专利名称：一种荧光定量rt-pcr检测丙型肝炎病毒的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测丙型肝炎病毒的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术快速、定量检测丙型肝炎病毒感染的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对血清或血浆样本中丙型肝炎病毒核酸RNA进行定量检测，适用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断和丙型肝炎病毒感染者药物治疗的疗效监测。
背景技术：
丙型肝炎Ofepatitis C virus, HCV)是一种隐匿性、传染性、持续性、进展性疾病，主要经血液传播的由丙型肝炎病毒感染引起的疾病，丙型肝炎慢性化率可高达50% 80 %，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)， 对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。丙型肝炎的感染呈世界性分布，是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因。据世界卫生组织统计，全球HCV 的感染率约为3 %，每年新发丙型肝炎病例约3. 5万例。中国CDC报告丙型肝炎病例在最近5年内翻了 5倍，总感染人数达4000万，且不能排除存在漏报的可能。我国血清流行病学调查资料显示，我国一般人群抗-HCV阳性率为3. 2%。各地抗-HCV阳性率有一定差异， 以长江为界，北方(3.6%)高于南方0.9%)，西南、华东、华北、西北、中南和东北分别为 2. 5%、2. 7%、3. 2%、3. 3%、3. 8%和4. 6%。抗-HCV阳性率随年龄增长而逐渐上升，由1岁组的2. 0%至50 59岁组的3. 9%。男女间无明显差异。HCV属于黄病毒科(flaviviridae)，其基因组为单股正链RNA，易变异，目前可分为6个基因型及不同亚型，按照国际通行的方法，以阿拉伯数字表示HCV基因型，以小写的英文字母表示基因亚型(如la、2b、3c等)。HCV基因1、2、3型呈全世界流行，并且是美洲、 欧洲和日本的主要基因型，其中基因1型还是流行最广泛的基因型，占所有HCV感染的70% 以上。中国的主要流行型是基因Ib型和加型，南方基本上都为Ib型，从南向北加型逐渐增多，至北方部分地区，Ib和加比例基本接近。Ia型散发于中原地区，2b型仅散见报道。HCV的传播途径包括经血液传播、性传播和母婴传播。(1)血液传播是主要的传播方式，主要有经输血和血制品传播。由于抗-HCV存在窗口期、抗-HCV检测试剂的质量不稳定及少数感染者不产生抗-HCV，因此，无法完全筛出HCV阳性者，大量输血和血液透析可能感染HCV ；经破损的皮肤和黏膜传播这是目前最主要的传播方式，在某些地区，因静脉注射毒品导致HCV传播占60% 90%。使用非一次性注射器和针头、未经严格消毒的牙科器械、内镜、侵袭性操作和针刺等也是经皮传播的重要途径。一些可能导致皮肤破损和血液暴露的传统医疗方法也与HCV传播有关；共用剃须刀、牙刷、纹身和穿耳环孔等也是HCV 潜在的经血传播方式。( 性传播与HCV感染者性交及有性乱行为者感染HCV的危险性较高。同时伴有其他性传播疾病者，特别是感染人免疫缺陷病毒(HIV)者，感染HCV的危险性更高。( 母婴传播近几年来，HCV母婴传播越来越受到人们的关注。抗-HCV阳性母亲将HCV传播给新生儿的危险性为2%，若母亲在分娩时HCV RNA阳性，则传播的危险性可高达4% 7% ；合并HIV感染时，传播的危险性增至20%。HCV病毒高载量可能增加传播的危险性。此外，还有部分HCV感染者的传播途径不明。HCV感染的常用的实验室检测包括血清生化学检测、抗-HCV检测、HCV RNA检测及基因型芯片检测等。1血清生化学检测ALT、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平变化可反映肝细胞损害程度，但ALT、AST水平与HCV感染引起的肝组织炎症分度和病情的严重程度不一定平行；急性丙型肝炎患者的 ALT和AST水平一般较低，但也有较高者。急性丙型肝炎患者的血清白蛋白、凝血酶原活动度和胆碱酯酶活性降低较少，但在病程较长的慢性肝炎、肝硬化或重型肝炎时可明显降低， 其降低程度与疾病的严重程度成正比。慢性丙型肝炎患者中，约30% ALT水平正常，约40% ALT水平低于2倍正常值上限。虽然大多数此类患者只有轻度肝损伤，但有部分患者可发展为肝硬化。ALT水平下降是抗病毒治疗中出现应答的重要指标之一。凝血酶原时间可作为慢性丙型肝炎患者病情进展的监测指标，但迄今尚无一个或一组血清学标志可对肝纤维化进行准确分期。2抗-HCV检测方法抗-HCV就是丙型肝炎病毒抗体。EIA(enzyme immunoassay)是指用酶标记抗体或抗抗体进行的抗原抗体反应。基本原理是先将已知的抗原或抗体结合在某种固相载体上， 并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗原或抗体发生反应，用洗涤方法分离抗原抗体复合物和游离成分，然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。测定抗-HCV的常用方法是间接法将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合，洗涤后，加入酶标抗抗体和底物进行测定。