专利名称：含重组蛋白混合物的牛结核病检测试剂的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫检测技术领域。本发明涉及用于牛分支杆菌感染检测的新型试剂盒及方法。
背景技术：
牛结核病(BovineTuberculosis)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)感染引起的一种人畜共患的慢性传染病，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染也可引起。世界各国均有发生，危害十分严重，给畜牧业带来巨大的经济损失和贸易限制，目前世界范围内约有5000万头牛感染了结核病，每年因此损失30多亿美元。该病能通过未经巴氏消毒的奶及奶制品、接触污染的气溶胶或者动物尸体等传染给人，从而严重威 胁着公共卫生安全及人类健康，因此具有非常重要的公共卫生意义。世界卫生组织(WHO)指出“在存在牛结核病的国家，人类始终受到威胁，除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的。”目前，一些较发达国家和地区，如美国、澳大利亚和北欧等已基本消灭了牛结核病。但牛结核病在我国依然是最常见的多发性疾病之一，1985年和1987年两次全国奶牛抽样调查结果显示，牛结核病的患病率分别达5. 83%和5. 43%ο近年来，随着个体养牛户的增加，结核病的阳性检出率正逐年上升。目前我国一些省区牛结核病的发病率已达10. 18%以上，甚至更高。牛结核菌素皮内变态反应试验(GB/T 18646)为世界动物卫生组织(OIE)规定的牛结核病检验的标准方法。结核菌素又称为纯化蛋白衍生物(purified proteinderivatives, PPD)，是将牛型或禽型分枝杆菌菌株接种适宜培养基培养，收获培养物，经灭活、滤过除菌、提纯或浓缩制成，其实际上是牛型或禽型分枝杆菌菌株在液体培养基中生长时产生的代谢物质，含有多种抗原成分，其中部分的抗原在禽分枝杆菌、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌及非致病性环境分枝杆菌中广泛存在，致使pro检验的特异性较差，在实际检测时容易出现假阳性，而且pro生产工艺复杂，生产过程中需要培养具有毒力的牛分枝杆菌，很难保证其安全性及各批次间pro质量的稳定。90年代后期国外发展起来的以PF1D为抗原的Y-干扰素(interferon-Y, IFN- Y )释放试验明显提高了牛分枝杆菌检测的灵敏性，其原理为致敏的外周血淋巴细胞在体外培养过程中，通过特异抗原(如PPD)刺激后被活化，从而高水平表达并分泌IFN- Y，通过相应的技术手段对培养上清中IFN-Y的释放水平进行检测(如ELISA)从而判断其是否感染，其结果与淋巴细胞增生试验具有很好的相关性。该方法避免了对机体的侵入性实验，可以短时间内多次重复实验，同时也摒弃了结核菌素试验中操作和判断上的主观性，因此具有非常广泛的应用前景，已在澳大利亚、新西兰等国家进行了大量的田间试验，目前国外已将该类牛结核病检测试剂盒商品化，并被OIE所推荐使用，但因使用PH)作为刺激原，在实际使用过程中不可避免出现假阳性。为了提高牛分枝杆菌检测特异性，国内外学者开始利用基因重组技术，重组表达了牛分枝杆菌的多种特异性蛋白，例如6kDa早期分泌性抗原性祀(The early secretedantigenic target6ku protein ESAT-6)、MPB-64、MPB-70、MPB-63、热休克蛋白 65 (Heatshock protein 65, HSP-65)、抗原 85B (antigen 85B, Ag_85B)、IOkDa 的培养滤液抗原(IOkDa culture filtrate antigen, CFP-10)等。然后，用这些重组蛋白中的一种或者多种混合(又称“鸡尾酒法”)作为包被抗原进行酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay,ELISA)检测,通过检测牛血清中相应的抗体水平进行牛结核病的血清学检测，该方法虽然一定程度上提高了检测的特异性，但其敏感性不够理想，特别是感染早期及免疫低下者常出现假阴性。因此，研究更加敏感、特异的牛结核病新型检测抗原和检测方法，是控制牛结核病当务之急。本发明人通过基因重组技术表达了牛分枝杆菌的多种特异性蛋白，并将其进行组合，使得刺激原克服了 Pro的缺点，具有了生物安全、组分明确、含量稳定、成本低廉的优点。