专利名称：一种stk11基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种STKll基因突变检测特异性引物和液相芯片。
背景技术：
目前，对STKll基因突变进行检测和分析的方法很少，主要有直接测序法和PCR-RFLP分析法，其中最常用的方法有PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点 的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。再次，以上这些方法都存在着检测通量的局限性，每次只能检测一种突变类型，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供STKll基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于单独或并行检测STKll基因十种常见基因型C109T、169delG、180delC、G196A、C508T、G511A、C842T、837delC、C910T和G996A的野生型和突变型。实现上述目的的技术方案如下一种STKll基因突变检测液相芯片，包括有(A).针对STKll基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对C109T位点的SEQ ID NO. 21及SEQ ID NO. 22 ;针对169delG位点的 SEQ ID NO. 23及 SEQ ID NO. 24 ;针对 180delC位点的 SEQ ID NO. 25及 SEQ ID NO. 26 ；针对 G196A 位点的 SEQID NO. 27 及 SEQ ID NO. 28 ;针对 C508T 位点的 SEQ ID NO. 29 及 SEQID NO. 30 ;针对 G51IA 位点的 SEQ ID NO. 31 及 SEQ ID NO. 32 ;针对 C842T 位点的 SEQ IDNO. 33 及 SEQ ID NO. 34 ;针对 837delC 位点的 SEQ ID NO. 35 及 SEQ ID NO. 36 ;针对 C910T位点的 SEQ ID NO. 37 及 SEQ IDN0. 38 ;和 / 或针对 G996A 位点的 SEQ ID NO. 39 及 SEQ IDNO. 40 ;所述 tag 序列选自 SEQ IDN0.1 SEQ ID NO. 20 ；(B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 41 SEQ ID NO. 60，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。优选地，所述扩增引物为针对C109T、169delG、180delC或G196A位点的SEQ IDNO. 61 及 SEQ ID NO. 62 ;针对 C508T 或 G511A 位点的 SEQ ID NO. 63 及 SEQ ID NO. 64 ;针对C842T 或 837delC 位点的 SEQ ID NO. 65 及 SEQ ID NO. 66 ;针对 C910T 位点的 SEQ ID NO. 67及 SEQID NO. 68 ;和 / 或针对 G996A 位点的 SEQ ID NO. 69 及 SEQ ID NO. 70。
优选地，所述ASPE引物为针对C109T位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 21组成的序列以及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 22组成的序列；针对169delG位点的由SEQIDN0. 3和SEQ ID NO. 23组成的序列以及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 24组成的序列；针对180delC位点的由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 25组成的序列以及由SEQ ID NO. 6和SEQ IDN0. 26组成的序列；针对G196A位点的由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 27组成的序列以及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 28组成的序列；针对C508T位点的由SEQ ID NO. 9和SEQ IDN0. 29组成的序列以及由SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 30组成的序列；针对G511A位点的由 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 31 组成的序列以及由 SEQ ID NO. 12 和 SEQ ID NO. 32组成的序列；针对C842T位点的由SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 33组成的序列以及由SEQID NO. 14 和 SEQ ID NO. 34 组成的序列；针对 837delC 位点的由 SEQ ID NO. 15 和 SEQ IDNO. 35组成的序列以及由SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 36组成的序列；针对C910T位点的由 SEQ IDN0. 17 和 SEQ ID NO. 37 组成的序列以及由 SEQ ID NO. 18 和 SEQ ID NO. 38 组成的序列；和/或针对G996A位点的由SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 39组成的序列以及由SEQID NO. 20和SEQ ID NO. 40组成的序列。本发明的另一目的是提供用于STKll基因突变检测的特异性引物。实现上述目的的技术方案如下用于STKll基因突变检测液的特异性引物，其为针对C109T位点的SEQ IDN0. 21及 SEQID NO. 22 ;针对 169delG 位点的 SEQ ID NO. 23 及 SEQ ID NO. 24 ;针对 180delC 位点的 SEQ IDN0. 25 及 SEQ ID NO. 26 ;针对 G196A 位点的 SEQ ID NO. 27 及 SEQ ID NO. 28 ;针对 C508T 位点的 SEQ ID NO. 29 及 SEQ ID NO. 30 ;针对 G511A 位点的 SEQ ID NO. 31 及 SEQID NO. 32 ;针对 C842T 位点的 SEQ ID NO. 33 及 SEQ ID NO. 34 ;针对 837delC 位点的 SEQID NO. 35 及 SEQ IDN0. 