专利名称：利用3C-SiC纳米颗粒光致发光谱测量细胞内pH的方法
技术领域：
本发明涉及一种简单、方便的利用3C-SiC纳米颗粒光致发光信号测量细胞内pH 值的方法，测量精度高，无毒并可用于长时间测量。
背景技术：
碳化娃是第一元素半导体材料(Si)和第二代化合物半导体材料GaAs、GaP、和InP 之后发展起来的第三代宽带隙半导体材料。3C-SiC具有较大的带隙宽度(2. 24eV)而且具有高临界击穿电场、高热导率、高载流子漂移速度等特点，在高温、高频、大功率、光电子和抗辐射等方面具有巨大的应用潜力。用碳化硅代替硅，制备光电器件与集成电路，可为军用电子系统和武器装备性能的提高，以及抗恶劣环境的电子设备提供新型器件。同时，碳化硅具有很好的生物相容性，并且SiC的密度较小，化学稳定性较好，所以碳化硅纳米颗粒在生物医学领域得到广泛应用，如可以用作发光生物标签等，临床医学上很早之前就已经开始使用碳化硅作为血管支架应用于冠状血管清理手术。碳化硅纳米颗粒可以通过两种方法制备。第一种方法是通过各种化学反应生成碳化娃纳米颗粒，比如碳离子注入娃片[L. S. Liao, X. M. Bao, Z. F. Yang, and N. B. Min, AppI. Phys. Lett. 66, 2382 (1995)]，碳离子和娃离子共派射二氧化娃薄膜[J. Zhao, D. S. Mao, Z. X. Lin, B. Y. Jiang, Y. H. Yu, X. H. Liu, H. Z. Wang, and G. Q. Yang，AppI. Phys. Lett. 73， 1838 (1998) ]，C60 偶联多孔硅[X. L. Wu, G. G. Siu，M. J. Stokes，D. L Fan，Y. Gu，and X. M. Bao, Appl. Phys. Lett. 77,1292 (2000)]等制备方法。第二种方法是电化学腐蚀法，即用电化学法方法，腐蚀3C-SiC多晶片，再经超声振荡，得到悬浮于溶液的碳化硅纳米颗粒，能稳定发射强度较高的蓝光[X. L. ffu, J. Y. Fan, T. Qiu, X. Yang, G. G. Siu, and P. K. Chu, Phys. Rev. Lett. 94，026102 (2005)]。第三种是使用化学腐蚀法，在氢氟酸和硝酸混合液中加热直接腐蚀碳化硅颗粒，腐蚀后产物在水溶液中过滤再超声振荡得到悬浮于溶液中的碳化娃纳米颗粒[J. Zhu, Z. Liu, X. L. ffu, L. L. Xu, ff. C. Zhang and Paul K Chu, Nanotech. 18, 365603(2007)]。细胞内的pH值几乎可以影响细胞内所有重大的化学反应，包括细胞生产和衰老、 细胞膜的离子输运、细胞内酶活性以及细胞吞噬等。所以细胞内PH值的测量对于生物学有重要价值。传统的测量手段是使用一系列有机荧光染料(如1，4-DHPN、HPTS、BCECF、BCPCF 等)，利用这些染料的发光强度来标定细胞内PH值。但是有机物在细胞内容易被酶分解从而被漂白，使得它们不能用于长时间的PH测量。另外，有些有机物会同细胞内的蛋白质特异性结合，使得蛋白质失活从而引起细胞毒性。
发明内容
本发明的目的在于克服有机荧光染料用于测量细胞内pH值的缺陷，首次提出一种简单、廉价的应用无机3C-SiC纳米颗粒测量细胞内pH值的方法。尤其是提出了应用无机纳米材料测量细胞内PH值的方法，并在巨噬细胞、K562白血病细胞和仓鼠卵巢细胞中进行细胞内PH测量实验，结果与用有机荧光染料测量出的细胞内pH值结论相符。本发明的技术方案是利用3C_SiC纳米颗粒光致发光谱测量细胞内pH的方法，应用化学腐蚀方法制备3C-SiC纳米颗粒，将所述3C-SiC纳米颗粒加入细胞培养液中，逐渐改变培养液PH值同时在360nm波长的激发光源下测量溶液光致发光谱，将发光谱分解可得到带带复合的发光峰和表面H+和0H_离子键合的发光峰，两峰强度比与pH值在5. 6-7. 4范围内呈线性关系。发光谱线中可以得到3C-SiC由表面0H_和H+离子引起的表面态510nm发光峰同带带复合450nm发光峰的强度比值。应用此线性关系在巨噬细胞、K562白血病细胞和仓鼠卵巢细胞中进行细胞内PH测量实验，结果与已知结论相符。将含3C-SiC纳米颗粒的培养液用于细胞培养，培养之后将原细胞培养液加入新鲜不含3C-SiC的培养液，测量此溶液光致发光，得到的发光峰强度比值代入线性关系即可得到细胞内PH值。含3C-SiC纳米颗粒的培养液的的浓度一般O. 5-2g的3C-SiC纳米颗粒/IOml细胞培养液。细胞培养时间16-48小时左右，可根据情况调节培养时间，为使发光信号足够强， 培养时间不得低于6小时。所述培养液中的3C-SiC纳米颗粒尺寸应在4-7nm左右。所述的化学腐蚀方法制备3C_SiC纳米颗粒的制备方法为现有技术将3C_SiC粉末IOg加入混和酸IOO-IlOml中，加热反应(一般在100_110°C加热I小时)，冷却后将反应后的酸液与粉末一起离心，倒出上层酸液，取下层粉末，干燥，在干燥后的粉末里加入20 40ml细胞培养液，超声振荡30-60min，静置，取上层清液，所述混合酸由体积比为3 I 3.5 I的40%的氢氟酸与65%的硝酸组成。含3C_SiC纳米颗粒的培养液用于细胞培养时间可以视情况调节，由于无机材料不会被细胞内酶漂白，可以长时间培养，本实验选择的培养时间为24小时。本发明的有益效果是本发明首先使用无机纳米材料测量细胞内pH值的方法，测量的结果准确，材料制备简单，无毒并可用于长时间测量。本发明使用无机材料测量细胞内 PH值的方法，这种新材料在测量过程中不易被细胞内酶分解，可用于长时间测量，同时不与细胞内蛋白质结合，细胞毒性低。可以有效的克服有机荧光染料的不足，具有广阔的应用前
