专利名称：一种d二聚体检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种检测人D ニ聚体的检测试剂盒。
背景技术：
纤维蛋白溶解系统是人体最重要的抗凝系统。当纤维蛋白凝结块形成吋，纤维蛋白溶解过程开始，并将纤维蛋白凝结块溶解形成各种可溶片段，Dニ聚体即是其中最重要的可溶性片段之一。人体纤溶系统，它对保持血管壁的正常通透性，維持血液的流动状态和组织修复·起着重要作用。Dニ聚体血浆中水平增高说明存在继发性纤溶过程。溶栓治疗是指用药物来活化纤维蛋白溶解系统。一般为投入一种纤溶酶原活化物如尿液酶、链激酶或组织型纤溶酶原活化物，使大量纤溶酶生成，从而加速已形成血栓的溶解。D ニ聚体生成，则表明达到溶栓效果。纤溶蛋白降解产物中，唯D ニ聚体交联碎片可反映血栓形成后的溶栓活性。因此，理论上，D ニ聚体的定量检测可定量反映药物的溶栓效果、及可用于诊断、筛选新形成的血栓。D ニ聚体是测定纤溶系统主要因子，对于诊断与治疗纤溶系统疾病及与纤溶系统有关疾病以及溶栓治疗监测，有着重要的意义。D ニ聚体是深静脉血栓(DVT)，肺栓塞(PE)，弥漫性血管内凝血(DIC)的关键指标。自从1971年Wilson等首先将纤维蛋白降解产物用于临床诊断以来，D ニ聚体的检测在诊断肺动脉栓塞方面发挥了巨大的作用，随着研究的开展和深入，临床工作者对D ニ聚体的意义认识日益深刻。D ニ聚体測定方法很多，包括(一)放射免疫測定法(RIA)、(ニ)酶联免疫測定法(ELISA)、(三)乳胶凝集试验和免疫比浊法、(四)荧光免疫測定法、(五)滴金免疫法。这些方法具有操作繁琐、耗时长、过度浪费资源的缺点，不适于常规检验。
发明内容
本发明的目的是提供ー种D ニ聚体的检测试剂盒。该试剂盒可直接应用于全自动生化分析仪上，结果准确性强、试剂稳定性好、使用方便、便于大規模推广。本发明的另ー目的是提供上述检测试剂盒的生产制备及使用方法。为实现上述目的，本发明提供的试剂盒组成为
试剂Rl :缓冲液、聚こニ醇、叠氮钠、こニ胺四こ酸钠、牛血清白蛋白；
试剂R2 :缓冲液、结合有D ニ聚体单克隆抗体的乳胶粒子、吐温-20、叠氮钠、こニ胺四こ酸钠、牛血清白蛋白。本发明提供的上述试剂盒的制备方法及操做步骤如下
(a)按下列比例配制好试剂试剂Rl
Tris 缓冲液 200-220mmol/L 聚こニ醇5-10 mmol /I,
叠氮钠1-5 mmol/L
こニ胺四こ酸钠l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l-5mmol/L ;
试剂R2
Tris 缓冲液 200-220mmol/L
结合有D ニ聚体单克隆抗体的乳胶粒子 3. 5-5% (v/v)
吐温-20l-5mmol/L
叠氮钠0. 5-3 mmol/L
こニ胺四こ酸钠l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l_5mmol/L
(b)将试剂与待测样本按一定比例混合，使其完全反应；
(c)用半/全自动生化分析仪测定吸光度变化值；
Cd)根据吸光度变化值计算出样本中D ニ聚体的浓度。
具体实施例方式下述实施例是为了更详细的解释本发明，但不应理解为本发明局限于此。实施例I :
本发明的试剂盒举例是双试剂，其中
试剂Rl
Tris 缓冲液 200mmol/L 聚こニ醇8 mmol /I,
叠氮钠5 mmol/L
こニ胺四こ酸钠5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L ;
试剂R2
Tris 缓冲液 200mmol/L
结合有D ニ聚体单克隆抗体的乳胶粒子 5% (v/v)
吐温 _20Smmol /I,
叠氮钠3 mmol/L
こニ胺四こ酸钠5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L。实施例2 :试剂盒使用方法。I.试剂准备，试剂为液体双试剂，开瓶即用，其中
试剂Rl
Tris 缓冲液 200mmol/L 聚こニ醇8 mmol /I,叠氮钠5 mmol/L
こニ胺四こ酸钠5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L ;
试剂R2
Tris 缓冲液 200mmol/L
