化高丝氨酸内酯受体2mg磁 珠，具体为 ο μ gN-酰化高丝氨酸内酯受体2mg磁珠。上述与N-酰化高丝氨酸内酯受体偶联的纳米磁珠制备方法中，所述活化纳米磁珠按照包括如下步骤的方法制备得到将EDC溶液、NHS溶液和纳米磁珠混合，孵育，得到活 化的纳米磁珠。上述与N-酰化高丝氨酸内酯受体偶联的纳米磁珠制备方法中，所述EDC、NHS和纳 米磁珠的投料比为Img Img 2mgo上述与N-酰化高丝氨酸内酯受体偶联的纳米磁珠制备方法中，所述孵育的温度 为37°C，时间为30min。上述与N-酰化高丝氨酸内酯受体偶联的纳米磁珠制备方法中，所述EDC溶液的 溶质是EDC固体，溶剂是浓度为10mM、pH值为6. O的MES缓冲液，溶质和溶剂的配比为 5mg Iml。上述与N-酰化高丝氨酸内酯受体偶联的纳米磁珠制备方法中，所述NHS溶液的 溶质是NHS固体，溶剂是浓度为10mM、pH值为6. O的MES缓冲液，溶质和溶剂的配比为 5mg Iml。上述与N-酰化高丝氨酸内酯受体偶联的纳米磁珠制备方法中，所述N-酰化高丝 氨酸内酯受体的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；上述与N-酰化高丝氨酸内酯受体偶联的纳米磁珠制备方法中，所述N-酰化高丝 氨酸内酯为C4-HSL。本发明的另一个目的是提供一种辅助检测样品中是否含有N-酰化高丝氨酸内酯 的方法。本发明所提供的辅助检测样品中是否含有N-酰化高丝氨酸内酯的方法，包括如 下步骤1)按照如下方法配制实验液将待测样品、上述任一所述与N-酰化高丝氨酸内酯 受体偶联的纳米磁珠和缓冲液混合，将混合物孵育，得到实验液；所述缓冲液的PH值为pH 7.4；2)检测所述实验液遇到菌株(Agrobacterium tumefaciens)KYC55后是否变蓝， 若变蓝，则确定所述待测样品中候选含有N-酰化高丝氨酸内酯。上述辅助检测样品中是否含有N-酰化高丝氨酸内酯的方法中，所述步骤1)中，所 述缓冲液为PBS缓冲液，所述孵育的温度为30°C，所述孵育的时间为30min ；上述辅助检测样品中是否含有N-酰化高丝氨酸内酯的方法中，所述步骤2)中， 所述检测所述实验液遇到菌株(Agrobacterium tumefaciens)KYC55后是否变蓝的方法 包括如下步骤制备葡萄糖琼脂培养基，在所述培养基上沿着一条直线且等距地点上菌株 (Agrobacterium tumefaciens) KYC55培养液，将装有实验液的牛津杯放置于所述培养基 上，牛津杯与各点菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55培养液也成一条直线，牛津杯 的中心点与离牛津杯最近的一点菌株(Agrobacterium tumefaciens)KYC55培养液有距离， 在30°C保持4 后，观察各点菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55培养液是否显示蓝 色。上述辅助检测样品中是否含有N-酰化高丝氨酸内酯的方法中，所述步骤1)中，所 述待测样品、与N-酰化高丝氨酸内酯受体偶联的纳米磁珠和缓冲液的体积之和为IOOuL ； 或所述待测样品、与N-酰化高丝氨酸内酯受体偶联的纳米磁珠和缓冲液的体积比为 5μ 1 20 μ 1 75μ 1 ；
上述辅助检测样品中是否含有N-酰化高丝氨酸内酯的方法中，所述步骤2)中， 所述点上菌株(Agrobacterium tumefaciens)KYC55培养液的方法为是用牙签蘸取菌株 (Agrobacterium tumefaciens)KYC55培养液，然后再点到所述培养基上。上述辅助检测样品中是否含有N-酰化高丝氨酸内酯的方法中，所述步骤1)中，每 IOOml所述PBS缓冲液按照如下方法配制得到将1. 9ml浓度为0. 2mol/L的NaH2PO4水溶 液和8. Iml浓度为0. 2mol/L的Na2HPO4水溶液混合，用水定容至100ml，得到所述PBS缓冲 液。