36 ;针对 C910T 位点的 SEQ ID NO. 37 及 SEQ ID NO. 38 ;和 / 或针对G996A 位点的 SEQ IDN0. 39 及 SEQ ID NO. 40。本发明的主要优点在于 1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100%。且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的STKll基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。3.本发明的检测方法步骤简单，10种突变位点检测可通过一步PCR即可完成5条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施例方式实施例1STKll基因突变检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对STKll 基因十种常见基因型 C109T、169delG、180delC、G196A、C508T、G511A、C842T、837delC、C910T和G996A的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示
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表ISTKll基因的ASPE引物序列(tag序列+特异性引物序列)
ASPE引物
基因型类型 --
tag序列特异件引物序列
权利要求
1.一种STKll基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有(A).针对STKll基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对C109T位点的SEQ ID NO. 21及SEQ ID NO. 22 ;针对169delG位点的 SEQ ID NO. 23 及 SEQ ID NO. 24 ;针对 180delC 位点的 SEQ ID NO. 25 及 SEQ ID NO. 26 ；针对 G196A 位点的 SEQID NO. 27 及 SEQ ID NO. 28 ;针对 C508T 位点的 SEQ ID NO. 29 及 SEQID NO. 30 ;针对 G511A 位点的 SEQ ID NO. 31 及 SEQ ID NO. 32 ;针对 C842T 位点的 SEQ IDNO. 33 及 SEQ ID NO. 34 ;针对 837delC 位点的 SEQ ID NO. 35 及 SEQ ID NO. 36 ;针对 C910T位点的 SEQ ID NO. 37 及 SEQ IDN0. 38 ;和 / 或针对 G996A 位点的 SEQ ID NO. 39 及 SEQ IDNO. 40 ;所述 tag 序列选自 SEQ IDN0.1 SEQ ID NO. 20 ；(B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 41 SEQ ID NO. 60，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的STKll基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对C109T、169delG、180delC、G196A位点的 SEQ ID NO. 61 及 SEQ ID NO. 62 ;针对C508T 或G511A 位点的 SEQ ID NO. 63 及 SEQ ID NO. 64 ;针对 C842T、837delC 位点的 SEQ ID NO. 65及 SEQ IDN0. 66 ;针对 C910T 位点的 SEQ ID NO. 67 及 SEQ ID NO. 68 ;和 / 或针对 G996A 位点的 SEQ IDN0. 69 及 SEQ ID NO. 70。
3.根据权利要求1所述的STKll基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为针对C109T位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 21组成的序列以及由SEQ ID NO. 2和SEQIDN0. 22组成的序列；针对169delG位点的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 23组成的序列以及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 24组成的序列；针对180delC位点的由SEQ ID NO. 5和SEQ IDN0. 25组成的序列以及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 26组成的序列；针对G196A位点的由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 27组成的序列以及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 28组成的序列；针对C508T位点的由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 29组成的序列以及由SEQ IDNO. 10和SEQID NO. 30组成的序列;针对G511A位点的由SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 31组成的序列以及由SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 32组成的序列；针对C842T位点的由SEQ IDNO. 13和SEQ IDN0. 33组成的序列以及由SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 34组成的序列；针对837delC位点的由SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 35组成的序列以及由SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 36组成的序列；针对C910T位点的由SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 37组成的序列以及由SEQ ID NO. 18和SEQ ID NO. 38组成的序列；和/或针对G996A位点的由SEQ IDNO. 19和SEQ ID NO. 39组成的序列以及由SEQ ID NO. 20和SEQ ID NO. 40组成的序列。
