专利名称：蟹类抗体谱检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶免疫印迹技术，具体是一种检测蟹过敏患者血清特异性IgE (slgE)抗体谱检测试剂盒。
背景技术：
食物过敏的本质是一种错误的免疫应答，机体对某种食物过敏时，会在体内产生相应的特异性抗体(IgE和IgG)，这种抗体对自身造成损伤引起过敏反应，临床可以表现为皮肤、呼吸道、消化道症状，甚至危及生命。早期对于食物过敏的检测，主要集中在病史观察及体内试验(如皮肤点刺试验、食物激发试验)；但这些方法不仅昂贵、耗时，并且存在着诱发严重过敏反应的风险，已渐渐被淘汰。目前，临床上常采用检测特异性抗体来确定患者食 物过敏情况，最终确定过敏食物。采用体外检测蟹类特异性抗体具有不受药物干扰、安全无风险、患者容易接受等优点。特异性IgE测定基于免疫化学原理，即通过已知蟹蛋白(过敏原)测定未知抗体(IgE)0如血清中检测到针对蟹蛋白的抗体，即可以判断检测对象对蟹过敏。血清特异性IgE需要采用标记免疫技术，通常使用酶、荧光物质等作为标记物，即酶联免疫吸附试验、酶免疫印迹法以及荧光酶免疫法。无论采用何种标记技术，均有优质的已知抗原为基础，包被抗原的质量直接影响检测结果。现有诊断试剂盒多采用从食物中提取的总蛋白成份作为已知抗原，一般不对总蛋白进行细分，也不考虑各组份之间的比例关系。基于食物总蛋白提取物作为包被抗原，检测特异性IgE的食物过敏原诊断试剂盒均存在如下缺陷或不足。以蟹为例食物过敏反应存在明显个体差异，不同过敏患者血清中特异性IgE存在明显个体差异；换句话说，蟹过敏患者血清中特异性IgE的种类和浓度存在一定差别，而这种差别对临床诊断和治疗有重要指导意义。现有食物过敏原试剂盒由于采用总蛋白进行包被，不能对特异性IgE的异质性进行区分。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种多组分的特异性IgE联合测定的蟹类抗体谱诊断试剂盒，解决目前蟹特异性诊断试剂盒只能筛选出血清中蟹特异性IgE的存在，而不能确定患者对蟹中不同过敏蛋白的差异。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种蟹类抗体谱检测试剂盒，包括显色底物、印记反应槽、鼠抗人IgE-AP标记抗体,还包括分别包被有蟹各个分子量的蛋白和兔抗鼠IgE抗体的PVDF膜检测条，用于标本稀释、酶标抗体稀释的浓缩洗液。所述分别包被有蟹各个分子量的蛋白和兔抗鼠IgE抗体的PVDF膜检测条的制备方法包括以下步骤(I)蛋白粗提液的制备如下取鲜活海蟹，去壳，挑取纯净肌肉组织，研磨成匀浆，按体积比1:10 I :20的比例加入-20°C的冷丙酮，置4°C冰箱脱脂，每2小时磁力搅拌30分钟，24小时后滤去丙酮，通风干燥，称量干燥后的蟹蛋白，按每克样品加入PH7. 4、0. OlM PBS 10 20晕升,置4°C冰箱，搅拌1-2小时，24小时后，12000转/分钟离心20分钟，收集上清，分装_20°C保存，以备用于电泳分离不同分子量的蛋白；(2)将制备的蟹蛋白进行SDS-PAGE电泳后，利用转膜的技术将电泳后的不同条带转印至聚苯乙烯PVDF膜上，成为各个分子量的蛋白的检测区，同时，在另一 PVDF膜上包被上兔抗鼠IgE抗体，作为试验的质控区，这两个PVDF膜固定于同一底衬上。所述步骤(2)的制备方法为①检测区蛋白粗提液经SDS-PAGE电泳后，PVDF膜依次经甲醇、双蒸水、转膜缓冲液浸泡，之后，干转仪15伏电压下转膜30分钟，再依次用甲醇、双蒸水、O. 01MTBST冲洗，质量百分比5%的脱脂奶封闭过夜，弃去封闭液，O. OlM TBST漂洗3次，每次10分钟，风干，备用； ②控制区兔抗鼠IgE抗体调节浓度为I. 6-2. 