发荧光半导体纳米晶体的制作方法

发荧光半导体纳米晶体的制作方法
【专利摘要】本文提供发荧光半导体纳米晶体及其组合物，包括试剂盒、测定体系以及它们的制备和使用方法。
【专利说明】发荧光半导体纳米晶体
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年6月7日提交的美国临时申请号N0.61 / 494，255和2012年I月23日提交的美国临时申请号N0.61 / 589,725的优先权，这两篇临时申请的公开内容在此通过引用全文并入。
【技术领域】
[0003]提供可用在包括生物、分析和组合化学、医疗诊断、基因和蛋白质分析、以及单分子光谱学在内的各种领域中的发荧光(fluorogenic)半导体纳米晶体；本文还提供包含发荧光半导体纳米晶体的组合物、试剂盒和测定系统，以及它们的制备方法和使用方法。
【背景技术】
[0004]光活性半导体纳米晶体在许多光学和电子应用领域受到关注。半导体纳米晶体往往包括半导体核和钝化半导体壳。其带隙高于核材料的壳材料可以使深陷阱发射位点最少，并且可以提高纳米晶体粒子的量子产率和稳定性。在与金属原子接触时荧光纳米晶体的光学性质和稳定性可能受损。在存在金属(例如，金属离子或金属底物)下，半导体纳米晶体的荧光发射强度可以显著降低。一旦淬灭(quench)，纳米晶体的荧光发射往往不可能再生。这种对金属的敏感性严重限制了半导体纳米晶体在要求接触金属离子或金属(例如，催化剂和金属底物)的应用中的使用。因此，需要开发用于恢复被淬灭的纳米晶体的荧光强度的材料和方法。

【发明内容】

[0005]本文提供发荧光半导体纳米晶体、包含这种纳米晶体的试剂盒和组合物、以及这种纳米晶体的制备方法和使用方法。本文所述的纳米晶体可用在各种领域。这些纳米晶体理想地适用在生物和诊断应用中，但它们也可以用在许多其它的非生物应用中。代表性的应用包括例如分析和组合化学、医疗诊断、基因和蛋白质分析。由于它们卓越的光学性质，这些纳米晶体可以在从细胞和组织染色(例如FISH)、细胞跟踪、数字光谱、免疫测定、蛋白质的Western blot检测、细胞迁移可视化、单分子检测、流式细胞术分析至体内成像的各种生命科学应用中用作有效的检测工具。本文提供的发荧光纳米晶体还可以构成许多类型的电子器件如LED、太阳能电池、晶体管和二极管激光器中的基础组件，并且具有许多非生物应用如用于无机化合物的传感器。此外，提供便于在含金属(例如，金属基底和金属催化剂)的环境中使用半导体纳米晶体的组合物和方法。本文提供的纳米晶体组合物和方法克服与常规荧光半导体纳米晶体有关的许多缺点，并且为半导体纳米晶体提供以前不可能的新的使用机会。
[0006]一方面，本文提供包括荧光半导体纳米晶体和与该半导体纳米晶体缔合的淬灭基团的纳米晶体。荧光半导体纳米晶体在不存在淬灭基团下具有初始荧光强度(Ftl),发荧光半导体纳米晶体具有经淬灭的荧光强度(Fq)，其中Fq / Ftl小于约1.0。在一些实施方案中，Fq / Ftl小于约0.50。荧光半导体纳米晶体可以为非发射性的(即Fq / F0=O)或基本非发射性的(即纳米晶体可以发射检测阈值以下的某些光)。荧光半导体纳米晶体在不存在淬灭基团下可以发射可见光或近IR光谱范围的光。多个淬灭基团可以与纳米晶体缔合(例如，多达约3000个淬灭基团)。在某些实施方案中，多于50个淬灭基团与纳米晶体缔合。在某些实施方案中，约50至约3000、或约50至约1000、或约1000至约2000、或约2000至约3000个淬灭基团与纳米晶体缔合。
[0007]另一方面，提供包括如本文所述多个发荧光半导体纳米晶体的发荧光纳米晶体群。该发荧光纳米晶体群在不存在多个淬灭基团下的量子产率可以大于约10%、或约25%、或约50%、或约75%。
[0008]又一方面，提供包含如本文所述的发荧光半导体纳米晶体群和水性或有机介质或固体载体的组合物，其中纳米晶体与固体载体(如果存在)缔合。该组合物可以配制用在体外或体内生物测定中。在某些实施方案中，纳米晶体群分散在有机介质中。在其它实施方案中，组合物是发荧光半导体纳米晶体(没有团聚)在水性介质中的稳定分散体。在某些实施方案中，组合物包含小于3.0XlO7M的淬灭基团。组合物还可以包含如本文所述其量足以激活荧光纳米晶体荧光发射(例如，使得Fa /匕为10:1或更大)的活化剂。又一方面，提供用于制备发荧光纳米晶体或其群的方法。所提供的代表性方法包括a)提供包含荧光半导体纳米晶体和至少一种溶剂的反应混合物；以及b)向反应混合物中加入其量足以减少半导体纳米晶体荧光发射的淬灭基团(或多个淬灭基团)。在加入淬灭基团之后荧光发射信号可以减少至少50%。荧光半导体纳米晶体在不存在淬灭基团下可以具有初始荧光强度(Ftl),发荧光半导体纳米晶体可以具有经淬灭的荧光强度(Fq)，其中Fq / Ftl小于约
0.50。通常10_8M至约1°_3M的淬灭基团存在于反应混合物中。在某些实施方案中，该方法还包括向反应混合物中加入针对每个纳米晶体多于50个淬灭基团(即淬灭基团与纳米晶体之比为50:1或更大)。在某些实施方案中，该比例是约50至约3000、或约50至约1000、或约1000至约2000、或约2000至约3000。
[0009]在某些方法中，荧光半导体纳米晶体是水分散性的。或者，可以使用疏水性纳米晶体。在一些实施方案中，该方法还可以包括在加入淬灭基团之后用使得纳米晶体呈水分散性的亲水性化合物处理半导体纳米晶体。某些方法还包括使有机分子(例如，生物分子)结合到纳米晶体上。
[0010]又一方面，提供发荧光纳米晶体群，其中纳米晶体根据本文所述的任意方法制备。
[0011]本文还提供使用纳米晶体群的试剂盒和方法。因此，又一方面，提供一种用于激活经淬灭的半导体纳米晶体的试剂盒。示例性的试剂盒包括:a)如本文所述的发荧光纳米晶体群jPb)活化剂。试剂盒还可以包括可以释放氰化物或异腈源的生氰底物。试剂盒还可以包括生氰酶，所述生氰酶能够切割生氰底物以释放含氰根离子或异腈基团的化合物。
[0012]因此，另一方面，提供包括a)如本文公开的发荧光纳米晶体群；b)生氰酶；和c)生氰底物的试剂盒。又一方面，提供包括a)荧光纳米晶体群；b)铜源；c)生氰酶；和d)生氰底物的试剂盒。生氰酶可以与抗体或固体载体(例如，载片、微芯片、珠粒、纤维、微孔板、纳米孔、磁盘或磁带)缔合。在某些试剂盒中，纳米晶体群中的每个纳米晶体可以与第一结合基团(例如，抗体)缔合，生氰酶与第二结合基团(例如，抗体)缔合，其中第一和第二结合基团不同。[0013]另一方面,提供用于进行点击环加成反应(click cycloaddition reaction)的试剂盒。示例性的试剂盒包括a)荧光半导体纳米晶体群，其中半导体纳米晶体每个都包含炔反应性基团或叠氮化物反应性基团山)铜源(Cu(I)或Cu(II)离子)；和(3)至少一种活化剂。
[0014]在本文所提供的任一试剂盒中，纳米晶体群可以悬浮在水性介质或与固体载体或抗体缔合。某些试剂盒使用两种或更多种不同的纳米晶体群。
[0015]又一方面，提供用于激活发荧光半导体纳米晶体的方法。代表性方法包括:a)提供如本文所述的发荧光半导体纳米晶体；和b)使纳米晶体与活化剂接触，其中发荧光半导体纳米晶体在与活化剂接触后的荧光强度增加。在一些实施方案中，纳米晶体与活化剂在PH为7或更高下接触。纳米晶体在与活化剂接触后可以具有经激活的荧光强度(Fa)，其中FA/FQ大于I。在某些方法中，FA/FQS 10或更大。在某些方法中，在与活化剂接触后淬灭化合物可以从纳米晶体表面脱附。
[0016]某些方法还包括使纳米晶体与能够释放异腈或氰化物基团的生氰底物接触。某些方法还包括水解底物以释放氰根离子。底物可以是生氰酶底物(例如，生氰葡糖苷)。用在所公开方法中的底物例子包括苦杏仁苷、野黑樱苷(prunasin)、蜀黍苷、巢菜苷、亚麻苦苷、百脉根苷、氰醇、氰醇酯、氰醇酰胺、丙酮氰醇、苯乙醇腈和酰基氰化物。
[0017]某些方法还包括使生氰酶底物与能够切割生氰底物以释放含异腈基团或氰化物基团的化合物的生氰酶接触。生氰酶可以是葡糖苷酶。例如，生氰酶可以是杏仁葡糖苷酶、苦杏仁苷酶和亚麻仁苷酶。某些方法还包括使生氰酶底物与裂解酶(例如α-羟基腈裂解酶)、酯酶、蛋白酶或半乳糖酶接触。某些方法还包括使发荧光纳米晶体与金属螯合剂(例如EDTA)接触。
[0018]还提供根据本文所公开的任一种方法制备的经激活的发荧光纳米晶体群。经激活的发荧光纳米晶体群的量子产率可以大于约10%、或约25%、或约50%、或约75%。
