专利名称：微量白蛋白免疫磁珠快速检测试剂盒的制作方法
技术领域：
微量白蛋白免疫磁珠快速检测试剂盒技术领域[0001]本实用新型属于临床医学诊断领域，具体涉及一种微量白蛋白免疫磁珠快速检测试剂盒。
背景技术：
[0002]微量白蛋白(又名微量尿白蛋白，Micoralbuminuria, MAU)是指尿中出现的微量白蛋白。白蛋白是一种血液中的正常蛋白，在正常生理条件下尿液中也会出现极少微量白蛋白，排泄量一般在30mg/天(或20mg/L)之内。人尿液中的白蛋白达到在30_300mg/天或浓度20-200mg/L称为微量白蛋白，白蛋白浓度大于300mg/天或200mg/L时称大量白蛋白。[0003]微量白蛋白的非正常出现，通常被认为是肾功能衰竭、糖尿病和心血管疾病并发症等重要临床标志之一。因此，尿液中白蛋白存在水平的检测对肾病、糖尿病和心血管病的早期诊断、早期治疗和减小风险由重要的参考价值和临床意义。[0004]目前，临床检测微量白蛋白诊断早期肾损害的方法有放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附实验法(ELISA)等，这些检查较为繁琐、历时较长、费用较高，不利于临床医生的及时诊断和疗效观察。[0005]中国专利申请号200810305085. 9公开了一种半定量检测尿微量白蛋白胶体硒试纸，该试纸条能够检测含量不低于20 μ g/ml尿液中白蛋白。此法虽然简单，但是准确度不高，且不能定量检测。中国专利申请号201110458548. 6公开了微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒及其制备工艺，具体描述了该试剂盒的制备，还说明了试剂盒检测灵敏度15 μ g/ml。但是胶体金免疫层析存在以下缺陷[0006]⑴胶体金标记过程是静电吸附过程，是一种物理过程，故在液相中稳定性较差， 往往造成已标记上的蛋白分子又再次脱落；[0007](2)只有当金颗粒集聚到一定量时，人肉眼才能观察到紫红色的条带，且该颜色与背景对比度不大，从而限制了检测灵敏度。[0008]磁性纳米颗粒技术通过借助小型仪器对试纸条上免疫磁珠微量信号的检测从而对样品实行定量检测，大大提高了检测的灵敏度，使得这一技术得到快速发展。发明内容[0009]本实用新型的目的是提供一种微量白蛋白免疫磁珠快速检测试剂盒，将超顺磁性纳米颗粒作为标记物，具有简便快速、定量准确的优点。[0010]本实用新型通过以下技术方案实现[0011 ] 一种微量白蛋白免疫磁珠快速检测试剂盒，包括底衬、吸水垫，底衬上从左到右依次粘贴样品垫、免疫纳米磁珠结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述免疫纳米磁珠结合垫是附着微量白蛋白抗体I相偶联的纳米磁珠的玻璃纤维素膜或聚酯膜；所述硝酸纤维素膜上有包被微量白蛋白抗体II的检测线和包被兔抗鼠IgG抗体的质控线。[0012]所述微量白蛋白抗体I与纳米磁珠相偶联方式采用链霉亲和素-生物素方式、化学键合法或吸附法。[0013]所述纳米磁珠为粒径100-400nm的超顺纳米磁珠。[0014]所述硝酸纤维素膜上检测线6和质控线7间隔为3. 0-8. 0mm。[0015]所述微量白蛋白抗体I和微量白蛋白抗体II为配对单抗或单抗-多抗配对。[0016]与现有技术相比，本实用新型具有以下有益技术效果[0017]本实用新型通过超顺纳米磁珠与抗体结合测定样品中微量白蛋白含量，所用超顺纳米磁珠不受其他有色杂质干扰，通过高灵敏度磁性检测仪测量结合在免疫磁性复合物上的微粒所产生的局部磁场效应，进而得出所测分析物的定量结果，并灵敏度高于同类目测法。
[0018]图I微量白蛋白免疫磁珠快速检测试剂盒结构示意图。[0019]其中，I、底衬；2、样品垫；3、免疫纳米磁珠结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、吸水垫；6、 检测线；7、质控线。[0020]具体实施方式
[0021]
以下结合附图对本实用新型进一步详细描述，所述是对本实用新型的解释而不是限定。[0022]结合图1，一种微量白蛋白免疫磁珠快速检测试剂盒，包括底衬I、吸水垫5，底衬 I上从左到右依次粘贴样品垫2、免疫纳米磁珠结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5 ;所述免疫纳米磁珠结合垫3是附着微量白蛋白抗体I相偶联的纳米磁珠的玻璃纤维素膜或聚酯膜；所述硝酸纤维素膜4上有包被微量白蛋白抗体II的检测线6和包被兔抗鼠IgG抗体的质控线7。[0023]所述微量白蛋白抗体I与纳米磁珠相偶联方式采用链霉亲和素-生物素方式、化学键合法或吸附法。[0024]所述纳米磁珠为粒径100_400nm的超顺纳米磁珠。[0025]所述硝酸纤维素膜上检测线6和质控线7间隔为3. 0-8. 0mm。[0026]所述微量白蛋白抗体I和微量白蛋白抗体II为配对单抗或单抗-多抗配对。