4毫克/毫升，点样于PVDF膜上，室温温育2小时，依次用甲醇、蒸馏水、O. OlM TBST冲洗后，5%的脱脂奶封闭过夜，弃去封闭液，O. OlM TBST漂洗3次，每次10分钟，风干，备用；③将①和②制备好的检测区和控制区固定于一个底衬上，备用。所述用于标本稀释、酶标抗体稀释的浓缩洗液配方为Tris I. 21g氯化钠5.84g双蒸水80ml调PH至8. 0，加Iml质量百分比浓度30%TWEEN-20，充分搅拌后，4°C定容至100mL。本发明的有益效果是本发明采取了 SDS-PAGE电泳后，转膜将蛋白成分包被于PVDF膜上，使蟹类中的不同蛋白成分分开，这样，检测结果中就能清晰地看出待检血清中存在哪几种过敏组分的特异性抗体(IgE)，能够提高临床诊断的准确性，适合于蟹类过敏的进一步确认，并可根据不同患者含有的特异性IgE种类制定适合的脱敏治疗方案。
图I是使用本发明蟹类抗体谱检测试剂盒的患者血清与蟹蛋白区带印记结果(注M :分子量标准Por :蛋白电泳I 9 :单例患者血清10 :阴性血清对照)。图2是本发明蟹类抗体谱检测试剂盒实验过程示意图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明如图2所示，本发明的蟹类抗体谱诊断试剂盒，包括显色底物，印记反应槽，鼠抗人IgE-AP标记抗体，还包括分别包被有蟹各个分子量的蛋白和兔抗鼠IgE抗体的PVDF膜检测条，标本稀释液，酶标抗体稀释液和浓缩洗液。所述蟹类抗体谱诊断试剂盒制备方法(以下百分比浓度均为质量百分比浓度)
I.蛋白粗提液的制备方法如下取鲜活梭子蟹(海蟹)，去壳，挑取纯净肌肉组织，研磨，尽量研磨成匀浆，按体积比1:10 1:20的比例加入冷丙酮(_20°C保存的)，置4°C冰箱脱脂，期间磁力搅拌大约2小时，每次可搅30分钟，24小时后滤去丙酮，通风干燥，称量干燥后的蟹蛋白，按每克样品加入O. OlM PBS (PH7. 4) 10 20毫升，置4°C冰箱，期间搅拌大约2小时，24小时后，12000转/分钟离心20分钟，收集上清，分装_20°C保存，以备用于电泳分离不同分子量的蛋白。2.将制备的蟹蛋白进行SDS-PAGE电泳后，利用转膜的技术将电泳后的不同条带转印至聚苯乙烯膜上(PVDF膜，以下简称PVDF膜)，成为各个分子量的蛋白的检测区(T区)，同时，在另一 PVDF膜上包被上兔抗鼠IgE抗体，作为试验的质控区(C区)，这两个PVDF膜固定于同一底衬上。制备的具体过程为①检测区蛋白粗提液经SDS-PAGE电泳后，PVDF膜依次经甲醇、双蒸水、转膜缓冲液浸泡，之后，干转仪15伏电压下转膜30分钟，再依次用甲醇、双蒸水、O. OlM TBST冲洗，5%的脱脂奶封闭过夜，弃去封闭液，O . OlM TBST漂洗3次，每次10分钟，风干，备用。②控制区兔抗鼠IgE抗体调节浓度为I. 6-2. 4毫克/毫升，点样于PVDF膜上，室温温育2小时，依次用甲醇、蒸馏水、O. OlM TBST冲洗后，5%的脱脂奶封闭过夜，弃去封闭液，O. OlM TBST漂洗3次，每次10分钟，风干，备用。③将①和②制备好的检测区和控制区固定于一个底衬上，备用。I.溶液配制
磷酸盐缓冲溶液(PB) O. IM pH 7. 4
双蒸水(CldH2O)3.6 L(I)
磷酸二氢钠(NaH2PO4 · 2H20) 11.84 g
磷酸氢二钠(NaJlPO4. 12H20) 116 g磁力搅拌，充分溶解后，调pH至7. 4,补加ddH20定容至4L。⑵转膜缓冲液
Tris11. 629g
甘氨酸5.855g
I-二烷基磺酸钠(SDS)O. 375g
甲醇(methanol)400ml