[0019]本文还提供使用所公开的发荧光纳米晶体的方法。例如，提供用于检测样品中被分析物(例如生物分子、细胞或小的无机或有机分子)的存在的方法。采用本文所提供方法可以检测的生物分子的例子包括蛋白质、肽、核酸、寡核苷酸、适配体(aptamer)、脂蛋白、糖蛋白、碳水化合物、脂质、磷脂、氨基聚糖、酶和抗原。在某些实施方案中，被分析物是经翻译后修饰(例如磷酸化、糖基化等)的蛋白质。采用所公开方法可以检测的代表性无机或有机分子包括例如药物、毒素和金属离子。
[0020]代表性方法包括a)提供能够释放氰化物源(例如，氰根离子或异腈基团)的生氰底物山)使样品与如本文公开的发荧光半导体纳米晶体接触，其中纳米晶体与第一结合基团缔合；c)使样品与第二结合基团接触，其中第二结合基团与生氰酶缔合，其中第一和第二结合基团不同，并且第一和第二结合基团结合被分析物(如果存在)；d)使生氰酶与生氰底物接触，由此从生氰底物释放氰化物源；以及e)检测发荧光半导体纳米晶体的荧光发射，其中荧光发射信号强度的增加表示样品中存在被分析物。
[0021]还提供一种检测样品中被分析物的存在的方法，包括a)提供i)能够释放氰化物源(例如，氰根离子或异腈基团)的生氰底物和ii)如本文所述的发荧光纳米晶体；b)使样品与结合基团和第二结合基团接触，其中第一结合基团和第二结合基团不同，其中第一和第二结合基团结合被分析物(如果存在)，其中第一结合基团与生氰酶缔合；c)使生氰酶与生氰底物接触以在纳米晶体存在下释放氰化物源；以及d)检测发荧光半导体纳米晶体的荧光发射，其中荧光发射信号强度的增加表示样品中存在被分析物。第一结合基团可以与第三结合基团缔合，其中第三结合基团与生氰酶缔合。任选地，第二结合基团可以经由第三结合基团间接与被分析物缔合。
[0022]还提供一种检测样品中被分析物的存在的方法，包括a)提供固体载体，其中载体与第一结合基团和生氰酶缔合山)使固体载体与样品和第二结合基团接触，其中第一和第二结合基团结合被分析物(如果存在)，其中第二结合基团与根据权利要求1所述的发荧光半导体纳米晶体缔合，并且其中第一结合基团和第二结合基团不同；c)使生氰酶与生氰底物接触以释放氰化物源(例如，氰根离子或异腈基团)；以及d)检测发荧光半导体纳米晶体的荧光发射，其中荧光发射信号强度的增加表示样品中存在被分析物。任选地，第二结合基团可以经由第三结合基团间接与被分析物缔合。
[0023]在本文提供的任一种方法中，第一、第二和/或第三结合基团(如果存在)可以是抗体、寡核苷酸、适配体或化学结合基团。化学结合基团包括例如聚合物、金属配体、蛋白质结合剂等。在某些实施方案中，第一结合基团与固体载体缔合，并且该方法还任选包括在加入生氰底物之前洗涤固体载体。
[0024]又一方面，提供检测样品中核酸的存在的方法。代表性方法包括a)使样品与如本文所述的发荧光半导体纳米晶体接触，其中纳米晶体与具有已知序列的第一核酸缔合山)使样品与具有已知序列的第二核酸缔合，其中第二核酸与生氰酶缔合；c)使生氰酶与生氰底物接触，由此从生氰底物释放氰化物源(例如，氰根离子或异腈基团)4Pe)检测发荧光半导体纳米晶体的荧光发射，其中荧光发射信号强度的增加表示存在具有能够与第一和第二核酸链杂交的序列的核酸链。
[0025]又一方面，提供一种激活半导体纳米晶体的方法，包括a)提供如本文所公开的至少一种荧光半导体纳米晶体或发荧光纳米晶体山)使该半导体纳米晶体与化合物接触以调节纳米晶体的至少一种光学性质；和c)确定纳米晶体的位置。在某些方法中，纳米晶体的位置可以通过成像确定。所确定的第一纳米晶体和第二纳米晶体的位置的准确度可以小于第一和/或第二纳米晶体所发射的光的波长。
[0026]又一方面，提供一种检测样品中氰根离子的方法，包括a)提供样品；b)使样品与如本文公开的发荧光半导体纳米晶体接触，其中淬灭基团能够与氰根离子络合；和c)检测纳米晶体的荧光发射，其中荧光发射信号强度的增加表示样品中存在氰根离子。
[0027]又一方面，提供增强半导体纳米晶体的亮度的方法。代表性方法包括a)提供荧光半导体纳米晶体；和b)使纳米晶体与活化剂接触，以使得纳米晶体群的荧光发射强度增加至少10%。
[0028]又一方面，提供使化合物结合到半导体纳米晶体上的方法。代表性方法包括a)接触包含炔反应性基团或叠氮化物反应性基团的荧光半导体纳米晶体；b)使纳米晶体与包含以下基团的反应性材料接触，所述基团在Cu(I)或Cu(II)离子存在下能够与化合物的炔反应性基团或叠氮化物反应性基团反应；和c)使纳米晶体与活化剂接触，其中在与活化剂接触后纳米晶体的荧光发射强度增加。在某些实施方案中，纳米晶体是如本文所公开的发荧光半导体。某些方法还包括使纳米晶体与反应性材料在至少一种还原剂存在下接触。反应性材料可以包括选自氨基酸、肽、蛋白质(例如，酶或抗体)、碳水化合物、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、药物、脂质和合成聚合物的分子。反应性材料可以与固体载体(共价或非共价)缔合。某些方法还包括监测纳米晶体的荧光发射强度，其中在加入活化剂后发射强度增加至少10%。
[0029]本文还提供发荧光测定体系。本文所提供的代表性发荧光测定体系包含a)如本文所公开的发荧光半导体纳米晶体，其中纳米晶体与第一结合基团缔合山)与第二结合基团缔合的生氰酶，其中第二结合基团与所述结合基团不同，且其中第一和第二结合基团与被分析物缔合；和c)在与生氰酶接触后能够释放释放氰化物源(例如，氰根离子或异腈基团)的生氰底物。该测定体系中的生氰酶和/或第二结合基团可以与固体载体缔合。
[0030]又一方面，提供一种鉴别样品中的细胞或细胞组分的方法。用于鉴别细胞或细胞组分的通用方法包括a)使样品中的细胞或细胞组分与如本文所述的发荧光半导体纳米晶体在其中纳米晶体被输送通过细胞膜的条件下接触以提供经标记的细胞或细胞组分；b)将经标记的细胞或细胞组分暴露于激发能量源以激活半导体纳米晶体，使得经激活的纳米晶体具有荧光强度(Fa)，其中Fa / Fq大于I ;和c)检测经激活的纳米晶体的荧光发射，由此鉴别样品中的细胞或细胞组分。
[0031]又一方面，提供一种鉴别细胞混合群中的细胞的方法，包括:a)使第一细胞与如本文所述的发荧光半导体纳米晶体在其中纳米晶体与细胞缔合的条件下接触以提供第一经标记的细胞(例如，纳米晶体可以输送通过细胞膜，与细胞膜缔合，或可以被吞噬进细胞内)；b)使第一经标记的细胞与和第一细胞不同的第二细胞混合以形成细胞混合群；c)培养细胞混合群；d)将经标记的细胞暴露于激发能量源以激活半导体纳米晶体，使得经激活的纳米晶体具有荧光强度(Fa)，其中FA/FQ大于I ;和f)检测经激活的纳米晶体的荧光发射，由此鉴别细胞混合群中的第一经标记的细胞。该方法还可以包括在将经标记的细胞或细胞组分暴露于激发能量源之前或期间使经标记的细胞或细胞组分接触活化剂。
[0032]本文提供的方法可以实现鉴别任意类型的细胞，包括但不限于哺乳动物或酵母细胞。在一些实施方案中，细胞是活细胞。
[0033]又一方面，提供用于检测荧光纳米晶体的方法，包括:a)将如本文所述的发荧光纳米晶体置于光子晶体传感器的表面上山)用光照射光子晶体传感器，由此使得传感器表现出引出共振(extraction resonance)模式,该模式所具有的光谱与发突光纳米晶体的发射光谱至少部分重叠，其中照射和引出共振模式激活发荧光纳米晶体，使得经激活的纳米晶体具有荧光强度(Fa)，其中Fa / Fq大于I ;和c)检测经激活的纳米晶体的发射光，由此检测发荧光纳米晶体。该方法还可以包括使发荧光纳米晶体与活化剂接触，由此提高激活速率和/或荧光强度。
[0034]在本文提供的组合物、试剂盒、体系或方法的任一个中，发荧光纳米晶体可以包括半导体核和设置在半导体核上的半导体外壳层。纳米晶体核和/或壳层(如果存在)可以包含I1-VI族、I1-V1-VI族、I1-11-VI族或II1-V族的半导体材料。例如，在某些实施方案中，核包含CdSe。壳层可以包含选自CdZnS、ZnS、CdS、CdSeS、ZnSeS、CdZnSeS、ZnSe及其组合的半导体材料。
[0035]在本文提供的组合物、试剂盒、体系或方法的任一个中，半导体纳米晶体可以是疏水性的或可水分散的。例如，纳米晶体可以还包括在半导体纳米晶体表面上使得纳米晶体可水分散的亲水性层。纳米晶体可以还包含连接到半导体纳米晶体或亲水层上的生物分子(例如核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、氨基酸、多肽、蛋白质、多糖、脂质和生物素）。