上述辅助检测样品中是否含有N-酰化高丝氨酸内酯的方法中，所述步骤2)中，所 述牛津杯的中心点与离牛津杯最近的一点菌株(Agrobacterium tumefaciens)KYC55培养 液的距离为8mm。上述辅助检测样品中是否含有N-酰化高丝氨酸内酯的方法中，所述步骤2)中， 所述菌株(Agrobacterium tumefaciens)KYC55的培养液按照如下方法得到将所述菌 株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55接种到培养基中，30 V培养48h，得到所述菌株 (Agrobacterium tumefaciens) KYC55的培养液；所述培养基组成为LB培养基+2 μ g/mL四 环素+100 μ g/mL壮观霉素+100 μ g/mL庆大霉素；上述辅助检测样品中是否含有N-酰化高丝氨酸内酯的方法中，所述步骤2)中，所 ii^^^tt (Agrobacterium tumefaciens) KYC554mm ；上述辅助检测样品中是否含有N-酰化高丝氨酸内酯的方法中，所述步骤2)中，所 述实验液的量为IOOul ；上述辅助检测样品中是否含有N-酰化高丝氨酸内酯的方法中，所述检测的样品 为水。N-酰化高丝氨酸内酯受体在如下⑴或⑵或(3)或(4)或(5)或(6)中的应用 也属于本发明的保护范围(1)检测样品中是否含有N-酰化高丝氨酸内酯；(2)制备检测样品中是否含有N-酰化高丝氨酸内酯的试剂盒；(3)检测样品是否含有SEQ ID NO 7所示DNA片段；(4)制备检测样品中是否含有SEQ ID NO 7所示DNA片段的试剂盒；(5)检测样品中N-酰化高丝氨酸内酯的量；(6)制备检测样品中N-酰化高丝氨酸内酯的量的试剂盒；上述应用中，所述检测的样品为水；上述应用中，所述N-酰化高丝氨酸内酯受体的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示； 所述N-酰化高丝氨酸内酯为C4-HSL。本发明的N-酰化高丝氨酸内酯受体分子用于检测N-酰化高丝氨酸内酯的方法灵 敏度高、特异性好，在检测N-酰化高丝氨酸内酯号分子和检测细菌病原菌毒性领域具有广 阔的应用前景。本文主要利用AhyR受体蛋白可与信号分子结合的特点，富集检测水体中信号分 子，提高信号分子的检出浓度，从而及时快速的对水体中水产爆发性流行病做预警。
图IAh ATCC 7966的信号分子受体蛋白(AhyR)纯化图2在1. 5%琼脂糖凝胶下Ah ATCC 7966的信号分子受体蛋白(AhyR)与其识别 DNA (inter)序列互作的凝胶阻滞实验图3在12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶下Ah ATCC 7966的信号分子受体蛋白 (AhyR)与其识别DNA(inter)序列互作的凝胶阻滞实验图4AhyR对不同信号分子识别作用的扩散阻滞试验图5磁珠-AhyR对C4-HSL识别作用的扩散阻滞试验
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。1、菌株及载体嗜水气单孢菌(Aeromonas hydrophilia ATCC 7966，Ah ATCC 7966)购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)，该菌ACCC保藏编号为10482。宿主大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21 (DE3)，载体pED8a均购自于 hvitrogen 公司，pGEM-T Easy载体购自Promega公司。^11] (Agrobacterium tumefaciens)KYC55 ^tJCM (Cho, K. ， C. Fuqua, and S.C.ffinans. 1997. Transcriptional regulation and locations of Agrobacterium tumefaciens genesrequired for complete catabolism of octopine. J. Bacteriol. 