专利名称：曙红及其衍生物在蛋白质检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质负染检测技术，具体地说，涉及蛋白质检测的一种新的负染染料。
背景技术：
在蛋白质组学研究中，凝胶蛋白质染色技术是衔接二维电泳和下游质谱分析的关键技术。当前先进的质谱仪已能够分析Pg级的痕量蛋白。常规的凝胶蛋白质染色技术有考马斯亮蓝染色、银染、荧光染色等。考马斯亮蓝染色法灵敏度低，银染法操作复杂、质谱兼容性差，荧光染色法价格昂贵。这些因素严重地制约了高通量蛋白质组学的发展。虽然，近三四十年开发出了不少新的染色技术，但仍存在着如下一个或几个缺点灵敏度低、重现性差、毒性大、质谱兼容性差、价格昂贵、操作繁琐等。寻找新的染色方法以适应当前先进的质谱分析技术已成为后基因组时代推动蛋白质组学发展的当务之急。曙红负染法为凝胶蛋白质染色提供了一种快速、灵敏的方法，其灵敏度达0. 1 0. ^g/band，可以和银染相媲美。 而且曙红负染方法是对凝胶背景进行着色，对蛋白质的结构没有修饰或破坏作用，有良好的质谱兼容性，弥补了银染法质谱兼容性差的缺陷。曙红负染法将很好地衔接二维电泳和下游质谱分析，推动蛋白质组学的快速发展。
发明内容
本发明的目的在于提供曙红及其衍生物在蛋白质检测中的应用。本发明所述的曙红相关化合物是指以曙红阴离子为母核的钠盐、钾盐和铵盐等。曙红母核为为了实现本发明的目的，本发明提供了一种电泳凝胶上蛋白质负染的方法，包括如下步骤1)将SDS-PAGE电泳后的蛋白样品凝胶置于固定液中固定10 60min，弃固定液， 然后用去离子水冲洗1 3次，每次1 lOmin。优选的固定时间为30min，去离子水冲洗次数为2次，冲洗时间为5min。固定液可以是含有50%乙醇和10%乙酸的水溶液；2)在甲醇溶液里平衡5 20min，其中甲醇溶液为按体积比30 70%的甲醇水溶液；优选的平衡时间为lOmin，优选的甲醇浓度为50% ；
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3)加入染色液染色1 30min，然后放在去离子水中漂洗1 lOmin，其中染色液为含重量体积比0. 1 2%的曙红或其衍生物及按体积比30 70%的甲醇、0. 5 1. 5% 的乙酸水溶液；优选的曙红及其衍生物的浓度为0. 5%,甲醇浓度为50%，乙酸浓度为； 优选的水洗时间为3min。4)检测，凝胶染色后，可放在黑色背景下直接肉眼观察；或在爱普生V700扫描仪下，反向扫描模式扫描，其灵敏度更高；还可进行荧光检测，曙红本身能发较强的荧光，可在检测波长250 400nm下检测，优选波长为365nm。前期研究表明该技术有如下优点1)灵敏度高曙红负染灵敏度高于考马斯亮蓝染色法数百倍，和银染法灵敏度相当；2)操作简单迅速操作步骤少，可在1个小时内完成；3)重现性好受温度、摇床摆动频率等外部条件影响较小；4)可逆性好容易脱色；5)质谱兼容性好由于曙红负染是对凝胶背景进行染色，不和凝胶上的蛋白质结合，蛋白质结构完全不受影响，所以可与MALDI-TOF等质谱仪高度兼容；6)使用安全采用毒性低的染料，提高实验操作的安全性，对环境污染小；7)成本低。
图1.曙红的化学结构；图2.在一向SDS-PAGE胶上，(A)曙红负染法、⑶传统戊二醛银染法、(C) SYPRORuby荧光染色法和⑶咪唑锌负染法灵敏度的比较。戊二醛银染法、SYPRO Ruby荧光染色法和咪唑锌负染法均按照文献记载；采用Sigma公司的标准蛋白质(SDS6H2)为样品。带 1，IOOOng ；带 2，500ng ；带 3，250ng ；带 4，IOOng ；带 5，50ng ；带 6，IOng ；带 7，&ig ；带 8,0. 8ng ；带 9,0. 4ng ；带 10，0. 2ng。图3. 二向SDS-PAGE胶上，㈧曙红负染法、⑶传统戊二醛银染法、(C) SYPRORuby 荧光染色法和(D)咪唑锌负染法灵敏度的比较。分离样品为大肠杆菌总蛋白；IPG胶条长 13厘米，pH 4-7 ；分离胶的浓度为11. 4% ；样品上样量为100微克/胶条。图4.比较在一向SDS-PAGE胶上曙红负染法、传统戊二醛银染法、SYPRO Ruby荧光染色法和咪唑锌负染法检识的标准蛋白的线性范围。标准蛋白经染色后，其中三个代表蛋白 phosphorylase b(A，B)、BSA (C，D)禾口 carbonic anhydrase (Ε, F)经 ImageQuant TL 图像软件分析后绘得标准蛋白上样量与条带强度的线性曲线。图中A、C、E所测量标准蛋白质量范围为0. 8-lOOOng，而B、D和F所测量标准蛋白质量范围为0. 8-lOOng。
具体实施例方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。实施例1曙红蛋白质负染染色图1是曙红的化学结构式。
图2-4的曙红蛋白质负染实验采用下述步骤进行1)将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品(SDS6H2)凝胶于50%甲醇/10%乙酸溶液中固定30min。然后去离子水洗2次，每次5min ；2)在50%甲醇溶液中平衡IOmin ；3)在染色液中染色15min，再放在去离子水里漂洗3min，染色液为含0. 5% (W/V) 曙红含50%甲醇/1%乙酸的水溶液；4)凝胶染色后，在爱普生V700扫描仪下，反向扫描模式扫描。按照上述方法分别用曙红的钠盐、钾盐、铵盐进行蛋白质染色，结果表明用这些衍生物均能够得到类似于曙红的检测结果。图2是说明曙红负染法与其它染色法效果对比按照实施例1的方法，采用不同染料进行染色，(A)曙红负染法、(B)传统戊二醛银染法、(C)SYPRO Ruby荧光染色法和(D)咪唑锌负染法灵敏度的比较。传统戊二醛银染法、SYPRO Ruby荧光染色法和咪唑锌负染法均按照文献记载；采用Sigma公司的标准蛋白质(SDS6H2)为样品。带1，1000叫；带2，500叫；带3，250叫；带4，100叫；带5，50叫；带6， IOng ；带7,2ng ；带8,0. 