双蒸水(ddH20)1.8L磁力搅拌，充分溶解后定容至2L，4°C保存备用。⑶TBST (O. IM pH8. O)(用于标本稀释、酶标抗体稀释的浓缩洗液)Tris I. 21g氯化钠(NaCl)5. 84g双蒸水(ddH20)80ml调PH至8. 0，加Iml质量百分比浓度30%TWEEN_20，充分搅拌后定容至lOOmL，4°C备用。(4) O. OIM TBST (用于标本稀释、酶标抗体稀释的洗液)将⑶中O. IM的TBST稀释10倍(5)显色底物
采用硝基蓝四氮唑(NBT)和5-溴-4-氯_3_吲哚基-磷酸(BCIP)混合液，为商品化试剂，美国Sigma公司有售。2.试剂盒制备(下面浓度为质量百分比浓度)⑴膜处理取一张PVDF膜，依次浸泡于甲醇、双蒸水、干转缓冲液，每次浸泡约2-3分钟；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore公司)。⑵样品处理蛋白粗提液按照成熟的SDS-PAGE电泳技术，浓缩胶为5%，分离胶为10%，样品浓度为3. 5毫克/毫升，和上样缓冲液以3:2混合(体积比)，煮沸5分钟，每孔上样15微升,65伏电压堆积30分钟，135伏电压分离,待溴酹蓝指不到达底部，电泳完毕。⑶转膜电泳后的凝胶，切去浓缩胶，转膜缓冲液中平衡；与已经处理过的PVDF膜一起，组成一个4层滤纸-PVDF膜-凝胶-4层滤纸的模式，干转仪15伏电压下转印30分钟。 ⑷封闭取出转好的PVDF膜，再依次经甲醇、双蒸水、转膜缓冲液浸泡，之后5%脱脂奶封闭过夜。(5)漂洗弃去封闭液，O. OlM TBST漂洗三次，每次10分钟。(6)风干PVDF膜置于干燥滤纸上，自动干燥，贴标记纸，备用。(7)控制区的制备(C区):兔抗鼠IgE抗体调节浓度为I. 6-2. 4毫克/毫升，点样于PVDF膜上，室温温育2小时，依次用甲醇、蒸馏水、O. OlM TBST冲洗后，5%的脱脂奶封闭过夜，弃去封闭液，O. OIM TBST漂洗3次，每次10分钟，风干，备用。(8)固定将制备好的检测区与控制区检测条固定于底衬上。4.酶标记鼠抗人IgE抗体鼠抗人IgE-Ap (碱性磷酸酶)抗体为商品化试剂,购自美国R&D公司。产品说明书提供最佳稀释浓度1:1000，范围1:800-1:12000。5.本发明的使用方法(测定步骤)⑴将PVDF膜检测条放入印记反应槽内，加入Iml洗液；放在摇床上摇10分钟，使检测条充分润湿。⑵吸干槽中的洗液，加入O. 5ml稀释后的待测血清(血清标本用标本稀释液稀释10倍)，置摇床上，室温反应3. 5小时，此时血清中抗体与相应过敏原结合。⑶吸干槽中的血清，加Iml洗液，置摇床中震荡10分钟；重复洗涤3次。⑷吸干槽中的洗液，加入O. 5ml鼠抗人IgE-AP标记抗体(用酶标抗体稀释液将鼠抗人IgE-AP做250倍的稀释)，置摇床上，室温反应O. 5小时，C区兔抗鼠IgE抗体与酶标记抗体结合形成复合物，T区则形成过敏原-特异性IgE抗体-酶标记抗体复合物。(5)吸干酶标抗体，加Iml洗液，置摇床中震荡10分钟；重复洗涤3次。(6)加入O. 5ml显色底物，避光反应大约15-20分钟。(7)倒掉底物，加Iml洗液，置摇床中震荡3-5分钟；重复洗涤3次。(8)干燥检测条，根据检测区显色情况判定检测结果，确认患者血清是否存在特异性IgE以及IgE的种类。(9)结果判读与蟹蛋白蛋白条带为参照，如果血清中有蟹类的特异性抗体则出现相应的条带，可以报告出过敏的蛋白；若血清中无相应抗体，则该检测区无显色；质控区，无论血清中有无特异性抗体，酶标记抗体均会与PVDF膜表面的兔抗鼠IgE抗体结合，出现显色带。如质控区未显色说明本次检测出现问题，不能报告结果。以此鉴定试验的有效性。临床应用效果利用本试剂盒检测临床确诊对蟹类过敏患者30人，同时选择对蟹类无过敏的正常对照组10例，结果显示10例正常对照组没有产生显色的条带，而30例过敏病人组都产生了显色条带，只是位置和着色深浅不同，说明都检测到了对蟹蛋白过敏的抗体，只是类型和强度不同，显示了蟹过敏的抗体谱(如图I所示)，分析30例过敏患者血清反应结果，出现几种不同的模式①以其中一种单一抗体为主，即只针对某一种蛋白为主，主要分别以94KD、48KD、38KD和36KD为主，如图I中的I 5 ;②几种抗体同时存在，即针对几种蛋白，如图I中的6 8 3例血清无较为突出的蛋白条带的反应类型，存在几种效价较低的抗体，如图I中的9号血清。据此，临床可以做出有针对性的治疗方案。综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发 明的范围之内。