[0036]在本文提供的组合物、试剂盒、体系或方法的任一个中，淬灭基团可以是金属源。 金属源可以是包含或能够提供金属原子的任何化合物。金属源可以是或包括金属原子、金 属离子、金属盐或含金属化合物。例如，淬灭基团可以是或包括过渡金属离子或非过渡金 属离子。淬灭基团可以是或包括选自Cu(I)、Cu(II)、Ag(I)、Hg(I、II)、Pb(II)、Pb(IV)、 Fe(II)、Fe(m)、Co(II)、Ni(II)和 Cr (I、II、III、IV、V 或 VI)的金属离子。淬灭基团可 以是例如S2_、Se2_、F_、Cl_、Br_、1_、Te2_、As3_或膦酸根的阴离子。在一些实施方案中，淬灭 基团是或包括金属盐。淬灭基团可以是包括硫醇或硫醇盐基团的有机配体。在某些实施方 案中，淬灭剂是二氢硫辛酸（DHLA)。在某些实施方案中，淬灭基团是铜源。铜源可以是提供 铜原子的任何化合物。铜源可以是铜离子例如Cu(I)或Cu(II))。在其它实施方案中，淬灭 化合物不是Cu (II)离子。
[0037]在本文提供的组合物、试剂盒、体系或方法的任一个中，活化剂可以是还原剂、氧 化剂、质子或金属离子结合化合物。在一些实施方案中，活化剂是金属螯合剂。示例性的 活化剂可以选自氰化物、腈、异腈、叠氮化物、硫氰酸酯/盐、胺、咪唑、硫醇盐、羧酸酯/盐、 N0、C0、卤化物（例如氟化物）、过氧化物、反应性氧清除剂（R0S)和氢氧化物。在某些实施 方案中，活化剂包括氰化物、异腈或腈源。例如，氰化物源可以是氰根离子、氰化物盐或有机 氰化物化合物。在本文提供的某些组合物、试剂盒、体系或方法中，活化剂是蛋白质（例如， 胎牛血清、牛血清白蛋白、酪蛋白、山羊血清、鱼血清等）或聚合物（例如，聚乙烯亚胺、多 肽、聚乙二醇、聚丙烯酸或其衍生物）。
[0038]本文描述这些和其它特征、方面和实施方案。
【专利附图】

【附图说明】
[0039]为更全面地理解本文所公开的原理及其优点，现在结合附图提及下面的详述内 各，附图中：
[0040]图1示出采用如本文所公开的发荧光纳米晶体的同源邻近测定。
[0041]图2示出采用如本文所公开的发荧光纳米晶体的ELISA测定。
[0042]图3示出采用如本文所公开的发荧光纳米晶体的邻近ELISA测定。
[0043]图4是表示铜离子对纳米晶体荧光发射的影响的图。
[0044]图5是表示三氟甲磺酸铜对纳米晶体荧光发射的影响的图。
[0045]图6是表示氰根离子对纳米晶体荧光发射的影响的图。
[0046]图7是表示有和没有氰化物处理下纳米晶体的荧光恢复图。
[0047]图8是在生氰酶和底物存在下被激活的纳米晶体的滴定曲线。
[0048]图9是表示化学切换实验中单个纳米晶体的荧光响应图。
[0049]图10示出单个纳米晶体在光激活之前（A)和之后（B)的图像。
[0050]图11 是比较用(A) 20W / cm2、(B) 40W / cm2、(C) 80W / cm2 照射和(D) 20W / cm2 照射和2mM KCN的纳米晶体的荧光响应的图。
[0051]图12是表示发荧光纳米晶体在照射和氰化物处理后的量子产率增强的柱状图。
[0052]图13是比较经铜淬灭的纳米晶体样品在HPSS或MEM和FBS(10% )中培育或成像 的发荧光响应的柱状图。[0053]图14是表示经铜淬灭的纳米晶体样品在⑷FBS (20 % ),⑶MEM (60 % )和FBS(20% ), (C)MEM(60% )、或(D)单独的缓冲液中激活和成像的发荧光响应的图。
[0054]图15是表示发荧光纳米晶体在有(A)和没有(B) LED照射下在不同苯乙醇腈浓度下的发荧光响应与苯乙醇腈浓度的函数关系图。
[0055]图16是表示经铜淬灭的纳米晶体发荧光响应与IL-6浓度的函数关系图。
【具体实施方式】
[0056]参照下面实施方案的详述和本文所包括的实施例可以更容易地理解本文所述的实施方案。要理解本文所用术语仅用于描述具体实施方案，而并非限制。
[0057]本公开内容所提及的每一专利、专利申请、出版物和文献的全文都在此通过引用整体并入，包括所有的表、附图和数字。
[0058]除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员惯常理解的相同意义。
[0059]如本文所用的，"一个"或"一种"表示"至少一个"或"一个或多个"、"至少一种"或"一种或多种"。
[0060]如本文所用，"约"指数值是近似的，并且小变化不会明显影响本文所提供的组合物和方法的使用和实施。如果使用数值限制范围，除非上下文另外指明，否则"约"表示该数值可以变化± 10%，并且保持在所公开实施方案的范围内。
[0061]如本文所用的“纳米晶体”指具有纳米尺寸范围的至少一个主尺寸(其最大尺寸为约Inm至约IOOOnm)并且由无机物质制成的具有有序晶体结构的粒子。纳米晶体可以由以下材料制备，所述材料本体是半导体或绝缘材料并且具有在近紫外(UV)至远红外(IR)范围的可调光物理性质。由这种材料制备的纳米晶体本文称作“半导体纳米晶体”。纳米晶体可以包含由晶体材料如半导体材料制备的核，并且纳米晶体核可以被由一种或多种类型的绝缘或半导体材料形成的一个或多个外壳层包围。没有施加壳的半导体纳米晶体本文称作“核纳米晶体”或“半导体核纳米晶体”，而具有半导体壳的半导体纳米晶体核本文称作“核/壳纳米晶体”或“半导体核/壳纳米晶体”。纳米晶体如核或核/壳纳米晶体可以与粒子表面上的有机覆层或配体或其它材料缔合，例如三辛基膦(TOP)、三辛基氧化膦(TOPO)、油酸、辛基膦酸(OPA)、乙基膦酸(EPA)、十四烷基膦酸(TDPA)或通过普通溶剂化不容易从表面除去的其它材料。在某些实施方案中，粒子表面上的有机覆层或配体层是交联的。这些表面覆层或层可以改变粒子性质，例如增加或减小在水或其它溶剂中的溶解性。
[0062]"水溶性"或“水分散性”本文用来表示所述物品在水性条件下可以溶解或不会附聚，例如在水或水基溶液或缓冲液中，包括本领域技术人员已知的在生物或分子检测系统中使用的那些。虽然按术语用于描述单个溶剂化小分子的意义而言，水溶性纳米晶体并没有真正溶解，但它们溶剂化(例如，经由氢键、静电或其它合适的物理/化学结合)和悬浮在与其外表面层相容的溶剂中，因此容易分散在水中的纳米晶体视为水溶性或水分散性。水溶性纳米晶体也可以视为亲水性的，因为它的表面与水相容和具有水溶性。
[0063]如本文所用的“群”指多个纳米晶体并且该纳米晶体可以具有类似物理和/或光学性质。“群”可以指具有多于一个纳米晶体的溶液或结构。在某些实施方案中，溶液或结构中的纳米晶体处于适合单一分子分析的浓度。[0064]如本文所用的“发荧光(fluOTogenic) ”指其中产生或增强荧光信号的过程。该术语还指将弱或非荧光基团转化为荧光基团的化学、电化学或光化学反应。在分析测定的上下文中，荧光量可以量化并与被分析物的量相关。
[0065]如本文所用的“发荧光纳米晶体”或“发荧光半导体纳米晶体”指其荧光性质可以经由化学反应或辐射调节的半导体纳米晶体。表现一些可检测的荧光并且光学性质(例如，发射强度或量子产率)能够表现出增强的荧光纳米晶体本文也称作“发荧光纳米晶体”。
[0066]如本文所用的“发荧光底物”指通过另一化合物作用后产生荧光化合物的非荧光材料或可以激活或增强另一化合物(例如，半导体纳米晶体)的荧光的化合物。发荧光底物可以产生可以激活(例如，“打开”)或增强另一化合物的光学性质的物质(本文称作“活化剂”)。在某些情形中，活化剂可以经历进一步反应以产生或释放活化物质。可以被特定酶作用的发荧光底物本文称作“发荧光酶底物”。可以被切割以释放氰化物源(例如，氰根离子或有机氰化物化合物)的发荧光底物本文称作“生氰底物”。如果切割可以通过酶实现，发荧光底物也可以称作“生氰酶底物”。
[0067]如本文所用的“淬灭剂”指以下化合物或基团，所述化合物或基团可以将发射性半导体纳米晶体转化为在发射性纳米晶体在用淬灭剂处理之前发射的光谱范围内的光学上无活性物质。纳米晶体与淬灭剂之间的相互作用可以是永久的或瞬变的，并且可以不同程度地减小光学性质。淬灭剂可以是化学基团(或多个基团)，这种情况下淬灭剂也可以称作
“淬灭基团”。