8ng ；带9,0. 4ng ；带10，0. 2ng。结果如图2所示，曙红负染法检测灵敏度最高。图3是说明曙红负染法与其它染色法对E. coli总蛋白的染色对比取E. coli菌液，12000rpm离心收集菌群，加入0. 02mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7. 0)重悬菌体。利用超声波破碎仪破碎细胞。18000rpm离心30min，收集上清，即得E. coli 总蛋白提取液(粗蛋白制品)，将上述粗蛋白制品经二向凝胶电泳分离后，分别采用实验例 1的㈧曙红负染法、⑶传统戊二醛银染法、(C)SYPRO Ruby荧光染色法和⑶咪唑锌负染法进行染色，结果如图3所示。显示曙红负染是一种简单，而且灵敏度可同银染媲美的方法。图4是说明曙红负染法与其他染色法的线性动态范围对比用曙红负染法、传统戊二醛银染法、SYPRO Ruby荧光染色法和咪唑锌负染法染色标准蛋白的线形动态范围。三个代表蛋白phosphorylase b (A，B)、BSA(C，D)和carbonic anhydrase(E,F)在10%聚丙烯酰胺凝胶中分离。染色后，经ImageQuant TL图像软件分析后绘得标准蛋白上样量与条带强度的线性曲线。图中A、C、E所测量标准蛋白质量范围为 0. 8-lOOOng,而B、D和F所测量标准蛋白质量范围为0. S-IOOngo由图可知曙红负染法具有较好的线性动态范围。图2-4中的其它染色方法及其相关文献传统戊二醛银染法操作方法参见文献Heukeshoven，J. and Dernick，R. (1985) Simplifiedmethod for silver staining of proteins in polyacrylamide gels and the mechanism of silver staining. Electrophoresis 6,103-112.SYPRO Ruby荧光染色法操作方法参见文献Malone，J.，Radabaugh, Μ.， Leimgruber, R. , Gerstenecker, G. (2001)Practical aspects of fluorescent staining for proteomic application. Electrophoresis 22,919-932.咪唑锌负染染色法操作方法参见文献Castellanos-Serra，L.，Proenza, W.， Huerta, V. , Moritz, R. L. , Simpson, R. J. (1999)Proteome analysis of polyacrylamidegel-separated proteins visualizedby reversible negative staining using imidazole-zinc salts. Electrophoresis 1999，20，732-737.
权利要求
1.曙红及其衍生物在蛋白质检测中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的曙红及其衍生物为曙红的钠盐、钾盐或铵盐。
3.一种凝胶蛋白质负染检测方法，其包括步骤1)将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品凝胶置于固定液中固定10 60min，弃固定液， 然后用去离子水冲洗1 3次，每次1 IOmin ；2)在甲醇溶液里平衡5 20min，其中甲醇溶液为按体积比30 70%的甲醇水溶液；3)加入染色液1 30min，然后放在去离子水中漂洗1 lOmin，其中染色液为含重量体积比0. 1 2%的曙红或其衍生物及按体积比30 70%的甲醇、0. 5 1. 5%的乙酸水溶液。然后放在去离子水中漂洗1 IOmin ；4)检测。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中蛋白质固定时间为30min，固定液为50 %乙醇/10 %乙酸溶液，然后用去离子水冲洗两次，每次5min。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤幻甲醇溶液为50%甲醇水溶液，平衡时间为IOmin。
6.如权利要求3 5任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)染色液中曙红的浓度按重量体积比为0.5%。
7.如权利要求3 5任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中甲醇浓度为50%，乙酸浓度为1%。
8.如权利要求3 5任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)染色液染色时间为 15min。
9.如权利要求3 5任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)去离子水中漂洗时间为 3min。
10.如权利要求3 5任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)检测既可以用肉眼直接观察，又可以用爱普生V700扫描仪以反向扫描模式扫描，还可以在检测波长365nm下检测。
全文摘要
本发明涉及蛋白质负染检测技术，具体地说是曙红及其衍生物在蛋白质负染检测中的应用。本发明还提供了应用曙红进行蛋白负染检测的方法，包括步骤将蛋白质样品电泳后的凝胶在固定液中固定，去离子水冲洗；甲醇溶液平衡，染色；显影。本发明具有灵敏度高、操作简单迅速、重现性好、线性关系好、质谱兼容性好、使用安全、成本低廉等优点，可较好适用于高通量蛋白质组学的研究。
文档编号G01N1/30GK102590100SQ20111002296
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月18日 优先权日2011年1月18日
发明者丛维涛, 金利泰 申请人:温州安得森生物科技有限公司