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图I——制备于培养液中的3C-SiC纳米颗粒的透射电镜照片。其中(b)图为高分辨图片；(C)图为电镜拍摄图片中纳米颗粒的尺寸分布。图2——360nm激发光下测量发光谱分解可得到表面H+和0H—离子键合的发光峰和带带复合的发光峰强度之比与PH值关系图。图3——巨噬细胞吞噬3C_SiC纳米颗粒后的光致发光谱和共聚焦显微镜照片，测量得到巨噬细胞内PH值为7. 3。其中(a)图为360nm激发光下测量巨噬细胞光致发光谱； (b)图为360nm激发光和白光下巨曬细胞的显微图像；(c)图为360nm激发光下巨曬细胞的显微图像；(d)图为白光背景下巨噬细胞的显微图像。图4——K562白血病细胞吞噬3C_SiC纳米颗粒后的光致发光谱和共聚焦显微镜照片，测量得到K562白血病细胞内pH值为7. 4。其中(a)图为360nm激发光下测量K562 白血病细胞光致发光谱；(b)图为360nm激发光和白光下K562白血病细胞的显微图像；(c) 图为360nm激发光下K562白血病细胞的显微图像；(d)图为白光背景下K562白血病细胞的显微图像。图5——仓鼠卵巢细胞吞噬3C_SiC纳米颗粒后的光致发光谱和共聚焦显微镜照片，测量得到仓鼠卵巢细胞内PH值为6. 7。其中(a)图为360nm激发光下测量仓鼠卵巢细胞光致发光谱；(b)图为360nm激发光和白光下仓鼠卵巢细胞的显微图像；(c)图为360nm 激发光下仓鼠卵巢细胞的显微图像；(d)图为白光背景下仓鼠卵巢细胞的显微图像。
具体实施例方式普通化学腐蚀所用酸为40%的氢氟酸与65%的硝酸，体积比为3 I。制备时称取3C-SiC粉末10g，加入以上混和酸IOOml中，在恒温浴槽100°C加热I小时。冷却后将反应后的酸液与粉末一起在高速离心机中离心，倒除上层酸液，取下层粉末，在烘箱中80°C左右进行干燥。在干燥后的粉末中加入20 40ml细胞培养液，超声振荡30分钟，静置数小时，取上层清液。此清液中即含有尺寸4nm左右的3C-SiC纳米颗粒。取IOml上述培养液稀释10倍，将此培养液用于细胞培养，选择的细胞为巨噬细胞、K562白血病细胞和仓鼠卵巢细胞三种细胞。24小时后将原培养液去除并加入新鲜不含 3C-SiC的培养液，测量此细胞溶液的光致发光。将得到的谱线分解，相应的发光强度比与对应的线性关系对照，得到细胞内PH值。
权利要求
1.一种利用3C-SiC纳米颗粒光致发光谱测量细胞内pH值的方法，其特征是将3C-SiC 纳米颗粒加入培养液中，逐渐改变培养液pH值同时在360nm激发光下测量溶液光致发光谱，将发光谱拟合可得到带带复合的发光峰和表面H+和0H_离子键合的发光峰，两峰强度比与pH值在5. 6-7. 4范围内呈线性关系。
2.根据权利要求I所述的利用3C-SiC纳米颗粒光致发光谱测量细胞内pH值的方法，其特征是用含有3C-SiC纳米颗粒的培养液培养细胞，培养后将细胞培养液换为不含 3C-SiC纳米颗粒的培养液，测量细胞溶液的光致发光谱，得到的发光峰强度比值代入线性关系即可得到细胞内PH值；含3C-SiC纳米颗粒的培养液的的浓度l_5mg的3C_SiC纳米颗粒/IOml细胞培养液。
3.如权利要求2所述的利用3C-SiC纳米颗粒光致发光谱测量细胞内pH值的方法，其特征是细胞培养时间为24小时左右，可根据情况调节培养时间，为使发光信号足够强，培养时间不得低于6小时。
4.如权利要求I中所述的利用3C-SiC纳米颗粒光致发光谱测量细胞内pH值的方法， 其特征是培养液中的3C-SiC纳米颗粒尺寸在4-7nm左右。
全文摘要
本发明涉及一种利用3C-SiC纳米颗粒光致发光谱测量细胞内pH值的方法，将3C-SiC纳米颗粒加入培养液中，逐渐改变培养液pH值同时在360nm激发光下测量溶液光致发光谱，将发光谱拟合可得到带带复合的发光峰和表面H+和OH-离子键合的发光峰，两峰强度比与pH值在5.6-7.4范围内呈线性关系。本发明使用无机材料测量细胞内pH值的方法，这种新材料在测量过程中不易被细胞内酶分解，可用于长时间测量，同时不与细胞内蛋白质结合，细胞毒性低。可以有效的克服有机荧光染料的不足，具有广阔的应用前景。
文档编号G01N21/63GK102590154SQ20121000664
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者吴兴龙, 沈剑沧, 郭俊宏 申请人:南京大学