权利要求
1.一种蟹类抗体谱检测试剂盒，包括显色底物、印记反应槽、鼠抗人IgE-AP标记抗体，其特征在于，还包括分别包被有蟹各个分子量的蛋白和兔抗鼠IgE抗体的PVDF膜检测条，用于标本稀释、酶标抗体稀释的浓缩洗液。
2.根据权利要求I所述的蟹类抗体谱检测试剂盒，其特征在于，所述分别包被有蟹各个分子量的蛋白和兔抗鼠IgE抗体的PVDF膜检测条的制备方法包括以下步骤 (O蛋白粗提液的制备如下 取鲜活海蟹，去壳，挑取纯净肌肉组织，研磨成匀浆，按体积比1:10 I :20的比例加入-200C的冷丙酮，置4°C冰箱脱脂，每2小时磁力搅拌30分钟，24小时后滤去丙酮，通风干燥，称量干燥后的蟹蛋白，按每克样品加入PH7.4、0. OlM PBS 10 20毫升，置4°C冰箱，搅拌1-2小时，24小时后，12000转/分钟离心20分钟，收集上清，分装_20°C保存，以备用于电泳分离不同分子量的蛋白； (2)将制备的蟹蛋白进行SDS-PAGE电泳后，利用转膜的技术将电泳后的不同条带转印至聚苯乙烯PVDF膜上，成为各个分子量的蛋白的检测区，同时，在另一 PVDF膜上包被上兔抗鼠IgE抗体，作为试验的质控区，这两个PVDF膜固定于同一底衬上。
3.根据权利要求2所述的蟹类抗体谱检测试剂盒，其特征在于，所述步骤(2)的制备方法为 ①检测区蛋白粗提液经SDS-PAGE电泳后，PVDF膜依次经甲醇、双蒸水、转膜缓冲液浸泡，之后，干转仪15伏电压下转膜30分钟，再依次用甲醇、双蒸水、O. OIMTBST冲洗，质量百分比5%的脱脂奶封闭过夜，弃去封闭液，O. OlM TBST漂洗3次，每次10分钟，风干，备用； ②控制区兔抗鼠IgE抗体调节浓度为I.6-2. 4毫克/毫升，点样于PVDF膜上，室温温育2小时，依次用甲醇、蒸馏水、O. OlM TBST冲洗后，5%的脱脂奶封闭过夜，弃去封闭液，O.OlM TBST漂洗3次，每次10分钟，风干，备用； ③将①和②制备好的检测区和控制区固定于一个底衬上，备用。
4.根据权利要求I所述的蟹类抗体谱检测试剂盒，其特征在于，所述用于标本稀释、酶标抗体稀释的浓缩洗液配方为 Tris I. 21g 氯化钠5.84g 双蒸水80ml 调PH至8. 0，加Iml质量百分比浓度30%TWEEN-20，充分搅拌后，4°C定容至100mL。
全文摘要
本发明公开了一种蟹类抗体谱检测试剂盒，属于酶免疫印迹技术。本发明包括显色底物，印记反应槽，鼠抗人IgE-AP标记抗体，该试剂盒还包括用于标本稀释、酶标抗体稀释的浓缩洗液，以及分别包被有蟹的各个不同分子量的蛋白的检测区，以及包被兔抗鼠IgG抗体并标记C的质控区。这样设计的本发明，由于使用了直接将蟹蛋白粗提液的SDS-PAGE电泳后，通过转印包被到PVDF膜上，使蟹类的蛋白得到分离并以天然存在的浓度与待测血清反应，这样保证了特异性IgE检测的全面性；最重要的是，检测结果能够回答待检血清中存在几种过敏原组分的特异性抗体，能够提高临床诊断准确性，适合蟹过敏的进一步确认并制定合理脱敏方案。
文档编号G01N21/78GK102944682SQ20121050568
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者李韶深, 李婵, 李会强, 徐丽敏, 朱愉, 丁强 申请人:天津市中医药研究院附属医院