179 1-8.)中公开过，公众可从中国农业科学院饲料研究所获得。2、试剂盒、工具酶和生化试剂细菌基因组DNA提取试剂盒，琼脂糖胶回收试 剂盒，DNAC纯化试剂盒均为天根生物公司，限制性内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购 自 hvitrogen 公司，其它都为国产试剂。N-butyryl-L-homoserine lactone (C4-HSL)、 N-hexanoyl-L-homoserine lactone(C6-HSL)、 N-Octanoyl-L-homoserine lactone(C8-HSL)、 N-decanoyl-L-homoserine lactone(C10-HSL)、 N-dodec anoyl-L-homoserinelactone(C12-HSL) > N-(3-0xohexanoyl)-D-homoserine lactone (3-oxo-C6_HSL)、N- (3-0xooctanoyl) -L-homoserine lactone (3-oxo-C8_HSL)、 N- (3-0xodecanoyl) -L-homoserine lactone (3-oxo-ClO-HSL)、 N-3-oxo-dodecanoyl-L-homoserine lactone(3-oxo-C12_HSL)、N- (3-Oxotetradec anoyl)-L-homoserine lactone(3-oxo-C14_HSL)、N- (3-hydroxyoctanoyl)-homose rine lactone (3-hydroxy-C8-HSL)、N- (3-Hydroxytetradecanoyl) -DL-homoserine lactone (3-hydroxy-C14-HSL)均购自 Sigma (St. Louis, Mo, USA)。3、培养基。大肠杆菌培养基为LB (1%蛋白胨、0. 5%酵母提取物、NaCl, ρΗ7. 0)。实施例1、ahyr受体蛋白的制备一、嗜水气单孢菌ATCC 7966总DNA提取，及ATCC 7966受体蛋白AhyR的基因的克隆嗜水气单孢菌ATCC 7966总DNA提取参照细菌DNA提取试剂盒说明书(天根生 化科技有限公司，中国，北京)。根据发表的ATCC 7966受体蛋白ahyr的基因的序列设 计合成了 弓丨物 AhyR-EF(5 ‘ -ccggaattca tgaccgttaa aaaactttac-3 ‘ ) (SEQ ID 3)禾口AhyR-ER(5‘ -attgcggccg cttataaaaa ttcaggaaat g_3' ) (SEQ ID :4),在弓丨物的末端分 别引入内切酶EcoR I和Not I酶切位点(下划线部分)，以嗜水气单孢菌ATCC 7966总DNA 为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为94°C变性5min后冷却至4°C;然后94°C变性30sec， 58°C退火30sec，72°C延伸lmin，30个循环后72°C保温lOmin。得到的PCR片段与pGEM_T Easy连接，测序验证，结果得到插入序列如SEQ ID NO 2所示基因的重组载体，正确，记作 pGEM-T Easy/ahyR。SEQ ID NO :2所示基因编码的ahyr受体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。二、制备含有ATCC 7966受体蛋白ahyr的基因的重组蛋白将步骤一得到的阳性重组载体pGEM-T Easy/ahyR用限制性内切酶EcoR I和Not I进行酶切，与经同样酶切的质粒pET28a连接，重组载体热击转化大肠杆菌BL21 (DH3)感 受态细胞，抗性筛选，挑取单克隆，扩大培养，提取质粒，测序鉴定，结果在pET28a的EcoR I 和Not I酶切位点间插入的基因序列如SEQ ID NO :2所示，表明构建的重组表达载体结构 正确，记作 pET28a-ahyR。