结合有D ニ聚体单克隆抗体的乳胶粒子 5% (v/v)
吐温 _20Smmol /I,·
叠氮钠3 mmol/L
こニ胺四こ酸钠5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L。2.全自动生化仪參数设置
(a)检测温度37°C
(b)检测波长主波长为570nm；
(c)反应时间8分钟，其中，温育时间5分钟，反应时间10秒钟，检测时间3分钟。3.检测步骤(全部在全自动生化分析仪中完成)
(a)取150ii L试剂I和7 ii L血清样本混匀；
(b)将混匀后的溶液在37°C温育5分钟；
(c)再添加50ii L试剂2，反应10秒钟后，在570nm下监测3分钟的吸光度变化值。4.通过吸光度变化值计算出D ニ聚体的浓度。本发明具有的优点
该试剂盒结果准确性强、试剂稳定性好、使用方便、便于大规模推广。所需检测仪器(生化分析仪)在各大医院和检测中心普遍使用。
权利要求
1.一种D 二聚体检测试剂盒，其组成为试剂R1、试剂R2， 其中 a、试剂Rl 包括200-220mmol/L Tris 缓冲液、5-10 mmol/L 聚乙二醇、1_5 mmol/L 叠氮钠、l-5mmol/L乙二胺四乙酸钠、l_5mmol/L牛血清白蛋白； b、试剂R2200-220mmol/L Tris缓冲液、结合有D 二聚体单克隆抗体的乳胶粒子、l_5mmol/L 吐温 _20、0. 5-3 mmol/L 叠氣纳、l_5mmol/L 乙二胺四乙酸纳、l-5mmol/L 牛血清白蛋白。
2.权利要求I的试剂盒，其特征在于试剂R2中的D二聚体单克隆抗体的乳胶粒子的制备方法为10. 5mg/ml的D 二聚体单克隆抗体与10%的乳胶颗粒(直径50_100nm)，加入到200-220mmol/L Tris缓冲液中，震荡反应4小时，离心去上清，再用200-220mmol/L Tris缓冲液稀释至O. 5%，并加入O. 1-0. 3 mmol/L叠氮钠。
3.上述试剂盒的制备和操作方法，主要步骤为 (a)按下列比例配制好试剂 试剂Rl Tris 缓冲液 200-220mmol/L 聚乙二醇5-10 mmol /I, 叠氮钠1-5 mmol/L 乙二胺四乙酸钠l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l_5mmol/L 试剂R2 Tris 缓冲液 200-220mmol/L 结合有D 二聚体单克隆抗体的乳胶粒子 3. 5-5% (v/v) 吐温-20l-5mmol/L 叠氮钠0. 5-3 mmol/L 乙二胺四乙酸钠l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l_5mmol/L (b)将试剂与待测样本按一定比例混合，使其完全反应； (c)用半/全自动生化分析仪测定吸光度变化值； Cd)根据吸光度变化值计算出样本中D 二聚体的浓度。
4.权利要求3的方法，其特征在于，被测样品与试剂比例应控制在I: 25到I :35之间。
5.权利要求3的方法，其特征在于，反应温度为37(±1) °C。
6.权利要求3的方法，其特征在于，反应时间为8分钟。
7.权利要求3的方法，其特征在于，用半/全自动生化分析仪检测的波长为570nm。
全文摘要
一种D二聚体的检测试剂盒。试剂盒盒体内包括试剂R1缓冲液、聚乙二醇、叠氮钠、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白；试剂R2缓冲液、结合有D二聚体单克隆抗体的乳胶粒子、吐温-20、叠氮钠、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白。通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列反应，再将反应物置于半/全自动生化分析仪下，检测主波长570nm处吸光度变化的速度，从而测算出D二聚体的浓度大小。本试剂盒具有准确、稳定、方便的优点。
文档编号G01N33/577GK102788878SQ20121029087
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月16日 优先权日2012年8月16日
发明者谢兵 申请人:北京恩济和生物科技有限公司