[0068]如本文所用的“淬灭”指减小或改变半导体纳米晶体的至少一种光学性质的过程。这种光学性质包括荧光发射强度、发射波长、量子产率或放射持续时间。半导体纳米晶体淬灭可以产生“经淬灭的”半导体纳米晶体。淬灭可以是因纳米晶体与化学基团(或多个基团)的接触或相互作用所致，所述化学基团(或多个基团)本文称作“淬灭基团”或“淬灭剂”。
[0069]如本文所用的“活化剂”指可以恢复或增强半导体纳米晶体的至少一种光学性质(例如荧光发射)的化合物、基团或能量场。活化剂可以是化学基团(或多个基团)或氧化还原载体如电子或空穴，这种情况下活化剂也可以称作“活化基团”。或者，光可以充当活化剂。
[0070]如本文所用的“激活”指恢复或增强半导体纳米晶体的至少一种光学性质(例如，荧光发射强度、量子产率等)的过程。激活可以是半导体纳米晶体与“活化剂”之间的接触或相互作用所致。半导体纳米晶体激活可以产生“经激活的”半导体纳米晶体。如同淬灭一样，纳米晶体与活化剂之间的相互作用可以是永久的或瞬变的。激活可以使用化学活化基团或通过用光照射纳米晶体来实现。光激活可以使用光源来实现，并且可以单独使用或与化学活化基团组合使用。化学激活和/或光激活可以在用淬灭基团处理之前或之后作用给纳米晶体，并且可以不同程度地增强光学性质。
[0071]本文公开了发荧光半导体纳米晶体及其制备和使用方法。还提供恢复和增强发荧光半导体纳米晶体的一种或多种光学性质(例如发射强度或量子产率)的方法和这种纳米晶体的应用。
[0072]本文提供的半导体纳米晶体包括半导体性，任选活性核。该核可以被一个或多个半导体壳层包围。半导体壳可以在光学活性核与周围介质之间提供物理屏障。壳基本均匀地覆盖在核周围并且基本没有缺陷。壳可以采取多种形式。例如，壳可以是多层壳或成合金的壳。在某些实施方案中，壳在核周围形成基本同心的外覆层。在某些实施方案中，壳可以包括在核周围形成洋葱状外覆层的多个层。外壳的存在可以减小纳米晶体对环境变化的敏感度，减少光氧化，并且可以帮助钝化表面捕集态(surface trap state)以显著提高突光量子产率。
[0073]纳米晶体核和壳可以由已知用于形成半导体纳米晶体的任何合适的金属和非金属原子制备。用于核和/或壳的合适半导体材料包括但不限于包括基于2-16、12-16、13-15和 14 族元素的半导体的那些，例如 ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、GaN、GaP、GaAs、GaSb、InP、InAs, InSb, AlAs, A1P、AlSb, PbS, PbSe, Ge和Si及其混合物。在一些实施方案中，核/壳纳米晶体的核和壳由不同半导体材料组成，这意味着核/壳的核的半导体材料的至少一种原子类型不同于核/壳纳米晶体的壳中的原子类型。
[0074]用于壳的合适材料通常包括带隙能比半导体纳米晶体核高的半导体材料，但是其它设置也可以。除了具有比半导体纳米晶体核高的带隙能以外，在某些实施方案中，用于壳的合适材料相对于核半导体纳米晶体可以具有良好的导带和价带偏移。因此，导带如期望地高于核半导体纳米晶体，而价带如期望地低于核半导体纳米晶体。通常选择壳材料和核材料以使晶格不匹配最小。对于在可见光(例如CdS、CdSe、CdTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、GaP、GaAs, GaN)或近IR(例如InP、InAs, InSb、PbS、PbSe)发射能量的半导体纳米晶体核，可以使用在紫外区具有带隙能的材料。示例性材料包括CdS、CdSe, InP、InAs、ZnS、ZnSe、ZnTe、GaP, GaN以及镁硫属化物如MgS、MgSe和MgTe。对于在近IR发射的半导体纳米晶体核，也可以使用在可见光具有带隙能的材料，例如CdS或CdSe。本领域还理解特定纳米晶体核的实际荧光波长取决于核尺寸及其组成，因此以上分类是大概性的，描述为在可见光或近IR发射的纳米晶体核实际可以根据核尺寸以更长或更短波长发射。
[0075]在某些实施方案中，核和/或壳包含至少一种II族元素和至少一种VI族元素的混合物(例如CdSe或CdTe或其混合物)或I1-V1-VI族或I1-11-VI族半导体材料。在一些实施方案中，半导体纳米晶体包括CdSe核。在某些实施方案中，所提供的发荧光纳米晶体不包含CdTe。在其它实施方案中，核包含至少一种III族元素和至少一种V族元素的混合物(例如GaAs、InGaAs、InP、InAs或InGaP或其混合物)。在某些实施方案中，半导体壳层可以包含CdZnS、ZnS、CdS、CdSeS、ZnSeS、CdZnSeS、ZnSe或这些材料的组合。在某些结构中，壳层还可以包含稀土金属、Cu、Mg、Ag、Hg、Pb、Mn、N1、Co、Fe、Au、Be、Cr、P、B、N、O、Ge、Ga或Si原子。
[0076]如本文公开的纳米晶体可以吸收宽光谱范围的波长，并发射相对窄范围波长的光。激发和发射波长通常不同，并且不重叠。半导体纳米晶体的颜色(即所发射的光)可以通过改变粒子的尺寸和组成来"调节(tune)"。根据纳米晶体核的尺寸，这些纳米晶体可以在电磁波谱的UV、可见光或IR部分发射。所公开的纳米晶体或其群的发射峰可以一般在约200nm至约2500nm的任何波长处。在某些实施方案中，所提供的纳米晶体在电磁波谱的UV或可见光范围(约SOOnm以下)发射。在其它实施方案中，纳米晶体群在光谱的近IR区域(例如约700nm至约2500nm)发射。通常纳米晶体的尺寸要在电磁波谱的UV-1R部分提供荧光，因为该范围适合用于监测相关介质中的生物事件。
[0077]所公开的纳米晶体可以具有任何直径，其中直径沿纳米晶体的最短轴测量。纳米晶体的直径可以为约Inm至约lOOOnm。通常纳米晶体的直径为约Inm至约IOOnm,或约Inm至约20nm,或约Inm至约15nm,或约Inm至约IOnm,或在这些值的任意两个之间的直径。
[0078]在某些实施方案中，本文所公开的纳米晶体群可以包括多个具有基本相同尺寸和形状的单个纳米晶体。这种粒子集合有时称作"单分散的"群。可以制备能够发射单颜色光的纳米晶体的单分散群(也称作单颜色制备)。本领域普通技术人员将实现可以获得纳米晶体的特定尺寸作为粒子尺寸分布。因此，本文还提供纳米晶体群，其中群中大于75%(例如大于80%,或大于85%,或大于90%,或大于95% )的纳米晶体具有基本相同的直径。
[0079]本文所述的纳米晶体群的特征可以在于它们可以产生具有相对窄波长带的荧光发射，这表明群具有类似尺寸的(即单分散的)纳米晶体。整体发射带的宽度在室温测量时通常小于约60nm半峰全宽(FWHM)、或小于约50nm FWHM、或小于约40nm FWHM、或小于约30nm FWHM或小于约20nm FWHM。所发射的光优选具有对称(例如Gaussian)的单峰发射带。本文提供的某些材料表现出高度单分散群标志的令人惊奇的颜色纯度(例如小于约30nm FWHM)，以及有利的光学性质(例如最小的间歇闪烁、高消光系数、高量子产率、光稳定性或两种或更多种这些性质的组合)。
[0080]本文所提供的某些纳米晶体在不存在淬灭基团下可以具有高消光系数和高量子产率。消光系数可以在各种波长测量，但一般最实用的是采用405nm激发波长(即许多商用激光器中所用的波长)。在该激发波长，某些所公开的纳米晶体的消光系数通常为约3，000，OOOcnr1Ir1至约30，000，OOOcnr1Ir1。例如，本文所述的纳米晶体在405nm激发波长测量表现出的消光系数可以为约3，000, OOOcnTt1至约10，000, OOOcnT1M'或约10，000, OOOcnr1Ir1 至约 20，000, OOOcnr1Ir1,或约 20，000, OOOcnr1Ir1 至约 30，000, OOOchT1Mq
[0081]本文所公开的某些纳米晶体在不存在淬灭基团下还可以表现出高量子产率(即发射光子与吸收光子之比)。这种纳米晶体的量子产率(QY)可以为至少约10%、至少约20 %、至少约40 %、至少约50 %、至少约60 %、至少约70 %、至少约80 %、至少约90 %、至少约95%、至少约98%。量子产率可以在水性或有机介质中测量。本文提供的某些纳米晶体(或其群)在水性或有机介质(例如溶剂)中测量时表现出约60%或更大、或约70%或更大、或约80%或更大、或约85%或更大的QY0