用多个重组蛋白进行组合作为刺激原替代PF1D进行皮内变态反应实验和IFN-Y释放试验进行了反复研究，将两种方法结合，很好地提高了实验特异性的同时，也克服了单一抗原或“多抗原鸡尾酒”血清学检测敏感度不高等缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供用于牛分枝杆菌感染检测的新型试剂及方法。本发明的发明原理为由于在皮内变态反应和Y-IFN释放试验中使用传统的PPD作为刺激原时，存在着成分复杂，特异性差的缺点，而现有用来替代pro作为刺激原的重组牛结核杆菌蛋白的敏感性不理想。本发明选择重组表达了牛分枝杆菌的三种特异性蛋白质CFP-10, ESAT-6和TB10. 4，CFP-10和ESAT-6属于同一个基因家族，具有相同的操纵子，两基因方向一致，共用一个启动子，协同表达，CFP-10的C端与ESAT-6相连，形成紧密的异二聚体结构，这种结构与细菌致病性和毒力有关，TB10.4蛋白是ESAT-6家族蛋白之一，其基因仅存在于结核杆菌复合体中，能诱导机体产生较强的Thl型免疫应应，该蛋白可以被结核患者和BCG免疫个体强烈识别(70% )，并且识别的个体会产生高水平的IFN- Y，因此该蛋白作为检测抗原使用会大大提高检测的敏感性。本发明尝试用这些重组蛋白或其混合物替代pro作为刺激原，检测牛分枝杆菌感染。本发明提供了一种用于牛分枝杆菌感染检测的试剂，该试剂包括两种或三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白的混合物，该重组蛋白混合物能够有效刺激牛分枝杆菌感染动物产生DTH反应及刺激感染动物外周血淋巴细胞释放IFN- Y。在本发明的一个实施方案中，所述试剂包括选自CFP-10、ESAT-6和TB10.4中的两种或三种牛分枝杆菌蛋白的混合物。在本发明的优选实施方案中，所述试剂包括重组表达的牛分枝杆菌蛋白CFP-10、ESAT-6和TB10. 4的混合物。三种重组蛋白CFP-10、ESAT-6和TB10. 4的混合比例为I 2 I 2 I 2，包括但不限于I : I : 1、2 : 2 : I和I : I : 2，其中优选为I : I : I。在本发明的一个具体实施方案中，所述三种重组蛋白CFP-10、ESAT_6和TB10. 4的编码基因分别具有SEQ ID NO: I、SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。 本发明对所述三种重组蛋白及其混合物进行了皮内变态反应和IFN-Y释放试验，实验结果证明(I)本发明所述重组蛋白的混合物作为刺激原时，其检测的特异性和灵敏度优于pro作为刺激原的皮内变态反应试验和IFN- y释放试验；(2)本发明所述重组蛋白的混合物作为刺激原时，其检测的特异性和灵敏度优于单一重组蛋白；(3)重组蛋白混合物作为刺激原时，其检测的特异性和灵敏度优于相同蛋白的串联共表达产物。在各种不同成分不同比例的重组蛋白混合物中，由CFP-10、ESAT_6和TB10. 4三种成分等比例混合的混合物作为刺激原进行IFN-Y释放试验时，能特异性的检测牛分枝杆菌感染牛，且敏感度最高，最小刺激量可达10 μ g/ml。另一方面，本发明提供了用于制备牛分枝杆菌感染检测试剂的引物，其中包括3对引物，其中第一引物对的核苷酸序列为SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:5，第二引物对的核苷酸序列为SEQ ID N0:6和SEQ ID NO: 7，第三引物对的核苷酸序列为SEQ ID N0:8和SEQ IDN0:9。另一方面，本发明提供了所述引物在在制备牛分枝杆菌感染检测或诊断试剂中的用途。另一方面，本发明提供了一种制备牛分枝杆菌感染检测试剂的方法，该方法包括
(a)PCR扩增获得CFP-10、ESAT-6和TB10. 4的编码基因；(b)重组表达步骤(a)获得的编码基因得到3种重组蛋白；(c)将步骤(b)获得的3种蛋白按比例混合得到牛分枝杆菌感染检测试剂。在一个实施方案中，PCR扩增所用3对引物的核苷酸序列分别为SEQ ID N0:4和SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO: 7 以及 SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9。在一个实施方案中，PCR扩增的CFP-10、ESAT-6和TB10. 