取含有pET28a_ahyR的BL21 (DE3)菌株接种于50mL LB液体培养液中 (LB+100 μ g/mL的卡那霉素)，37°C、振荡培养1 活化菌种。取細1培养液加入200mL LB培 养液(LB+ΙΟΟμ g/mL卡那霉素)(2%接种量)中，37°C振荡培养约2_3h (OD6tltl达到0. 6-0. 8) 后加入终浓度lmmol/L的诱导剂IPTG，20°C 180rpm震荡培养12h。培养液12，OOOrpm离 心5min，分别收集培养基上清和沉淀，细胞沉淀用pH 7. 41xPBS缓冲液重悬，超声破碎后 12，OOOrpm离心lOmin，收集上清为细胞裂解液。细胞裂解液经Ni-NTA柱Oliagen，German) 进行纯化，得到纯化蛋白。将蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果如图1所示。得到电泳纯的单 一条带(第7泳道)，分子量约为30kDa与预测分子量相近。以转入空载体pET28a的大肠杆菌作为对照，结果没有检测到目的分子量大小的蛋白。实施例2、受体蛋白的应用一、与目的DNA结合功能UAh ATCC 7966受体蛋白AhyR的基因识别DNA (inter)序列获得根据发表的ATCC 7966受体蛋白AhyR的识别序列设计合成了引物AhyR_BE(5' -C TCGTTTTCTACCTCCCATC-3‘ )(SEQ ID 幻和AhyR-BR(5‘ -CAGTTGGTCTTGTTTCATATGC-3‘) (SEQ ID 6)，以嗜水气单孢菌ATCC 7966总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为 94°C变性5min后冷却至4°C ；然后94°C变性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸lmin，30个 循环后72°C保温lOmin。纯化保存。得到的DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID NO :7所示。2,AhATCC 7966的信号分子受体蛋白(AhyR)与其识别DNA(inter)序列互作的凝 胶阻滞实验受体蛋白(AhyR)与其识别DNA(inter)按1 1(物质量比)比例在室温下共同 结合作用30min后，以目的DNA(inter)与1 χ PBS在室温下共同作用为CK，用1. 5%琼脂 糖凝胶电泳检验，电泳图(图2，1表示CK，2表示结合物)中受体蛋白(AhyR)与其识别 DNA(inter)结合的带迁移率明显滞后于CK带。以同样方法在12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行凝胶阻滞实验，结果(图 3，1表示CK，2表示结合物)结合物也出现明显滞后现象。结果表明受体蛋白可以识别该段DNA序列，从而导致其在电泳过程中受到阻滞。实验设3次重复，结果均一致。二、Ah ATCC 7966的信号分子受体蛋白(AhyR)与其识别的信号分子相互作用试 验检测方法与实施例3中步骤二所述方法相同，不同的是实验液的组成不同。本实 验中实验液按照如下方法配制将信号分子C4-HSL溶液5 μ 1 (5 μ M)，ahyr受体蛋白溶液20 μ 1 (5 μ g/ml)和 pH7. 4的1 χ PBS缓冲液25 μ 1混合，30°C共同水浴30min，再加入Ni-NTA柱质50 μ 1 (加 入Ni-NTA柱质的目的是以吸附固定AhyR蛋白，使其不能自由扩散)，得到实验液。CK为信号分子C4-HSL溶液5 μ 1 (5 μ Μ)、pH 7. 4的Ix PBS缓冲液95 μ 1加入牛 津杯中，放30°C温箱中48h，得到对照液。信号分子C4-HSL溶液的制备方法与实施例3中步骤二中所述相同。结果ck组的蓝点个数比实验组多2个点(图4中C4组)。