[0082]本文提供的纳米晶体还可以包括直接接触外壳层的表面覆层，其可以赋予纳米晶体某些物理/化学特性，保护纳米晶体以免分解，和/或允许纳米晶体结合到生物分子上。通常纳米晶体在留在纳米晶体表面上的疏水性有机溶剂中制备。发荧光纳米晶体可以由这种疏水性纳米晶体制备。但是，在一些实施方案中，所公开的纳米晶体包括在半导体纳米晶体表面上添加各种官能团的覆层，这些官能团使得纳米晶体可水分散或可溶于水性溶液中。在某些实施方案中，纳米晶体包括在半导体纳米晶体表面上使得纳米晶体可水分散的未水层O
[0083]存在可以施用到纳米晶体上以在纳米晶体表面上形成亲水层的许多合适包覆材料。通常这些包覆材料包含用以附着到纳米晶体表面上的基团和亲水性基团如羧酸、羟基、胺等。包覆材料附着到纳米晶体表面上可以涉及任意形式的共价或非共价缔合。在某些实施方案中，包覆材料可以包含小的有机配体，其包含亲水性组分。
[0084]许多合适的表面包覆材料可以用来允许所述纳米晶体具有水分散性，包括但不限于脂质、磷脂、脂肪酸、聚核酸、聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、RAFT聚合物、含硫醇聚合物、含咪唑聚合物、含肽聚合物和多肽。在某些实施方案中，表面覆层提供由两性聚合物如丙烯酸基聚合物形成的亲水层。
[0085]其它包覆材料包括含硫醇的化合物(例如巯基羧酸如巯基十一烷酸MUA)、二齿硫醇(例如二氢硫辛酸DHLA)、三齿硫醇、寡肽(例如二肽)、含胺或羧酸的有机分子(例如十六烷胺HDA)、官能化的有机磷化合物(例如膦酸、次膦酸)、亲水性膦酸、或具有膦酸酯、亚膦酸酯、胺、羧酸酯、硫醇、咪唑、膦、腈或异腈官能团的亲水性低聚物。在某些实施方案中，无机(非半导体)壳层如氧化锆、氧化钛、二氧化硅、ZnS、ZnO或MgO可以施用到半导体壳层上以赋予纳米晶体有益的表面性质。
[0086]另一方面，纳米晶体可以还包括一种或多种连接到半导体纳米晶体的表面覆层上的生物学分子(即生物分子)。在某些实施方案中，多个生物分子连接到半导体纳米晶体上。对于某些应用，可能期望使额外的有机分子或生物分子连接到纳米晶体表面上或亲水层上。例如，纳米晶体可以包括能够连接生物分子或其它类型有机分子的表面覆层。生物分子包括例如核酸聚合物、低聚核苷酸、适配体、核苷酸、蛋白质、抗体、酶、肽、碳水化合物、氨基酸、多肽、蛋白质、多糖、脂质、生物素、抗生蛋白链菌素等。其它有机分子包括例如染料、淬灭剂(例如甲基紫精(methylviologen))、金属配体(例如NTA)等。
[0087]在某些实施方案中，半导体纳米晶体与包含如本文所公开的活化基团或多个活化基团的配体或多个配体缔合。例如，纳米晶体可以包括在纳米晶体表面上的多官能聚合物覆层，其中覆层可以包含活化剂(例如，异腈基团)。含活化剂的覆层可以促进激活而不需要在单独步骤中加入活化剂。
[0088]在其它实施方案中，纳米晶体缀合到包含组氨酸基团的分子上。例如，覆有DHLA的纳米晶体可以缀合到His6-改性的蛋白质(例如聚合酶或葡糖苷酶)上，任选包含包覆蛋白质如BSA或惰性His6-改性的蛋白质。
[0089]在其它实施方案中，纳米晶体包括包含一种或多种反应性基团如氨基、叠氮化物、炔、环炔、膦、羧酸、马来酰亚胺(maleimido)、硫醇和琥珀酰亚胺酯的表面层。在某些实施方案中，表面层包含炔反应性基团(例如叠氮基团)或叠氮化物反应性基团(例如端炔)。这种反应性基团可以缀合到各种类型的分子上。例如，纳米晶体可以提供有叠氮化物反应性基团或炔反应性基团用以在1，3-偶极环加成反应(例如点击反应)中与反应配偶体缀合。纳米晶体表面上的反应性基团可以连接到各种类型的材料上以形成缀合物，包括但不限于本文所述的任何生物分子和有机分子。
[0090]可以用在本文所述组合物和方法中的可商购半导体纳米晶体的例子包括LifeTechnologies Corporation (Carlsbad, CA)的任意 QDOT 纳米晶体(例如，在 525、545、565、585、605、625、655、705或800nm具有荧光发射的纳米晶体)，包括但不限于QDOT纳米晶体缀合物(例如抗生蛋白链菌素缀合物)和官能化纳米晶体。合适纳米晶体的其它例子包括由羧基、氨基(PEG)基团和脂族烃基衍生的那些(以商品名QDOT Innovator的Toolkit (ITK)可得)，以及反应性纳米晶体如QDOT抗体缀合试剂盒、QTRACKER细胞标识试剂盒和Non-Targeted Quantum Dot (非祀向量子点)中提供的。[0091]发荧光半导体纳米晶体可以包括荧光半导体纳米晶体和一种或多种与半导体纳米晶体缔合的淬灭基团。发荧光半导体纳米晶体包括光学活性的半导体核，并且通常包括设置在半导体核材料上的半导体壳层。在不存在淬灭基团下，半导体纳米晶体呈光学活性，并且能够经在合适波长下激发而发荧光。这种荧光纳米晶体通常发射在可见光或近IR光谱范围的光。与淬灭基团缔合，荧光半导体纳米晶体的荧光发射强度减小或甚至完全淬灭。如果完全淬灭，发荧光纳米晶体或其群不发射光或所发射光的水平低于检测仪的检测限度，则纳米晶体或其群视为非发射性的。
[0092]淬灭剂可以是在与半导体纳米晶体缔合后能够减小纳米晶体的荧光发射强度的任何基团或化合物。淬灭基团可以与纳米晶体以永久或可逆方式缔合。在某些实施方案中，淬灭基团可以是金属源。金属源的例子包括金属原子或金属离子或可以是含金属化合物的组分如有机金属化合物或金属盐。淬灭基团可以是或包括过渡或非过渡金属离子如Cu(I)、Cu (II)、Ag (I)、Hg (1、II)、Pb (II)、Pb (IV)、Fe (II)、Fe (III)、Co (II)、Ni (II)和 Cr (1、I1、
II1、IV、V或VI)。在某些实施方案中，淬灭基团包括铜源(例如Cu⑴或Cu(II)离子)。在某些实施方案中，可能期望的是淬灭基团不包括Cu(II)离子。在其它实施方案中，淬灭基团是阴离子如F_、Cl_、S2_、Se2_、I_、Br_、02_、含氧酸根阴离子(oxyanion)(例如硫酸根、磷酸根、硼酸根、硅酸根、硝酸根等)，反应性氧物质(例如OH基、过氧化物、单氧等)，还原剂(例如抗坏血酸盐、二茂钴、低价金属如Cu、Ag、Fe等)或氧化剂(例如Br2、12、Cl2、F2、二茂铁鐵离子(ferrocinium)、亚硝鐵离子(nitosonium)、一氧化氮等)。
[0093]本文提供的发荧光半导体纳米晶体可以包含至少一种淬灭基团，但通常多个淬灭基团与纳米晶体缔合。与半导体纳米晶体缔合的淬灭基团的数量可以为单个基团至数千个的这种基团。淬灭基团的数量通常小于约5000、或小于约4000、或小于约3000。例如,淬灭基团的数量可以为约I至约50、或约50至约100、或约100至约500、或约500至约1000、或约1000至约1500、或约1500至约2000、或约2000至约2500、或约2500至约3000。在某些实施方案中，与纳米晶体缔合的淬灭基团的数量大于50(例如50至约3000)。
[0094]淬灭基团在与荧光纳米晶体缔合后导致在与淬灭基团缔合前的荧光纳米晶体所表现出的荧光发射强度减小。发射强度可以以不同程度减小。通过比较荧光纳米晶体在与淬灭基团缔合前的初始荧光强度(Ftl)和纳米晶体在与淬灭基团缔合后的荧光强度(Fq)来描述所实现的淬灭量。该关系表示为Fq / Ftl之比，本文称作“淬灭比”。淬灭比的值取决于荧光半导体纳米晶体的组成以及与纳米晶体缔合的淬灭基团的数量和类型。淬灭比可以为O至1.0，其中淬灭比为O表示纳米晶体没有表现出可检测的发射(即非发射的)。淬灭比大于O但采用标准方法不容易检测的纳米晶体可以视为基本非发射的。发荧光纳米晶体的淬灭比通常小于1.0、或小于0.90、或小于0.80、或小于0.70、或小于0.60、或小于0.50、或小于0.40、或小于0.30、或小于0.20、或小于0.10。对于许多应用，淬灭比通常小于0.50。
[0095]本文还提供包含如本文所述的发荧光纳米晶体或其群的组合物和试剂盒。在某些实施方案中，纳米晶体配制用在体外或体内生物测定中。这种组合物可以是纳米晶体的水性或有机分散体(例如胶态分散体)。发荧光纳米晶体群可以分散在水性介质(例如水或缓冲液)或有机介质(例如有机溶剂或聚合物)中。该介质可以呈液体或固体形式。在一个实施方案中，本文提供发荧光半导体纳米晶体在水性介质中的稳定(没有团聚的)分散体。在某些实施方案中，发荧光半导体纳米晶体可以与固体介质缔合。在一些实施方案中，纳米晶体与固体载体如玻璃、聚合物或金属缔合。合适的载体包括例如珠粒(例如聚合物、磁性或玻璃珠粒)、微球、载片、纤维、微芯片、微流体通道、微孔板、纳米孔、磁盘或磁带。本文还提供用于将这种组合物施加到这种载体上的方法。在某些实施方案中，如下讨论的，组合物还可以包含活化剂如氰化物源(例如氰化物盐或有机氰化物化合物)。