4编码基因的核苷酸序列为 SEQ ID NO:I、SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3。在一个实施方案中，其中步骤(b)中的重组表达的具体操作为将含SEQ ID NO: I、SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:3的重组质粒PET分别转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落接种至IOmL含终浓度25 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C 200r/min震荡培养过夜，将Iml培养物接种于IOOml含终浓度25 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，370C 200r/min震荡培养至0D600nm=0. 6时，加入终浓度为ImM的IPTG，22°C，160rpm震荡培养 IOh0 6000r/min 离心 IOmin 收集菌体，用 40mL PBS(pH7. 4)洗涤两次，IOml PBS(pH7. 4)重悬后，冰浴超声破碎菌体，破碎后混合物经12000rpm，4°C离心30min后取上清。蛋白上清液经φ0.22μ 滤膜过滤，用金属镍亲和层析柱按操作手册在蛋白纯化仪进行纯化，并用脱盐层析柱进行脱盐，将重组蛋白置换到PBS (ρΗ7. 4)缓冲溶液中。在一个实施方案中，其中步骤(C)中的混合比例混合比例为广2 Γ2 广2，包括但不限于I : I : 1、2 : 2 : I和I : I : 2，其中优选为I : I : I。另一方面，本发明提供了一种用于检测牛分支杆菌感染的方法，该方法包括下述步骤a)在牛的颈部上1/3处剃毛，并用游标卡尺测量该部位的皮肤厚度；b)在剃毛部位用Iml注射器皮内注射O. Iml终浓度为O. 5mg/ml的本发明所述的重组蛋白混合物；c)注射72h后，游标卡尺测量注射部位的皮肤厚度，并计算该部位注射前后的皮厚差。该方法的判断标准为当皮厚差小于2mm时判定为阴性，皮厚差> 2mm时判定为牛分枝杆菌感染阳性。
另一方面，本发明还提供了一种用于检测牛分支杆菌感染的方法，该方法包括a)采集IOml肝素锂抗凝血，以O. 75ml/孔的剂量将其分装于48孔细胞培养板，一孔加入终浓度为I μ g的本发明所述的重组蛋白混合物，另一孔加入等摩尔量的PET (pET32a(+)空载体的标签蛋白)蛋白。b)37°C培养24h，收集上层血浆作为待检样品。c)用ELISA方法检测血浆样品中牛IFN-Y的释放水平。其中步骤c)中所述的用ELISA检测待检血浆样品中牛IFN-Y释放水平的具体操作为①用ELISA包被缓冲液将IFN-Y单抗稀释至蛋白质含量为20μ8/πι1，每孔酶标板加入100μ 1，4°C过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(PBST)洗板3次，每次3min，②每孔酶标板先加入50 μ I样品稀释液，再加入50 μ I待检样品(同时做空白对照，阴性对照及阳性对照孔)至含有样品稀释液的孔中，混匀，封板，37°C孵育lh，③用洗涤缓冲液洗板3次，每次3min，④各反应孔中加入100 μ I新鲜配制的辣根过氧化物酶标记兔抗牛二抗，37°C孵育lh，⑤用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min，⑥各反应孔中加入100 μ I新鲜配制的底物溶液，37°C，避光孵育30min (从加入底物至第一个孔中时开始计时)，⑦各反应孔中加入50 μ I终止液，轻轻摇动混匀。按照与加入底物相同的顺序、相同的速度加入终止液，终止后5min内读出OD45tol值，以620_650nm作为参照波长。该方法的判断标准为当待检血浆样品OD45tlnm值-PET对照的OD45tol值≥O. 1，判为阳性，反之，则判为阴性。