说明受体蛋白与C4-HSL 可以相互吸附。用相同方法测定受体蛋白与其余信号分子作用(C6-HSL，C7-HSL，C8-HSL， ClO-HSL, C12-HSL, oxo-C6-HSL, oxo-C8-HSL, oxo-C10-HSL, oxo-C12-HSL, oxo-C14-HSL, 3-hydroxy-C8-HSL, 3-hydroxy-C14-HSL)，结果如图4，对照组和实验组的蓝点个数没有差 别，说明ahyr受体蛋白与其余信号分子没有吸附作用。实验设3次重复，结果均一致。实施例3、Ah ATCC 7966的信号分子受体蛋白(AhyR)纳米磁珠表面修饰纳米磁珠购自上海奥润微纳新材料科技有限公司(上海，中国)， AllMag PM3-008o一、修饰的纳米磁珠的制备1、碳二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺法(EDC/NHS法)活化磁珠(1)取2mg PM3-008磁珠到1. 5ml离心管中，用500 μ 1 MEST缓冲液洗涤两次，磁 分离后移除上清。MEST缓冲液按照如下方法配制将IOOml浓度为IOmM的pH 6. 0的MES 缓冲液(2-(N-吗啉)乙磺酸)和0.05ml Tween 20混合，得到MEST缓冲液。(2) EDC溶液配制用4°C贮存的浓度为IOmM的pH 6. 0的MES缓冲液溶解EDC固 体(Iml 5mg)，得到EDC溶液(现配现用)；NHS溶液配制用4°C贮存的浓度为IOmM的pH 6. 0的MES缓冲液溶解NHS固体 (Iml 5mg)，得到NHS溶液(现配现用)；(3)将200 μ 1的EDC溶液和200 μ 1 NHS溶液加入到装有ΡΜ3-008磁珠的离心管 中(EDC、NHS和纳米磁珠的投料比为Img Img ^iig ；)，螺旋混勻磁珠充分悬浮，37°C保 温30min，期间保持磁珠的悬浮状态，得到活化的磁珠。2、磁珠偶联的AhyR蛋白制备(1)用500 μ 1的偶联缓冲液重新洗涤已经活化的磁珠3遍后，再用500 μ 1的偶联 缓冲液洗涤磁珠2遍。所述偶联缓冲液按照如下方法配制得到将pH值为7. 4、1 χ PBS缓冲液和 Tween-20混合，得到偶联缓冲液，pH值为7. 4、1 χ PBS缓冲液与Tween-20的体积比为
9IOOml 0. 05ml ；每IOOml所述pH值为7. 4、1 χ PBS缓冲液按照如下方法配制得到将 1. 9ml浓度为0. 2mol/L的NaH2PO4水溶液和8. Iml浓度为0. 2mol/L的Na2HPO4水溶液混合， 用水定容至100ml，得到所述pH值为7. 4、1 χ PBS缓冲液。(2)加400 μ 1偶联缓冲液重悬洗涤后的磁珠，再加入100 μ 1 100 μ g/ml的纯化的 AhyR蛋白，使得磁珠表面活化的羧基同AhyR蛋白的氨基室温)反应池，将蛋白偶联 于磁珠表面，得到偶联的磁珠。AhyR蛋白与纳米磁珠的投料比为IOyg AhyR蛋白2mg磁珠。(3)用500 μ 1偶联缓冲液洗涤偶联后磁珠2遍，加入500 μ 1含有牛血清白蛋 白(BSA)的偶联缓冲液25°C封闭磁珠30min (期间保持磁珠的悬浮状态)(BSA将AhyR未结 合位点封闭)。(4)用500 μ 1的偶联缓冲液洗涤封闭后的磁珠2遍，用100 μ 1保存液重悬磁珠， 保存于4°C冰箱，待用。保存液的配制将PBST缓冲液中添加0. 02% NaN3和0. 05% BSA混 合，得到保存液。二、用偶联AhyR的纳米磁珠检测信号分子的方法原理信号分子C4-HSL遇到指示菌KYC55后变蓝，而当信号分子C4-HSL与磁珠偶 联AhyR蛋白结合后该复合体不能扩散，因此指示菌KYC55不变蓝。