抗-HCV酶免疫法(EIA)适用于高危人群筛查，也可用于HCV感染者的初筛。 抗-HCV检测阳性提示感染丙肝病毒。但抗-HCV阴转与否不能作为抗病毒疗效的指标。对抗-HCV阳性结果的解释和评估要结合检测时所采用的方法、必要的补充实验、临床特点等综合进行分析。3HCVRNA的检测方法在HCV急性感染期，在血浆或血清中的病毒基因组水平可达到105 107拷贝/ml。在HCV慢性感染者中，HCV RNA水平在不同个体之间存在很大差异，变化范围在 5X 104 5X 106拷贝/ml之间，但同一名患者的血液中HCVRNA水平相对稳定。HCV RNA定性检测对抗-HCV阳性的HCV持续感染者，需要通过HCV RNA定性试验确证。HCV RNA定性检测的特异度在98%以上，只要一次病毒定性检测为阳性，即可确证 HCV感染，但一次检测阴性并不能完全排除HCV感染，应重复检查。HCV RNA定量检测定量聚合酶链反应(qPCR)、分枝DNA(bDNA)、实时荧光定量PCR 法均可检测HCV RNA病毒载量。国外HCV RNA定量检测试剂盒有PCR扩增的CcAas V2. 0、 SuperQuant、LCx HCV RNA 定量分析法等，但 bDNA 的 Versant HCVRNA 2. 0 和 3. 0 定量分析法应用较为广泛。国内的实时荧光定量PCR法已获得国家食品药品监督管理局(SFDA)的正式批准。不同HCV RNA定量检测法可用拷贝/ml和IU/ml两种表示方法，两者之间进行换算时，应采用不同检测方法的换算公式，如罗氏公司Cobas V2. 0的IU/ml与美国国立遗传学研究所的SuperQuant的拷贝数/ml换算公式是IU/ml = 0. 854X拷贝数/ml+0. 538。HCV病毒载量的高低与疾病的严重程度和疾病的进展并无绝对相关性，但可作为抗病毒疗效评估的观察指标。在HCV RNA检测中，应注意可能存在假阳性和假阴性结果。4基因型芯片检测技术基因芯片是微电子学和分子生物学结合的高新技术HCV基因分型的检测型芯片已逐步应用于临床。其基本原理是用生物信息学方法设计HCV 5' UTR型特异性探针。按设计模式，以自动化微阵列点样于APTES-PDC修饰的玻璃表面。用商品PCR试剂盒掺入荧光分子对患者血样本进行扩增，用激光共聚焦荧光扫描仪检测并分析结果。目前全世界范围内对HCV已克隆到的分离株可分为6个基因型(genotype)，约50 个亚型(subtype)。HCV基因型的检测对于研究HCV的流行病学、变异趋势、传播途径，尤其是对丙型肝炎患者判断病情、指导治疗、预测疗效及预后具有重要意义。综上所述，随着免疫学和分子生物学的发展，HCV诊断方法不但敏感性、特异性、重复性不断提高，而且操作日趋简便、正朝着自动化、标准化的方向发展。多种方法相互渗透、 扬长补短、结合应用，是发展的另一趋势。实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。一步法实时荧光RT-PCR技术是实时荧光 PCR 的一种(Yuqi Z, Min Y，Johann WM, et al. 2002. Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type IProviral DNA by Using TaqMan Technology.J Cli Microbiol. 40(2) :675-678 ；Drosten C, Seifried Ε, Roth WK, et al. 2001，TaqMan 5_-nuclease human immunodeficiency virus type 1 PCR assay with phage—packaged competitive internal control for high-throughput blood donor screening.J Clin Microbiol, 39 :4302-4308 ；Schuurman R, Descamps D, Weverling GJ, et al. 1996, Multicenter comparison of three commercial methods for quantification of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J Clin Microbiol, 34 :3016-3022 ； Christopherson C,Kidane Y,Conway B et al. 2000. PCR-based assay to quantify human immunodeficiency virus type 1 DNA in peripheral blood mononuclear cells. J Clin Microbiol, 38 :630-634.)，它是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR 相比，不同之处在于前者在反应体系中增加了逆转录酶，同时多了一个逆转录反应步骤；相同之处在于两者在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针，探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。实时荧光定量法首先对HCV靶核酸RNA逆转录(RT)，然后对其产物cDNA进行PCR 扩增。在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了 PCR从半定量到定量的飞跃， 而且与常规PCR相比，它具有特异性强、自动化程度高、有效解决了 PCR污染问题等特点。