[0096]本文还公开制备发荧光半导体纳米晶体及其群的方法。一般而言，发荧光纳米晶体可以通过如下制备:将荧光半导体纳米晶体与一种或多种淬灭基团缔合以减小荧光纳米晶体的荧光发射强度。在通用的方法中，提供包括至少一种荧光半导体纳米晶体和至少一种溶剂的反应混合物。本文所述的任意荧光半导体纳米晶体可以用在所述方法中。同样，任何合适的溶剂可以用于分散反应混合物中的纳米晶体。然后将一种或多种淬灭基团以足以减小半导体纳米晶体的荧光发射的量加入反应混合物中。本文所述的任何淬灭基团可以用在所公开的方法中。通常反应混合物中所用的溶剂也能够溶解或分散反应混合物中的淬灭基团。
[0097]通常加入反应混合物中的淬灭基团的量要足以将纳米晶体在加入淬灭基团后的荧光发射信号减小至少50%。加入反应混合物中的淬灭基团的浓度取决于期望与每个半导体纳米晶体缔合的淬灭基团的量。淬灭基团在反应混合物中的浓度通常为约KT8M至约10_3M。例如，淬灭基团可以以使得多于50个淬灭基团与每个纳米晶体(即50:1淬灭基团与纳米晶体之比)缔合的量加入反应混合物中。在某些制备物中，反应混合物中所存在的淬灭基团/纳米晶体之比为约50至约3000、或约50至约1000、或约1000至约2000、或约2000 至约 3000。
[0098]淬灭基团可以在荧光纳米晶体存在下培育足以使淬灭基团与半导体纳米晶体缔合的时间。培育可以在室温或升高的温度下进行。温度可以选择成优化淬灭基团在纳米晶体表面上受控沉积并使纳米晶体和/或淬灭基团最少团聚。
[0099]本文所述方法可以在溶剂或溶剂混合物中进行。溶剂类型取决于纳米晶体的表面性质。疏水性纳米晶体容易分散或溶解在与水不混溶的溶剂如己烷、甲苯等中，而不容易分散在水中。或者，亲水性纳米晶体可以分散在水性溶剂(例如水或缓冲液)中。
[0100]一旦淬灭基团和半导体纳米晶体结合，即培育反应混合物。通常培育在室温下进行，但升高的温度也可以采用。可以光谱方式监测淬灭反应的进行。当纳米晶体实现特定的最小发射强度(发射强度是淬灭基团与纳米晶体表面缔合的标记)时，反应可以停止。在某些实施方案中，一旦纳米晶体不再表现出荧光发射，即停止反应。在某些实施方案中，当发射达到初始荧光强度的约50%、或约40%、或约30%、或约20%、或约10%时停止反应。
[0101]本文所公开的方法可以应用于任何类型的疏水性或亲水性荧光半导体纳米晶体。当使用疏水性纳米晶体时，该方法还可以包括在加入淬灭基团后用使得纳米晶体可水分散的亲水性化合物处理半导体纳米晶体。而且，可以任选包括如本文所公开的一种或多种反应性基团的有机分子如生物分子可以在用淬灭剂处理纳米晶体之前或之后连接到纳米晶体上。
[0102]本文提供的新材料提供独特的光谱发射性质，这允许这些材料实现用在各种基于荧光的测定中，例如免疫吸收测定(ISA)、酶联免疫吸收测定(ELISA)、蛋白质免疫印迹(Western blot)、ELISP0T、荧光原位杂交(FISH)、基因检测和PCR。其它应用包括DNA序列分析；流式细胞术、荧光激活细胞分选测定；生物体系中的诊断、体外和体内成像(例如细胞成像)、单分子显微术和高通量筛选应用。此外，提供化学开关方法用以实现对半导体纳米晶体光学性质的受控操作。如本文所公开的化学开关方法便于纳米晶体用在宽范围的新型发荧光和数字显微测定中。
[0103]本文提供的材料和方法还允许半导体纳米晶体与通常使半导体纳米晶体荧光淬灭的金属离子(例如铜催化剂)和金属底物一起使用。因此，还提供用于在半导体纳米晶体上进行金属催化缀合的材料和方法。
[0104]本文提供的发荧光纳米晶体的一种应用是它们用作检测并量化生物和非生物被分析物(例如核酸、抗体、蛋白质、肽、碳水化合物等)的发荧光探针。
[0105]因此一方面，提供检测生物和非生物样品中被分析物的方法。在这种方法中，样品与如本文所述的发荧光半导体纳米晶体(或其群)或纳米晶体组合物接触足以使纳米晶体结合样品中被分析物(如果存在)的时间。接着检测半导体纳米晶体的荧光发射。由于发荧光纳米晶体的荧光发射已经淬灭，这种方法可以使用活化剂来恢复(即重新激活)半导体纳米晶体的荧光发射。
[0106]因此，本文还提供激活发荧光半导体纳米晶体的方法以及通过这种方法产生的经激活发荧光纳米晶体群。在这种激活方法中，发荧光半导体纳米晶体或其群与一种或多种活化剂接触直至发荧光半导体纳米晶体或群的光学性质(例如荧光强度)增强。在加入活化剂的情况下，本文提供的某些测定中的激活速率和终点荧光强度可以显著增大。不希望囿于理论，与活化剂接触后，淬灭基团可以从纳米晶体表面脱附，由此恢复半导体纳米晶体的荧光。但是，淬灭基团脱附不是激活进行的必须要求。
[0107]又一方面，本文提供用于在存在某些活化剂下，即使半导体纳米晶体上不存在淬灭基团下，增强荧光半导体纳米晶体的光学性质(例如量子产率)的方法。
[0108]本文公开的激活方法通常在室温下进行，但是激活温度可以为约15°C至约60°C。通常激活在中性或轻碱性pH(例如pH大于7)下进行。激活可以在例如pH为约8-10、或约
8、或约9、或约10下进行。
[0109]发荧光纳米晶体的发射强度可以以不同程度增加。可以通过比较发荧光纳米晶体(发荧光纳米晶体可以是经淬灭或未经淬灭的荧光纳米晶体)在与活化剂接触前的初始荧光强度(Fq)和在与活化剂缔合后的经激活纳米晶体的荧光强度(Fa)来描述所实现的激活量。该关系可以表示为Fa / Fq之比，本文称作“发荧光比”。
[0110]发荧光比一般大于1，其中发荧光比为I表示经淬灭和经激活的半导体纳米晶体的荧光发射没有可检测的变化。发荧光比约为I的发荧光纳米晶体视为没有激活的，而发荧光比大于I的发荧光纳米晶体视为激活的。经激活的纳米晶体的发荧光比可以大于1.0、或大于10、或大于100、或大于1000、或大于10，000，但是也可以是更高的比例。对于许多应用，发荧光比大于10。
[0111]发荧光比的值取决于荧光半导体纳米晶体的组成、与纳米晶体缔合的淬灭基团的数量和类型以及用于激活经淬灭纳米晶体的荧光发射的活化剂的数量和类型。
[0112]在已知方法中，发荧光纳米晶体与活化剂或多个活化剂接触，以使得纳米晶体群的荧光发射强度增加至少10%、或至少25%、或至少50%。
[0113]在另一方法中，将亲水性荧光纳米晶体(例如连接到多齿硫醇配体的纳米晶体)与活化剂或多个活化剂接触，使得纳米晶体群的荧光发射强度增加至少10%、或至少25%、或至少50%。
[0114]除了荧光强度增强之外，经激活的纳米晶体的量子产率可以保持较高，并且往往与纳米晶体淬灭之前的相等。像这样，经激活的半导体纳米晶体群的量子产率可以为约10%或更大、或约25%或更大、或约50%或更大、或约75%或更大。
[0115]各种类型的活化剂可以用在本文提供的组合物和方法中，活化剂的具体类型取决于特定纳米晶体制备中所用的半导体纳米晶体和/或淬灭基团的性质。活化剂可以直接加入(例如通过向包含经淬灭的纳米晶体的反应混合物中加入活化剂溶液)。作为替代，或除此之外，化合物可以以休眠或受保护状态加入，接着在纳米晶体存在下脱保护以释放活化齐U。活化剂通常选择成不在与纳米晶体(例如在可见光和近IR区域)相同的光谱范围发射可检测的荧光。
[0116]活化剂的例子包括还原剂、氧化剂、金属离子清除剂和金属螯合剂，但是许多其它类型的活化剂可以用在本文提供的组合物和方法中。活化剂也可以组合使用(例如作为混合物)以恢复或增强半导体纳米晶体的光学性质。活化剂的代表性例子包括质子和各种类型的有机阴离子如氰根离子、硫醇盐离子、羧酸根、卤离子(例如氟离子)、焦磷酸根和氢氧根离子；以及有机化合物例如包含腈、异腈、叠氮化物、硫氰酸酯、胺或咪唑基团的化合物。活化剂的其它例子包括NO、CO、反应性氧物质(ROS)和过氧化物。
[0117]在某些实施方案中，活化剂是氰化物源。氰化物源可以是包含或能够提供氰化物基团的任何化合物。氰化物源可以是氰根离子或氰化物盐例如NaCN、KCN、LiCN或烷基氰化铵(例如四丁基氰化铵)。在其它实施方案中，氰化物源是有机氰化物化合物。有机氰化物化合物的例子包括对甲苯磺酰甲基异氰化物(TOSMIC)、羟基腈(例如苯乙醇腈、丙酮氰醇等)、酰氰和烷基氰酯。或者，氰化物源可以是包含可以在合适条件下产生氰根离子的基团的化合物。这种化合物包括例如异腈和含腈化合物，其中异腈和腈可以水解释放氰根离子。