检测方法1)配置葡萄糖琼脂培养基，将其切割成条状，再置于画有十字网格的平板上；2)用牙签蘸取指示菌KYC55培养液，在每个条状培养基的中间的十字交叉处点上 指示菌KYC55培养液，每点相距4mm且各点在同一条直线上；3)在培养基条的最前方放置牛津杯，牛津杯与各点菌株KYC55培养液也成一条直 线，将100μ 1实验液置于牛津杯中，牛津杯的中心点与离其最近的菌株KYC55培养液点距 离 8mm ；4)再将检测平板和牛津杯一起置于30°C温箱中培养48h，然后观察各点菌株 KYC55培养液是否变成蓝色；若距离牛津杯最近的一点菌株KYC55培养液显示蓝色，则确定 实验液中候选含有N-酰化高丝氨酸内酯且达到了可检测的数量级。5)再统计蓝点的个数。蓝点的个数越少说明信号分子扩散的越少，信号分子扩散 的越少说明实验液中含有C4-HSL的量越少，实验液中含有C4-HSL的量越少表明制备的偶 联纳米磁珠与C4-HSL发生了结合作用。指示菌(Agrobacterium tumefaciens)KYC55的培养液按照如下方法得到将所 述菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55接种到培养基中，30°C培养48h，得到所述菌 株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55的培养液；所述培养基组成为LB培养基+2 μ g/mL 四环素+100 μ g/mL壮观霉素+100 μ g/mL庆大霉素。葡萄糖琼脂培养基的组成(mg/L)=KH2PO4 535，(NH4)2SO4 10，MgSO4 3. 9， CaCl2O. 38，FeSO4 · 7H20 0. 25，MnSO4 · H2O 0.11，葡萄糖 5000，琼脂 2 %，其余为水。实验液的制备将信号分子C4-HSL溶液5 μ 1 (5 μ M)，磁珠偶联的AhyR蛋白 20μ 1，和pH 7.4,1 χ PBS缓冲液75 μ 1混合，30°C共同水浴30min,即得到实验液。CK的制备将信号分子C4-HSL溶液5 μ 1 (5 μ M)和pH值为7. 4、1 χ PBS缓冲液 95 μ 1 混合，30°C水浴 30min。
信号分子C4-HSL溶液的配制方法将C4-HSL和乙醇混合，得到的混合物即为信号 分子C4-HSL溶液；混合物中C4-HSL的浓度为5 μ Μ。-20°C保存。每IOOml所述pH值为7. 4、1 χ PBS缓冲液按照如下方法配制得到将1. 9ml浓度 为0. 2mol/L的NaH2PO4水溶液和8. Iml浓度为0. 2mol/L的Na2HPO4水溶液混合，用水定容 至100ml，得到所述pH值为7.4,1 χ PBS缓冲液。结果如图5所示。实验组的第一点菌株KYC55培养液变蓝，但颜色明显比对照 组浅，且变蓝点数少于CK组，说明偶联AhyR的纳米磁珠制备成功，并且可以有效地结合 C4-HSL。三、方法的灵敏度检测实验组将C4-HSL溶于pH 7. 4的PBS缓冲液中，终浓度为5 μ Μ，得到C4-HSL溶 液。向45 μ L pH 7. 4的PBS缓冲液中添加5 μ L C4-HSL的溶液(C4-HSL浓度记作10—1)， 并依次进行10倍的梯度稀释至C4-HSL浓度为10_6，制备成不同浓度C4-HSL的溶液。按照 实验二中所述方法检测。对照组(Ni-NTA吸附方法)除实验液的配制与实验组不同外，其余条件均与实验 组相同。对照组中实验液按照如下方法配制将C4-HSL溶于pH 7. 4的PBS缓冲液中，终浓 度为5 μ Μ，得到C4-HSL溶液。向45 μ L pH 7. 4的PBS缓冲液中添加5 μ L C4-HSL的溶液 (C4-HSL浓度记作10—1)，并依次进行10倍的梯度稀释至C4-HSL浓度为10_6，制备成不同浓 度C4-HSL的溶液。按照实验二中所述方法检测。牛津杯里放有Ni-NTA柱质，目的是以吸 附固定AhyR蛋白，使其不能自由扩散。检测结果显示，实验组的检测灵敏度约为25pmol[即能够检测浓度为 25pmol(10-6)的C4-HSL溶液]；对照组的检测灵敏度约为2. 5nmol [即能够检测浓度为 25pmol (10_3)的C4-HSL溶液]；磁珠偶联的AhyR蛋白比Ni-NTA吸附AhyR蛋白的检测灵敏 度提高约100倍，达到pmol级。实验设3次重复，结果均一致。
权利要求