本试剂盒采用TaqMan荧光探针技术，选取HCV基因组编码区的相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，其中目的荧光探针5’端标记荧光发射基团FAM，3’端标记非荧光淬灭基团BHQ1，利用荧光PCR检测仪可在FAM通道检测荧光信号。同时设置了内标质控系统，用于整个核酸提取和反应体系的质量控制。内标靶区域选取与HCV目标区域一致，并在探针位置人工合成了一段寡核苷酸，设计特异性荧光探针，与任何物种均无交叉反应，其中荧光探针5’端标记荧光发射基团HEX，并与内标质粒共同组成内标质控体系，可在 VIC通道检测荧光。对于待检物而言，若检测结果显示典型的S型荧光增长曲线，则为阳性标本，反之则为阴性。通过简单易操作的核酸提取系统，结合实时荧光PCR检测系统运行一步法RT-PCR扩增程序，本试剂盒实现了检测的高效率、高灵敏和高特异。
发明内容
本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测丙型肝炎病毒的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术快速、定量检测丙型肝炎病毒感染的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对血清或血浆样本中丙型肝炎病毒核酸RNA进行定量检测，适用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断和丙型肝炎病毒感染者药物治疗的疗效监测。其基本原理是利用荧光PCR技术，以HCV基因中相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，在样本核酸纯化之后，通过含有逆转录酶 (c-MMLV酶)、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂(RNasin)的一步法RT-PCR对HCV RNA进行快速定量检测。同时，试剂盒还带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值 (CT值)实现对未知样本的定量检测。为了实现本发明，我们采用了以下技术方案1)使用适当的核酸分析软件分别对已知的HCV基因的核苷酸序列进行同源性比较，在找出同源区段的基础上，进一步使用适当的引物设计软件选择并设计寡核苷酸引物和探针。由于所设计的引物和探针均具有互补于HCV基因的序列，而且与其他病原体的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点，所以避免了丙型肝炎病毒检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度。同时设置了内标质控系统，用于整个反应体系的质量控制。内标靶区域选取与HCV目标区域一致，并在探针位置人工合成了一段寡核苷酸，设计特异性荧光探针，与任何物种均无交叉反应。2)使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物和探针，用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’ 端标记作为荧光发生基团(报告基团)的6-FAM amidite和HEX，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联上作为荧光淬灭或抑制基团的BHQ1。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。 然后，使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20%)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。3)适宜于一步法RT-PCR扩增的反应体系。反应体系包括逆转录酶、热启动Taq酶、 2’-脱氧核苷三磷酸、RNA酶抑制剂(RNasin)、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、能够与内标核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的检测内标的寡核苷酸探针、 含有镁离子的缓冲液。同时设置了内标质控系统，用于整个核酸提取和反应体系的质量控制。4)从待测样本中提取核酸RNA，分别加入前述的反应体系中，直接经一步法 RT-PCR扩增，从荧光扩增曲线对未知样本的核酸RNA进行定量检测。基于以上技术方案发明的试剂盒包括(1)核酸提取试剂、HCV反应液A、HCV反应液B、HCV反应液C、HCV内标溶液、阴性质控品、HCV强阳性质控品、HCV临界阳性质控品、HCV 阳性定量参考品1-4，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。根据本发明的一个优选实施方案，其中PCR反应体系包括HCV反应液A、HCV反应液B和HCV反应液C。根据本发明的另一个优选实施方案，其中HCV反应液A(引物探针混合液)由正向引物、反向引物、目的寡核苷酸探针、内标寡核苷酸探针组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物分别是5，-CATGGCGTTAGTAYGAGTGTCG-3，(SEQ ID NO :1)禾口 5，-TCCYGGCAATTCCGGTGTAC-3，(SEQ ID NO :2)。