图I.牛分枝杆菌特异性蛋白PCR扩增产物电泳结果。泳道M DL2000plus分子量Markwer ;泳道1 :CFP_10基因产物；泳道2 :ESAT_6PCR扩增产物；泳道3 TB10. 4PCR扩增产物。图2.重组蛋白SDS-PAGE电泳结果。泳道I :pET_32a(+)空载体标签蛋白(PET)纯化产物对照；泳道2 =CFP-IO重组蛋白纯化产物；泳道3 ESA-6重组蛋白纯化产物；泳道4 TB10. 4重组蛋白纯化产物。图3.重组蛋白的B细胞活性检测结果，每个圆点表示同一份样本的两个重复检测结果的平均值。图4. CFP-10和ESAT-6分别作为皮内变态反应试验刺激原的作用效果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差。图5. CFP-10与ESAT-6等比例混合或串联作为皮内变态反应试验刺激原的作用效果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，AB代表CFP-10与ESAT-6等比例混合，⑶代表CFP-10与ESAT-6串联表达的融合蛋白CFP10/ESAT-6。图6.重组蛋白TB10. 4作为CFP-10和ESAT-6的补充抗原的作用效果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，AB代表CFP-10与ESAT-6等比例混合，ABT代表CFP-10、ESAT-6及TB10. 4三者等比例混合。图7.三种重组蛋白以不同混合方式作为皮内变态反应试验刺激原的作用效果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，ABT代表CFP-10、ESAT-6和TB10. 4等比例混合，⑶T代表串联表达CFP-10/ESAT-6与TB10. 4以2:1的比例混合。图8.重组蛋白ABT混合物的剂量筛选结果。每个点代表一个动物某注射部位的
皮厚差。
图9.重组蛋白的混合比例筛选。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，ABTl代表重组蛋白CFP10、ESAT-6及TB10.4以I I I混合，ABT2代表重组蛋白CFP10、ESAT_6及TB10. 4以I : I : 2混合。图10.载体标签蛋白PET作为皮内变态反应试验刺激原检测结果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，PET代表载体标签蛋白。图11.重组蛋白ABT混合物作为皮内变态反应试验刺激原检测牛结核阴性牛结果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，ABT代表CFP-10、ESAT-6和TB10. 4等比例混合作为刺激原，蛋白终浓度为O. 5mg/mL·图12.重组蛋白ABT混合物作为皮内变态反应试验刺激原临床检测结果。每个点代表一个动物某注射部位的皮厚差，左图代表检测的72头结核病阳性牛数据，右侧图为
131头结核病阴性牛数据。本发明的优点本发明的检测牛分枝杆菌感染的新型检测试剂具有特异性高、生物安全、组分明确、含量稳定、成本低廉、可标准化生产等优点，本发明的含重组蛋白混合物的牛结核病检测试剂及检测方法克服了牛分枝杆菌血清学检测方法和以pro为刺激原的皮内变态反应试验及IFN-Y释放试验的不足，具有较强的的特异性和敏感性，因此可用于牛结核病的临床检测。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件例如SambiOOk等人，分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。
实施例实施例I 重组质粒 PET-ESAT-6、PET-CFP-10 和 PET-TB10· 4 的构建I. I牛分枝杆菌基因组DNA的提取用M. bovis Vallee III菌株(中国兽医药品监察所提供)培养物，参照细菌基因组DNA小量快速提取试剂盒(购自北京博大泰克基因技术有限责任公司)产品说明书所述方法进行。I. 2引物的设计根据GenBank 中 M. bovis AF2122/97 基因组 DNA(登录号为 BX248333)的 CFP-10、ESAT-6和TB10. 4基因序列设计特异性引物，上游引物携带Bam H I酶切位点，下游引物携带Hind III酶切位点，引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物的核苷酸序列见表1(下划线处为保护性碱基及酶切位点)。表IPCR引物名称、序列及扩增产物的大小
权利要求
1.一种用于牛分枝杆菌感染检测的试剂，该试剂包括三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白的混合物，其中所述的三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白为CFP-10、ESAT-6和TB10. 4。