1.一种与N-酰化高丝氨酸内酯受体偶联的纳米磁珠，按照包括如下步骤的方法制备 用偶联缓冲液悬浮活化后的纳米磁珠，再加入N-酰化高丝氨酸内酯受体，在25°C反应3h， 得到与N-酰化高丝氨酸内酯受体偶联的纳米磁珠；所述偶联缓冲液按照如下方法配制得 到将PH值为7.4,1 χ PBS缓冲液和Tween-20混合，得到偶联缓冲液，pH值为7.4,1 χ PBS缓冲液与Tween-20的体积比为IOOml 0. 05ml ；每IOOml所述pH值为7. 4,1 χ PBS 缓冲液按照如下方法配制得到将1. 9ml浓度为0. 2mol/L的NaH2PO4水溶液和8. Iml浓度 为0. 2mol/L的Na2HPO4水溶液混合，用水定容至100ml，得到所述pH值为7. 4、1 χ PBS缓 冲液。
2.根据权利要求1所述的纳米磁珠，其特征在于所述N-酰化高丝氨酸内酯受体与所 述活化后的纳米磁珠的投料比为5 μ g 10 μ g N-酰化高丝氨酸内酯受体2mg磁珠，具体 为10 μ gN-酰化高丝氨酸内酯受体2mg磁珠。
3.根据权利要求1或2所述的纳米磁珠，其特征在于所述活化后的纳米磁珠按照包 括如下步骤的方法制备得到将EDC溶液、NHS溶液和纳米磁珠混合，孵育，得到活化后的纳 米磁珠；所述EDC、NHS和纳米磁珠的投料比为Img Img 2mg ；所述孵育的温度为37°C，时间为30min。
4.根据权利要求1-3中任一所述的纳米磁珠，其特征在于所述EDC溶液的溶质是EDC 固体，溶剂是浓度为10mM、pH值为6. 0的MES缓冲液，溶质和溶剂的配比为5mg Iml ；所述NHS溶液的溶质是NHS固体，溶剂是浓度为10mM、pH值为6. 0的MES缓冲液，溶质 和溶剂的配比为5mg Iml ；所述N-酰化高丝氨酸内酯受体的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；或，所述N-酰化高丝氨酸内酯为C4-HSL。
5.一种辅助检测样品中是否含有N-酰化高丝氨酸内酯的方法，包括如下步骤1)按照如下方法配制实验液将待测样品、权利要求1-4中任一所述与N-酰化高丝氨 酸内酯受体偶联的纳米磁珠和缓冲液混合，将混合物孵育，得到实验液；所述缓冲液的PH 值为7. 4 ；2)检测所述实验液遇到菌株(Agrobacteriumtumefaciens) KYC55后是否变蓝，若变 蓝，则确定所述待测样品中候选含有N-酰化高丝氨酸内酯。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤1)中，所述缓冲液为PBS缓冲 液，所述孵育的温度为30°C，所述孵育的时间为30min ；或，所述步骤2)中，所述检测所述实验液遇到菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55后是否变蓝的方法包括如下步骤制备葡萄糖琼脂培养基，在所述培养基上沿着 一条直线且等距地点上菌株(Agrobacterium tumefaciens)KYC55培养液，将装有实验 液的牛津杯放置于所述培养基上，牛津杯与各点菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55培养液也成一条直线，牛津杯的中心点与离牛津杯最近的一点菌株(Agrobacterium tumefaciens)KYC55培养液有距离，在30°C保持48h后，观察各点菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55培养液是否显示蓝色。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述步骤1)中，所述待测样 品、与N-酰化高丝氨酸内酯受体偶联的纳米磁珠和缓冲液的体积之和为IOOuL ；或所述待测样品、与N-酰化高丝氨酸内酯受体偶联的纳米磁珠和缓冲液的体积比为 5μ 1 20 μ 1 75μ 1 ；或，所述步骤幻中，所述点上菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55培养液的方法 为是用牙签蘸取菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55培养液，然后再点到所述培养基上。