4.根据权利要求1所述的STKll基因突变检测液相芯片，其特征是(A)所述ASPE引物为:针对C109T位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 21组成的序列以及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 22组成的序列；针对169delG位点的由SEQ ID NO. 3和SEQ IDN0. 23组成的序列以及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 24组成的序列；针对180delC位点的由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 25组成的序列以及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 26组成的序列；针对G196A位点的由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 27组成的序列以及由SEQ IDNO. 8和SEQ IDN0. 28组成的序列；针对C508T位点的由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 29组成的序列以及由SEQID NO. 10和SEQ ID NO. 30组成的序列；针对G51IA位点的由SEQ IDNO. 11和SEQ ID NO. 31组成的序列以及由SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 32组成的序列；针对C842T位点的由SEQ IDN0. 13和SEQ ID NO. 33组成的序列以及由SEQ ID NO. 14和SEQID NO. 34组成的序列；针对837delC位点的由SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 35组成的序列以及由SEQ ID NO. 16和SEQ IDN0. 36组成的序列；针对C910T位点的由SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 37组成的序列以及由SEQ ID NO. 18和SEQ ID NO. 38组成的序列；和针对G996A位点的由SEQ ID NO. 19和SEQ IDN0. 39组成的序列以及由SEQ ID NO. 20和SEQ ID NO. 40组成的序列；(B)有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 41 SEQ ID NO. 60，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C)所述扩增引物为:针对C109T、169delG、180delC或G196A位点的SEQID NO. 61及SEQ IDN0. 62 ;针对 C508T 或 G511A 位点的 SEQ ID NO. 63 及 SEQ ID NO. 64 ;针对 C842T 或837delC 位点的 SEQ ID NO. 65 及 SEQ ID NO. 66 ;针对 C910T 位点的 SEQ ID NO. 67 及 SEQID NO. 68 ;和针对 G996A 位点的 SEQ ID NO. 69 及 SEQ ID NO. 70。
5.根据权利要求1-4任一项所述的STKll基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10个T。
6.用于STKll基因突变检测液的特异性引物，其特征是，所述特异性引物序列为针对C109T 位点的 SEQ ID NO. 21 及 SEQ ID NO. 22 ;针对 169delG 位点的 SEQ ID NO. 23 及 SEQID NO. 24 ;针对 180delC 位点的 SEQ ID NO. 25 及 SEQ ID NO. 26 ;针对 G196A 位点的 SEQ IDNO. 27 及 SEQID NO. 28 ;针对 C508T 位点的 SEQ ID NO. 29 及 SEQ ID NO. 30 ;针对 G511A 位点的 SEQ IDN0.31 及 SEQ ID NO. 32 ;针对 C842T 位点的 SEQ ID NO. 33 及 SEQ ID NO. 34 ；针对 837delC 位点的 SEQ ID NO. 35 及 SEQ ID NO. 36 ;针对 C910T 位点的 SEQ ID NO. 37 及SEQ ID NO. 38 ;和 / 或针对 G996A 位点的 SEQ ID NO. 39 及 SEQ ID NO. 40。
全文摘要
本发明公开了一种STK11基因检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22；SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24；SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26；SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28；SEQ ID NO.29及SEQ IDNO.30；SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32；SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34；SEQ ID NO.35及SEQ ID NO.36；SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38；和/或SEQ ID NO.39及SEQ ID NO.40；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。
文档编号G01N21/64GK102994623SQ20111026982
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月13日 优先权日2011年9月13日
发明者许嘉森, 甘丹翠, 邹凤文 申请人:广州益善生物技术有限公司