[0118]活化剂可以是结合金属离子或将其转化为稳定络合物的金属离子清除剂。在金属离子清除剂存在下，痕量的金属离子可以隔离或除去，以使得半导体纳米晶体的荧光可以保持。
[0119]在其它实施方案中，活化剂可以是可以与金属离子形成配合络合物的金属螯合齐U。金属螯合剂可以包含至少2个有机酸基团如羧酸(COO—)和膦酸(PO/—)。金属螯合剂可以还包含具有孤对电子的额外官能团如胺(包括伯胺、仲胺或叔胺)、羟基(-0H)或硫醇(-SH)基团。
[0120]金属螯合剂的例子包括(乙二胺)四乙酸(EDTA)、丁二胺四乙酸、(1，2_环己二胺)四乙酸(CyDTA)、二乙烯三胺五乙酸、乙二胺四丙酸、(羟乙基)乙二胺三乙酸(HEDTA)、N，N，N'，N'-乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMP)、三乙烯四胺六乙酸(TTHA)、1，3-二氨基-2-羟基丙烷-N，N，N'，N'-四乙酸(DHPTA)、甲基亚氨基二乙酸、丙烯二胺四乙酸、1，5，9-三氮杂环十二烷-N，K，N"-三(亚甲基膦酸)(DOTRP)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N'，N"，N"'-四(亚甲基膦酸)(DOTP)、次氮基三(亚甲基)三膦酸、二乙烯三胺五(亚甲基膦酸)(DETAP)、氨基三(亚甲基膦酸)、1_羟亚乙基-1，1-二膦酸、二(六亚甲基)三胺膦酸、1，4，7_三氮杂环壬烷-N，N'，N"-三(亚甲基膦酸(N0TP)、2-膦酰基丁烷-1，2，4-三羧酸、次氮基三乙酸(NTA)、柠檬酸、酒石酸、乙醇酸、糖酸、甘油酸、草酸、邻苯二甲酸、马来酸、苦杏仁酸、丙二酸、乳酸、水杨酸、5-硫代水杨酸、儿茶酚、没食子酸、丙基没食子酸、连苯三酚、8-羟基喹啉、半胱氨酸、组氨酸和多肽。
[0121]在某些实施方案中，金属螯合剂如EDTA与活化剂(例如氰化物源)组合使用。EDTA是可以与金属离子形成2-6配位键并且可以与各种金属离子如Cu2+、Fe3+和Co2+形成稳定络合物的多功能螯合剂。
[0122]活化剂可以是聚合物或蛋白质。可以用作活化剂的聚合物例子包括聚乙烯亚胺、多肽、聚丙烯酸(包括其化学改性的衍生物)、RAFT聚合制得的聚合物和聚乙二醇。在某些测定中，可以期望的是使用含胺聚合物作为活化剂。可以用作活化剂的蛋白质的例子包括由血浆如胎牛血清(FBS)及其组分(例如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、山羊血清、鱼血清如虹蹲鲑鱼血清(例如来自 Thermo Fischer Scientific Inc.，Rockford, IL 的 SEA BLOCKBlocking Buffer)、抗体、抗生蛋白链菌素、激酶、细胞因子、细胞间蛋白质、膜蛋白质和细胞外蛋白质)衍生得到的那些。
[0123]活化剂可以与发荧光或荧光纳米晶体直接接触或可以原位生成。在一些实施方案中，激活发荧光纳米晶体可以在存在氰化物源(例如氰根离子)下实现。例如，氰根离子可以以氰化物盐如KCN的形式递送给纳米晶体。或者氰根离子可以原位生成(例如通过由生氰底物释放氰化物源(例如异腈或氰根离子))。在特定方法中，氰根离子通过水解含腈和异腈化合物来产生。
[0124]生氰底物包括有机化合物如如上所述的异腈和腈以及生氰酶底物。生氰酶底物包括可以充当催化剂如酶(例如生氰酶)的底物的任意化合物，其中酶能够切割底物以释放氰根离子或包含腈或异腈基团的化合物。
[0125]合适的生氰底物包括生氰葡糖苷。生氰底物的例子包括葡糖苷(例如苦杏仁苷、野黑樱苷、蜀黍苷、巢菜苷、亚麻苦苷、百脉根苷)、氰醇、氰醇酯、氰醇无机磷酸盐、氰醇酰胺、羟基腈(例如丙酮氰醇、苯乙醇腈、酰基氰化物和氰基磷酸酯)。本文提供的生氰底物可以与生氰酶一起使用。生氰酶通常对特定的生氰底物具有特异性。示例性的生氰酶包括糖苷酶、葡糖苷酶(例如α和β-葡糖苷酶)、酯酶、羟基腈裂解酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷
酶、蛋白酶、磷酸酶和内酰胺酶。葡糖苷酶的例子包括苦杏仁苷酶(例如杏仁β~-葡糖
苷酶)和亚麻仁苷酶。酯酶的例子包括猪肝酯酶和胰酯酶。
[0126]在某些实施方案中，该方法还包括在用生氰酶处理之后水解生氰底物。例如，某些生氰酶底物可以释放氰化物源如异腈基团，并且可能需要进一步水解以释放氰根离子。在此方面可以使用的化合物的例子包括裂解酶(例如α-羟基腈裂解酶)、酯酶、蛋白酶或半乳糖酶。
[0127]荧光纳米晶体的激活可以作为各种类型的发荧光测定的基础。以此方式使用，本文提供的发荧光纳米晶体可以充当发荧光探针或指示器。本文所公开的发荧光测定可以用于检测各种类型的被分析物。例如，被分析物可以是生物分子如蛋白质(包括翻译后修饰的蛋白质)、肽、核酸、寡核苷酸、适配体、脂蛋白、糖蛋白、碳水化合物、脂质、磷脂、氨基聚糖、酶、或抗原、细胞、或小无机或有机分子(例如药物、毒素和金属离子)。通常这种测定使用一种或多种能够结合待检测被分析物的结合基团。结合基团的例子包括但不限于抗体、寡核苷酸、适配体和其它类型的化学结合基团(聚合物、金属配体、蛋白质结合化学物质和活性探针)。
[0128]用于检测样品中存在目标被分析物的示例性发荧光测定是酶基同源邻近测定。参照图1，样品101 (例如生物样品)与发荧光半导体纳米晶体102接触，该纳米晶体102与能够结合样品(如果存在)中被分析物104 (例如抗原)的第一结合基团103 (例如抗体)缔合。将样品与不同于第一结合基团并且也能结合相同被分析物104的第二结合基团105 (例如第二抗体)进一步接触。在某些测定中，第二结合基团与生氰酶106缔合。接着将能够释放氰化物源(例如氰根离子或异腈基团)的生氰底物(未示出)加入样品中。当靠近生氰酶106时，生氰酶使生氰底物释放氰化物源，由此激活发荧光纳米晶体。检测测定过程中经激活的半导体纳米晶体107的荧光发射，其中纳米晶体的荧光发射信号强度增加(通常至少25% )表示样品中存在被分析物。
[0129]本文所公开的发荧光半导体纳米晶体也可以用在各种类型的ELISA测定中。参照图2所示的示例性测定，使含待检测被分析物201 (例如抗原)的样品与两种不同类型的结合基团(例如抗体)接触，这两种基团都能结合被分析物。其中一个结合基团202可以与固体载体203 (例如珠粒或板)缔合。第二结合基团204与生氰酶205或者直接或者间接通过第三结合基团206 (例如抗体)缔合。将发荧光半导体纳米晶体207或其群加入样品中，并使样品与一种或多种生氰底物208接触。可以在加入生氰底物前进行洗涤步骤以除去固体载体上未结合的物质。一旦靠近酶，底物即释放氰化物源209以激活纳米晶体。虽然氰化物源代表性的是多个氰根离子，但任何氰化物源都可以用在所述的测定中。检测测定过程中经激活的纳米晶体210的荧光发射，其中荧光发射信号强度增加(通常至少25% )表示样品中存在被分析物。
[0130]本文所公开的发荧光纳米晶体也可以在邻近ELISA测定中实现。参照图3，提供其上已结合有第一结合基团302(例如抗体)和生氰酶303的固体载体301。第一结合基团和酶可以任选连接。将固体载体与疑似包含被分析物304的样品和不同的第二结合基团305 (例如第二抗体)接触，其中这两个结合基团都能结合样品中被分析物(如果存在)。第二结合基团305与发荧光纳米晶体306或者直接(如图3所示)或者通过不同的第三结合基团(例如抗体)缔合。接着用生氰底物(未示出)处理该结构。可以在加入生氰底物前再进行洗涤步骤以除去固体载体上未结合的物质。一旦与生氰酶接触，底物即释放氰化物源(未示出)，由此激活经淬灭的纳米晶体的荧光以产生经激活的纳米晶体307。荧光发射信号强度的增加(通常至少25% )表示样品中存在被分析物。
[0131]本文所公开的发荧光半导体纳米晶体还可以用于检测核酸。一种通用方法包括将样品与缔合有具有已知序列的第一核酸的发荧光半导体纳米晶体接触。接着将样品与具有已知序列的第二核酸接触，其中第二核酸缔合有生氰酶。接着将样品与生氰底物接触。一旦与生氰酶接触，生氰底物即释放氰化物源，由此激活发荧光纳米晶体。荧光发射信号强度增加表示存在具有能够杂交第一和第二核酸链的序列的核酸链。