2.权利要求I所述的用于牛分枝杆菌感染检测的试剂，其中所述三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白的混合比例为广2 Γ2 Γ2
3.权利要求2所述的用于牛分枝杆菌感染检测的试剂，其中所述三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白的混合比例为I : I : I或2 : 2 : I或I : I : 2。
4.权利要求I至3中任一项所述的用于牛分枝杆菌感染检测的试剂，其中所述三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白CFP-10、ESAT-6和TB10. 4编码基因的核苷酸序列分别为SEQ IDNO:I、SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3。
5.用于制备牛分枝杆菌感染检测试剂的引物，其中包括3对引物，其中第一引物对的核苷酸序列为SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:5，第二引物对的核苷酸序列为SEQ ID N0:6和SEQ ID NO:7，第一引物对的核苷酸序列为SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9。
6.权利要求5所述的引物在制备牛分枝杆菌感染检测或诊断试剂中的用途。
7.一种制备牛分枝杆菌感染检测试剂的方法，该方法包括 Ca)用权利要求5所述的引物PCR扩增获得3种编码基因； (b)重组表达步骤(a)获得的编码基因得到3种重组蛋白； (c)将步骤(b)获得的3种蛋白按比例混合得到牛分枝杆菌感染检测试剂。
8.权利要求7所述的制备牛分枝杆菌感染检测试剂的方法，其中步骤(a)中的3种编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:USEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3。
9.权利要求7或8所述的制备牛分枝杆菌感染检测试剂的方法，其中步骤(b)中的重组表达的具体操作为将含SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的重组质粒PET分别转化至E. coli BL21 (DE3)感受态细胞中，挑取单菌落接种至IOmL含终浓度25 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C 200r/min震荡培养过夜，将Iml培养物接种于IOOml含终浓度25 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C 200r/min震荡培养至OD6tltl nm=0.6时，力口入终浓度为ImM的IPTG，22°C，160rpm震荡培养10h。6000r/min离心IOmin收集菌体，用40mL PBS (pH7. 4)洗涤两次，IOml PBS (pH7. 4)重悬后，冰浴超声破碎菌体，破碎后混合物经12000rpm, 4°C离心30min后取上清,蛋白上清液经φ0.22μηι滤膜过滤，用金属镍亲和层析柱纯化，并用脱盐层析柱进行脱盐，将重组蛋白置换到PBS (ρΗ7. 4)缓冲溶液中。
10.一种用于检测牛分支杆菌感染的方法，该方法包括(a)剃毛后测量牛颈部上1/3处皮肤厚度；(b)向测量部位施用权利要求I至4任一项所述的诊断试剂；(b) 72小时后，再测皮肤厚度，并计算该部位注射前后的皮厚差；当皮厚差大于等于2毫米时，判定为牛结核阳性，反之则为阴性。
全文摘要
本发明属于免疫检测领域。本发明提供了牛分枝杆菌感染检测的试剂及方法。所述检测试剂包括作为特异性刺激原的重组蛋白混合物，该蛋白混合物能够刺激牛分枝杆菌感染动物产生DTH反应及刺激外周血淋巴细胞释放IFN-γ。本发明的检测试剂克服了现有技术的缺陷，具有较强的灵敏度和特异性，并且生物安全好、成本低廉、可标准化生产，因而能有效用于牛结核病的临床检测。
文档编号G01N33/531GK102707052SQ201210147678
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月11日 优先权日2012年5月11日
发明者侯绍华, 朱鸿飞, 袁维峰, 贾红, 郭晓宇, 鑫婷 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所