根据本发明的另一个优选实施方案，其特征还在于用于靶多核苷酸扩增的寡核苷酸探针是 5，-X-TCCGCAGACCACTATGGCTCTCCCG-Y-3，(SEQ ID NO :3)，其中 X/Y 表示荧光标记基团，包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。根据本发明的另一个优选实施方案，其特征还在于用于靶多核苷酸扩增的引物探针浓度均为5 15pmol/人份，优选引物浓度为IOpmol/人份、探针浓度为5pmol/人份。根据本发明的另一个优选实施方案，引物探针混合液中用于内标多核苷酸扩增的寡核苷酸探针是 5，-X-TCCACGGCAACTCTAGTCGCCCTGC-Y-3，(SEQ ID NO :4)，其中 X/Y 表示荧光标记基团，包括能够与内标多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。根据本发明的另一个优选实施方案，其特征还在于引物探针混合液中用于内标多核苷酸扩增的探针浓度为3 IOpmol/人份，优选探针浓度为5pmol/人份。根据本发明的另一个优选实施方案，HCV反应液B由逆转录酶(c-MMLV酶)、热启动Taq酶、RNasin、dNTPs、酶稀释液组成。根据本发明的另一个优选实施方案，其特征还在于c-MMLV酶用量为1. 5 3. 5U/ 人份、热启动Taq酶用量为3 7U/人份、RNasin用量为15 25U/人份、dNTPs浓度为 0. 20mmol/L，酶稀释液为一般市售的酶稀释液。根据本发明的另一个优选实施方案，HCV反应液C包括一步法RT-PCR反应缓冲液和 DEPC 水，其中一步法 RT-PCR 反应缓冲液包含 10mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)、50mmol/L KC1、3. 0mmol/LMgCl2O根据本发明的一个优选实施方案，阴性质控品为阴性血浆，HCV强阳性质控品和HCV临界阳性质控品均为含有HCV目的片段的病毒样颗粒，且浓度分别为5. OX IO6 和5. OX 103IU/ml ；HCV阳性定量参考品1_4均为含有HCV目的片段的重组质粒，浓度为 1.0X IO4-L 0 X 107IU/ml ；质粒和病毒样颗粒均由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增的最佳反应温度和时间为50°C逆转录 15min，l 个循环；95°C 15min，1 个循环；最后 94°C 15s，55°C 45s，45 个循环收集荧光信号。根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的待检样品是血清或血浆等样品。本发明提供的一步法实时荧光RT-PCR试剂盒可以检测出丙型肝炎病毒的最低浓度为250IU/ml，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。本发明针对丙型肝炎病毒基因设计特异性引物和探针，检测的线性范围为 1.0X 103IU/ml 1.0X107IU/ml，与感染部位相同或感染症状相似的其他病毒(乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、EB病毒、人类疱疹病毒等)无交叉反应。试剂盒的灵敏度为 99. 47%，特异性为 98. 89%。本发明与现有技术相比，具有以下优点(1)使用一步法RT-PCR对HCV RNA进行快速定量检测，灵敏度，特异性大大提高。(2)全封闭反应，提取病毒核酸RNA以后，直接用于RT-PCR检测，避免了污染发生。(3)试剂盒带有内标物质，可以用于对核酸提取和PCR扩增的整个过程进行监控， 从而减少假阴性结果的出现。
图1显示HCV强阳性质控品、HCV临界阳性质控品、阴性质控品和HCV阳性定量参考品1-4的检测结果。HCV强阳性质控品、HCV临界阳性质控品扩增曲线有FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S型扩增曲线，且强阳性和临界阳性质控品的定值分别在 1.0X 106-2. 0X 107IU/ml 和 1. 0X 103_5. 0X 104IU/ml 范围内。；可明确判定为阳性。阴性质控品FAM检测通路扩增曲线无对数增长期，VIC检测通路扩增曲线为对数增长期；可明确判定为阴性。HCV阳性定量参考品1-4FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，呈典型 S型曲线，CT值< 40，且R2 ^ 0. 97，均符合质量控制判断标准。图2显示HCV RNA特异性参考品的检测结果。10份特异性参考品的扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。10选取正常人血清(N)和其他血源性病原微生物，包括乙型肝炎病毒(HBV)，人类免疫缺陷病毒-1 (HIV-I)，丁型肝炎病毒(HDV)，戊型肝炎病毒(HEV)，EB病毒(EBV)，人巨细胞病毒(HCMV)，梅毒螺旋体(TP)，单纯疱疹病毒1型(HSV-I)，单纯疱疹病毒2型(HSV-2)。图3显示灵敏度的检测结果。以企业参考品中的定量参考品L4(lX103IU/ml) 为基准，用正常人血清或血浆进行递减稀释，稀释的终浓度分别为1000IU/ml、500IU/ml、 250IU/ml、100IU/ml、50IU/ml。检测结果显示检出的HCV样本的最低浓度为250IU/ml。