[0027]实施例I本实用新型微量白蛋白免疫磁珠快速检测试剂盒的制备[0028]方法I[0029]I、免疫磁珠的制备取适量IOOnm的超顺纳米磁珠(购自上海奥润微纳米新材料科技有限公司)悬浮于含有lmg/ml微量白蛋白单克隆抗体I的20mmol/L pH7. 9的PBS缓冲液，37°C孵化致敏I. 5-2h，再于4°C包被过夜；加O. lmol/L甘氨酸溶液终止反应，再用 O. 5%BSA封闭磁珠，然后洗涤离心，沉淀重悬于20mmol/L pH7. 9的PBS缓冲液中，4°C保存备用。[0030]2.免疫纳米磁珠结合垫3的制备将上述偶联好的纳米磁珠用喷点仪均匀喷于玻璃纤维素膜或聚酯膜上，25°C干燥4-6h，密封干燥保存。[0031]3.检测线6和质控线7的制备以pH 7. 8的PBS缓冲液将微量白蛋白单克隆抗体II或微量白蛋白多克隆抗体和兔抗鼠IgG抗体分别配置成O. 2mg/ml和O. 3mg/ml的溶液，再用喷膜仪在硝酸纤维素膜4上以I μ 1/cm的量分别划线作为检测线6和质控线7，检测线6和质控线7间隔3. 0-8. 0mm。[0032]4.样品垫2的制备[0033]将样品垫2用ρΗ7· 5的PBS缓冲液侵泡2_4h，取出后25°C干燥8h。[0034]5.试纸条组装[0035]在底衬I上顺次相互地粘贴样品垫2、免疫纳米磁珠结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的试纸条。[0036]方法2[0037]I.免疫磁珠的制备取O. 2g 200nm的超顺纳米磁珠，用50mM pH5. 7乙磺酸(MES) 缓冲液配制成1%的纳米磁珠溶液，加入O. Ig碳化二亚胺(EDC)，37°C lOmin，再加入O. Ig微量白蛋白单克隆抗体I，37°C孵育2 h，期间不断摇晃，然后用磁力架吸附磁珠，将缓冲液更换至O. OlmM pH7. 5 PBS缓冲液(含有O. 5%BSA、0. 5%Tween20)，持续搅拌5min,以饱和游离磁珠。低速离心去除凝聚的磁珠沉淀，然后再用20mM pH 8. 5硼酸缓冲液(含有1%BSA、 O. 5%Tween,5%蔗糖)恢复体积，4°C保存备用。[0038]其它步骤同方法I。[0039]方法3[0040]I.链霉亲和素修饰的磁珠制备以350nm超顺纳米磁珠作为纳米磁珠,用50mM pH5. 7乙磺酸(MES)缓冲液配制成1%的纳米磁珠溶液，加入O. Ig碳化二亚胺(EDC)，37°C反应30min，离心收集沉淀，4°C保存备用。[0041]2.生物化抗体的制备将微量白蛋白单克隆抗体I与预活化的生物素按1:10比例混合，室温下反应lh，并用O. 02M pH7. 5的PBS于4°C透析过夜，加入等体积甘油后_20°C 保存备用。[0042]3.免疫磁珠的制备将步骤I得到的2mg链霉亲和素纳米磁珠中加入生物素化抗体200 μ g,在垂直旋转混合仪上反应30min，然后用500 μ I O. 02Μ ρΗ7. 5的PBS缓冲液保存。[0043]其它步骤同方法I。[0044]实施例2样品检测[0045]将被检测尿液滴加100-120 μ I于样品垫2上，溶液将溶解免疫纳米磁珠结合垫3 上标记好的免疫磁珠，并在硝酸纤维素膜4上发生层析，然后在5-10min内用磁力检测仪 (MICT)检测试纸条特定位置的磁信号，根据信号得出待测样品中的微量白蛋白的含量进行定量检测，或者直接用肉眼观察条带颜色的深浅，从而判断尿液中是否含有微量白蛋白，进行定性检测。
权利要求1.一种微量白蛋白免疫磁珠快速检测试剂盒，包括底衬、吸水垫，其特征在于底衬上从左到右依次粘贴样品垫、免疫纳米磁珠结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述免疫纳米磁珠结合垫是附着微量白蛋白抗体I相偶联的纳米磁珠的玻璃纤维素膜或聚酯膜；所述硝酸纤维素膜上有包被微量白蛋白抗体II的检测线和包被兔抗鼠IgG抗体的质控线。
2.根据权利要求I所述微量白蛋白免疫磁珠快速检测试剂盒，其特征在于所述纳米磁珠为粒径100-400nm的超顺纳米磁珠。
3.根据权利要求I所述微量白蛋白免疫磁珠快速检测试剂盒，其特征在于所述硝酸纤维素膜上检测线和质控线间隔为3. 0-8. 0mm。
专利摘要本实用新型公开了一种微量白蛋白免疫磁珠快速检测试剂盒，属于临床医学检验领域。该试剂盒的底衬上从左到右依次粘贴样品垫、免疫纳米磁珠结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述免疫纳米磁珠结合垫是附着微量白蛋白抗体I相偶联的纳米磁珠的玻璃纤维素膜或聚酯膜；所述硝酸纤维素膜上有包被微量白蛋白抗体II的检测线和包被兔抗鼠IgG抗体的质控线。本实用新型实现了快速定量检测，同时具有操作方便、准确率和灵敏度高的优点。
文档编号G01N33/68GK202814989SQ20122042040
公开日2013年3月20日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者苏恩本, 陈伟, 颜彬, 黄力 申请人:南京基蛋生物科技有限公司