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于所述步骤1)中，每IOOml所述 PBS缓冲液按照如下方法配制得到将1. 9ml浓度为0. 2mol/L的NaH2PO4水溶液和8. Iml 浓度为0. 2mol/L的Na2HPO4水溶液混合，用水定容至100ml，得到所述PBS缓冲液。或，所述步骤2)中，所述牛津杯的中心点与离牛津杯最近的一点菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55培养液的距离为8mm。
9.根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于所述步骤幻中，所述菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55的培养液按照如下方 法得到将所述菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55接种到培养基中，30°C培养48h， 得到所述菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55的培养液；所述培养基按照包括如下 步骤的方法得到向LB培养基中添加四环素、壮观霉素和庆大霉素，得到所述培养基；四环 素在所述培养基中的浓度为2 μ g/mL，壮观霉素在所述培养基中的浓度为100μ g/mL，庆大 霉素在所述培养基中的浓度为100 μ g/mL ；所述步骤幻中，所述各点菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55培养液相距4mm ；所述步骤幻中，所述实验液的量为IOOul ；所述待测样品为水；或，所述N-酰化高丝氨酸内酯为C4-HSL。
10.N-酰化高丝氨酸内酯受体在如下⑴或⑵或(3)或(4)或(5)或(6)中的应用(1)检测样品中是否含有N-酰化高丝氨酸内酯；(2)制备检测样品中是否含有N-酰化高丝氨酸内酯的试剂盒；(3)检测样品是否含有SEQID NO 7所示DNA片段；(4)制备检测样品中是否含有SEQID NO :7所示DNA片段的试剂盒；(5)检测样品中N-酰化高丝氨酸内酯的量；(6)制备检测样品中N-酰化高丝氨酸内酯的量的试剂盒；所述检测的样品为水；所述N-酰化高丝氨酸内酯受体的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；所述N-酰化高丝 氨酸内酯为C4-HSL。
全文摘要
本发明公开了一种检测N-酰化高丝氨酸内酯的方法。该辅助检测样品中是否含有N-酰化高丝氨酸内酯的方法，包括如下步骤1)按照如下方法配制实验液将待测样品、与N-酰化高丝氨酸内酯受体偶联的纳米磁珠和缓冲液混合，将混合物孵育，得到实验液；所述缓冲液的pH值为pH 7.4。2)检测所述实验液遇到菌株(Agrobacteriumtumefaciens)KYC55后是否变蓝，若变蓝，则确定所述待测样品中候选含有N-酰化高丝氨酸内酯。该新用途是N-酰化高丝氨酸内酯受体在检测样品中N-酰化高丝氨酸内酯中的应用。本发明的N-酰化高丝氨酸内酯受体分子用于检测N-酰化高丝氨酸内酯的方法灵敏度高、特异性好，在检测N-酰化高丝氨酸内酯信号分子和检测细菌病原菌毒性领域具有广阔的应用前景。
文档编号G01N21/78GK102128828SQ201010578919
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月3日 优先权日2010年12月3日
发明者何夙旭, 刘玉春, 周志刚, 姚斌, 崔浩, 张美超, 曹雅男, 毛玮 申请人:中国农业科学院饲料研究所