具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。实施例1 丙型肝炎病毒试剂盒的检测方法(1)标本采集、运送和保存标本采集血清-用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温(22 25°C)放置30 60分钟，血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5分钟；吸取上层血清，转移至1. 5ml灭菌离心管。血浆-用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含EDTA_2Na(乙二胺四乙酸二钠)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5 10次，使抗凝剂与静脉血充分混勻，5 10分钟后即可分离出血浆，转移至1. 5ml灭菌离心管。标本保存和运送所采集的标本可立即用于测试，-20°C保存期为3个月；-70°C以下长期保存，应避免反复冻融。标本运送采用o°c冰壶。(2)核酸提取将待测样本与阴性质控品、HCV强阳性质控品、HCV临界阳性质控品进行同步处理。a).在1. 5ml的无菌离心管内加入50 μ 1的蛋白酶K ；b).取样本200 μ 1加入离心管中；c).再加入200 μ 1的裂解工作液(即已含Carrier RNA的病毒裂解液)，盖紧管盖，漩涡振荡15秒以充分混勻，高速离心10秒(防止温育时产生气泡)，72°C 10分钟。同时可将洗脱液置于72°C预热；d).再加入250 μ 1无水乙醇，盖紧管盖，振荡15秒；e).将混合液全部吸至离心柱，室温下12，OOOrpm离心1分钟，将离心柱装至新的
收集管；f).将500 μ 1的抑制物去除液加入离心柱，室温下12，OOOrpm离心1分钟，将离心
柱装至新的收集管；g).将500 μ 1的去离子液加入离心柱，室温下12，OOOrpm离心1分钟，将离心柱装
至新的收集管；h).再次将500 μ 1的去离子液加入离心柱，室温下12，OOOrpm离心1分钟，将离心
柱装至新的收集管；i).将离心柱-收集管于室温下14，OOOrpm离心3分钟以除去残余的乙醇；j).将离心柱取出，放置于新的1. 5ml离心管。打开离心柱盖子，72°C放置2分钟 (使用干式恒温器，不能使用水浴锅)；k).在离心柱的膜的正上方小心加入72°C预热的洗脱液50 μ 1，盖紧离心柱管盖， 室温静置1分钟后，14，OOOrpm离心1分钟。离心管内即为病毒核酸溶液，建议立即使用，如需保存，置于_20°C。(3) PCR 检测a)配制体系将2μ1 HCV反应液Α，3μ1 HCV反应液B，25 μ 1 HCV反应液C充分混合，然后分装30 μ 1至每个PCR反应管。b)加样往上述HCV反应管中分别加入提取后的待测样本核酸、阴性质控品、HCV强阳性质控品、HCV临界阳性质控品和直接加入HCV阳性定量参考品20 μ 1。盖紧管盖，8，OOOrpm离心数秒后转移至PCR扩增仪。扩增程序设置
ABI7300/7500荧光PCR扩增仪的参数设置如下Reporter Dyel :FAMQuencher Dye :noneReporter Dye2 :VICQuencher Dye :nonePassive Reference :noneLightCycler480荧光PCR扩增仪的参数设置如下“Customizes”模块中选择 FAM083-533)和 VIC(523-568)滤片组合，扩增温度参数统一设置如下50 "C 15 分钟；95 "C 15 分钟；45个循环(94°C 15秒一55°C 45秒)，荧光检测选择在55°C 45秒这一环节；保存文件，运行。(4)结果分析反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Basel ine的Mart值、End值以及 Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Mart值可以在3 15、End值可设在5 20，在Log图谱窗口设置Threshold的Value值，使基线位于扩增曲线指数期，调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis自动获得分析结果，在Iteport界面察看结果，记录未知样本数值(C)。(5)结果判定如果FAM检测通道无对数增长期，且在VIC检测通道有对数增长期，则判样品的 HCV RNA浓度小于检测灵敏度。如果FAM荧光信号增幅明显，扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S型曲线，且Ct 值<45，则按以下方法判断若样品的C < 1. 00E+003,则该样品的 HCV RNA 浓度< 1 X 103IU/ml ；若样品的1. 00E+003 彡 C 彡 1. 00E+007,则该样品的 HCV RNA 浓度=CIU/ml ；若样品的C > 1. 00E+007,则该样品的HCV RNA浓度> 1 X 107IU/mlo如果需要精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测。则该样品的HCV RNA浓度 =(CX稀释倍数)IU/ml。实施例2 丙型肝炎病毒试剂盒中质控品及阳性定量参考品的使用丙型肝炎病毒试剂盒中质控品及阳性定量参考品包括HCV强阳性质控品，HCV临界阳性质控品，阴性质控品和HCV阳性定量参考品1-4，用于临床试验中质量控制，操作方法同待检样本。质量控制阴性质控品FAM检测通路扩增曲线无对数增长期，VIC检测通路扩增曲线为对数增长期；HCV阳性质控品FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S型扩增曲线，且强阳性和临界阳性质控品的定值分别在1. O X 106-2. 0 X 107IU/ml和 1.0X 103-5. 0X 104IU/ml 范围内。
HCV阳性定量参考品FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S型曲线， CT 值< 40，且 R2 彡 0. 97 ；以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。检测结果(见附图1)阴性质控品的扩增曲线不呈S型，阳性质控品的扩增曲线为明显S型曲线，HCV阳性定量参考品1-4FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S型曲线，阴、阳性质控品和HCV阳性定量参考品1-4均符合试剂盒的质控要求，因此待检标本的检测结果是有效的。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种荧光定量RT-PCR检测丙型肝炎病毒的试剂盒，试剂盒包括(1)核酸提取试剂、 HCV反应液A、HCV反应液B、HCV反应液C、HCV内标溶液、阴性质控品、HCV强阳性质控品、 HCV临界阳性质控品、HCV阳性定量参考品1-4，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR反应体系包括HCV反应液A、HCV反应液B和HCV反应液C，其特征在于HCV 反应液A (引物探针混合液)中正向和反向引物分别是5’ -CATGGCGTTAGTAYGAGTGTCG-3’ (SEQ ID NO 1) 5，-TCCYGGCAATTCCGGTGTAC-3，(SEQ ID NO 2)；HCV 反应液 A 寡核苷酸探针是 5，-X-TCCGCAGACCACTATGGCTCTCCCG-Y-3，(SEQ ID NO:3)，其中X/Y表示荧光标记基团，包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针；HCV 反应液 A 中寡核苷酸探针是 5，-X-TCCACGGCAACTCTAGTCGCCCTGC-Y-3，(SEQ ID NO:4)，其中Χ/Υ表示荧光标记基团，包括能够与内标多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。
2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于正、反向引物的浓度均为IOpmol/人份，目的寡核苷酸探针、内标寡核苷酸探针的浓度均为5pmol/人份。
3.根据权利要求1的试剂盒，HCV反应液B由逆转录酶(c-MMLV酶)、热启动Taq酶、 RNasin、dNTPs、酶稀释液组成，其中c-MMLV酶用量为1. 5 3. 5U/人份、热启动Taq酶用量为3 7U/人份、RNasin用量为15 25U/人份、dNIPs浓度为0. 20mmol/L,酶稀释液为一般市售的酶系稀释液。
4.根据权利要求1的试剂盒，HCV反应液C包括一步法RT-PCR反应缓冲液和DEPC水， 其中一步法 RT-PCR 反应缓冲液包含 10mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)、50mmol/L KC1、3. Ommo 1/ LMgCl2。
5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增的最佳反应温度和时间为50°C 逆转录15min，l个循环；95°C 15min，1个循环；最后94°C 15s，55°C 45s，45个循环收集荧光信号。
6.根根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于阴性质控品为阴性血浆，HCV强阳性质控品和HCV临界阳性质控品均为含有HCV目的片段的病毒样颗粒，且浓度分别为5. 0 X IO6 和5. OX 103IU/ml ；HCV阳性定量参考品1_4均为含有HCV目的片段的重组质粒，浓度为 1.0X IO4-L 0 X 107IU/ml ；质粒和病毒样颗粒均由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。
7.根根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于试剂盒的待检样品是血清或血浆等样品
全文摘要
本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测丙型肝炎病毒的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术快速、定量检测丙型肝炎病毒感染的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对血清或血浆样本中丙型肝炎病毒核酸RNA进行定量检测，适用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断和丙型肝炎病毒感染者药物治疗的疗效监测。
文档编号G01N21/64GK102559930SQ20121001439
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月16日 优先权日2012年1月16日
发明者丁渭, 李明, 陈华云 申请人:中山大学达安基因股份有限公司