[0132]本文还提供发荧光测定体系。示例性的体系可以包含发荧光半导体纳米晶体或其群，其中纳米晶体与第一结合基团缔合。该体系还包含与第一结合基团不同的第二结合基团缔合的生氰酶。第一和第二结合基团都缔合有被分析物或者能够与被分析物缔合。该测定体系还可以包含生氰底物。生氰底物可以在与生氰酶接触后能够释放氰化物源(例如氰根离子或异腈基团)。在某些实施方案中，生氰酶和/或第二结合基团与固体载体(例如珠粒或微孔)缔合。本文所提供的结合基团、被分析物、氰化物源、底物和酶中的任一个都可以与发荧光测定体系一起使用。[0133]除了已经提及的使用，所公开的发荧光纳米晶体存在许多其它应用。一种这样的应用是用于鉴定样品中细胞或细胞组分的方法。在某些方法中，不同类型的细胞混合物中的各个细胞群可以用发荧光纳米晶体编码。该方法还包括将样品暴露于合适的激发能量源以激活与细胞或细胞组分缔合的半导体纳米晶体。检测经激活的纳米晶体的荧光发射可以用来鉴别和/或跟踪样品中的细胞或细胞组分。在某些方法中，激活速率和终点荧光还可以通过使用如本文所述的化学活化剂来增强。例如，样品可以在检测步骤过程中与聚合物或蛋白质(例如BSA、FBS或PEI)接触以进一步加速并增强激活。
[0134]在代表性的方法中，将含至少一种细胞的样品与发荧光半导体纳米晶体在其中纳米晶体与细胞缔合的条件下接触。纳米晶体可以通过包含在细胞内的细胞核、细胞质或细胞器官中与细胞缔合；整体或部分埋在细胞内的细胞质膜、细胞核膜或任意其它的膜中；结合到细胞内或细胞膜中的分子上；或以耐受环境或环境变化的方式固定到细胞上。
[0135]在本文所提供的细胞鉴定方法中，细胞可以是细胞群的成员，其中该群可以包括一种或多种类型的细胞。细胞可以是活的或死的；细胞可以是任意来源的，包括原核生物、真核生物或蛋白类毒性基(archeon)。细胞可以是培养的细胞系或原发隔离群，细胞可以是哺乳动物、两栖动物、爬行动物、植物、酵母、细菌、螺旋原虫或原生动物的。细胞可以是例如但不限于人类、鼠类、大鼠、仓鼠、鸡、鹌鹑、山羊或狗细胞。细胞可以是正常细胞、变异细胞、遗传控制的细胞、肿瘤细胞。
[0136]在某些方法中，该方法可以用于鉴定由一种或多种活细胞的初始样品衍生得到的细胞群，在多次细胞分裂后经由其独特的光谱识别标志进行鉴定。根据它们的光谱识别标志检测由一些前体衍生得到的细胞群的能力非常有助于高处理量地分析许多体系。
[0137]本文还提供用于鉴定样品中细胞或细胞组分的发荧光测定体系。示例性的体系可以包含发荧光半导体纳米晶体或其群，其中每个纳米晶体都与细胞或细胞组分缔合。根据测定中所用发荧光纳米晶体的类型，该体系还可以包含如本文所公开的化学活化剂(例如氰化物源和/或聚合物或蛋白质如BSA、FBS或PEI)，以进一步加速和增强发荧光纳米晶体的激活。
[0138]所公开的发荧光纳米晶体还可以充当敏感氰化物传感器。由此，还提供检测样品(例如水或生物样品如血、组织等)中氰根离子的方法。将疑似包含氰根离子的样品与发荧光半导体纳米晶体或其群接触，其中发荧光纳米晶体包含一个或多个能够与氰根离子络合的淬灭基团(例如Cu(I)或Cu(II)离子)。检测测定过程中的荧光发射。荧光发射信号的强度增加表示样品中存在氰根离子。
[0139]因此，本文还提供用于检测样品中氰根离子的荧光测定体系。示例性的体系可以包含发荧光半导体纳米晶体或其群，其中每个纳米晶体包含一个或多个能够与氰根离子络合的淬灭基团(例如Cu⑴或Cu(II)离子)。
[0140]本文公开的发荧光纳米晶体也可以用在广泛的数字检测和量化技术中。在这些方法中，发荧光纳米晶体的荧光可以在活化剂或淬灭基团的存在下化学切换“开”或“关”。在其它方法中，利用光脉冲切换“开”或“关”发荧光纳米晶体。在其它方法中，通过对纳米晶体施加电势来切换“开”或“关”发荧光纳米晶体。
[0141]检测到纳米晶体的荧光发射可以表示纳米晶体的存在和位置，以及样品中荧光物质的数量。在一种通用方法中，将荧光半导体纳米晶体或其群或发荧光纳米晶体或其群与用于调节纳米晶体的至少一种光学性质(例如荧光发射)的化合物接触。一旦激活，接着可以通过检测纳米晶体产生的荧光发射来确定纳米晶体的位置。
[0142]本文提供的光学、化学和电学切换方法可以与各种显微技术组合使用以便于检测纳米晶体。在某些实施方案中，可以采用所公开的切换方法在单分子水平检测纳米晶体。精确切换本文所提供的纳米晶体的光学性质可以以数字形式改变单个纳米晶体在受关注的特定区域中的荧光发射和其它光学性质。按此方式使用，本文所提供的发荧光纳米晶体可以在许多类型的基于突光的数字生物测定包括数字蛋白质组(digital proteomics,例如邻近免疫测定)、基因组和小分子检测中实现应用。
[0143]在一个实施方案中，化学切换可以通过如本文所公开的使荧光或发荧光纳米晶体与淬灭剂或活化剂接触来实现，以使得纳米晶体的荧光发射强度减小或增大。在使用发荧光纳米晶体的实施方案中，可以接着用活化剂处理经淬灭的荧光纳米晶体来恢复纳米晶体的荧光，以使得纳米晶体的荧光发射强度增大。在某些测定中，将纳米晶体与活化剂和淬灭基团交替接触来以数字方式切换发射“开”和“关”。对于某些测定，可以将纳米晶体或其群结合到固体载体(例如玻璃载片)上以便于用活化剂和淬灭剂的溶液或其它洗涤溶液重复处理。接着可以以光谱方式检测经激活或经淬灭的纳米晶体以确定它存在(或不存在)和/或位置。在某些实施方案中，在淬灭剂存在下，纳米晶体的荧光发射减少至少约50%。同样，在活化剂存在下，经淬灭的纳米晶体的荧光发射可以增加至少约50%，并往往恢复至其初始(即未经淬灭的)值。
[0144]在暴露于光辐射后，经淬灭和未经淬灭的纳米晶体被化学活化剂激活的速率和程度可以进一步增强和加速。在某些实施方案中，即使不存在化学活化剂，单单光即可足以引起纳米晶体发生相当可观的激活。
[0145]在某些方法中，在不使用化学活化剂下实现显著的光激活。例如，在适当波长下照射经淬灭的荧光纳米晶体可以激活纳米晶体的荧光，以使得纳米晶体的荧光发射强度增大。在某些测定中，采用起到以数字方式切换发射“开”和“关”作用的光脉冲照射纳米晶体。在某些测定中，可以切换光激活“开”和“关”来跟踪细胞或细胞组分中的荧光纳米晶体。
[0146]本文提供的发荧光纳米晶体可以光激活。光激活可以利用任何合适的照射源如激光器、灯、发光二极管等来实现。在某些实施方案中，倏逝场(evanescent field)可以用来光激活结合到表面上的发荧光纳米晶体。在其它实施方案中，光子带隙结构用来光激活发荧光纳米晶体。可以用任何为纳米晶体提供光谱信息的合适光检测系统例如光栅光谱仪、棱镜光谱仪、成像光谱仪、照相机等，或使用干涉(带通)滤波器，来检测所发射的光。使用二维区成像仪如CXD照相机，可以同时将许多物体成像。光谱信息可以通过经由不同带通、长通或短通滤波器(例如干涉滤波器、有色玻璃滤波器或电子可调滤波器)收集一幅以上的图像来产生。一旦已经收集数据，即可以经由标准图像处理技术处理以生成关于图像中物体或图像中每个像素或像素群的光谱信息。
[0147]可以用来激活本文所公开的荧光和发荧光纳米晶体和/或使其成像的成像仪器和技术的例子包括例如荧光显微镜、全内反射荧光(TIRF)显微镜、宽场荧光显微镜、共焦荧光显微镜、荧光微板读取仪、高内涵成像系统、荧光相关光谱仪(FCS)、流式细胞仪包括基于珠粒的声聚焦流式细胞仪如ATTUNE声聚焦流式细胞仪(可从Life TechnologiesCorporation获得)、光纤、波导、光盘、微流控和光子带隙结构(例如光子晶体)。
[0148]在某些方法中，具有周期性光栅结构的光子晶体用来激活和/或检测样品中发荧光纳米晶体的存在。样品和/或发荧光纳米晶体可以紧密邻近光子晶体表面。通常发荧光纳米晶体与晶体表面接触。光子晶体在合适波长和入射角的照明可以诱导产生激发共振模式和引出共振模式，所述激发共振模式具有与发荧光纳米晶体的激发光谱重叠的光谱，所述引出共振模式具有与纳米晶体的发射光谱重叠的光谱。因照明所致的激发和引出共振模式激活发荧光纳米晶体并导致纳米晶体发光。当与本文提供的发荧光纳米晶体一起使用时，光子晶体可以用于显著增强所得纳米晶体图像的强度和/或分辨率。
[0149]本文提供的纳米晶体还可以与超分辨率显微(SRM)技术一起使用来使荧光物质以高于衍射极限的分辨率成像。例如，SRM方法可以期望用来精确地确定两种不同纳米晶体的位置，非常接近于小于第一和/或第二纳米晶体所发射光的波长的准确度。各种高和超分辨率显微(SRM)技术都是可得的，并且可以用来使本文提供的纳米晶体成像，包括例如结构化照明显微术(SM)、受激发射损耗(STED)、随机光重建显微术(STORM)、光激活定位显微术(PALM)以及漂白/眨闪辅助定位显微术。
[0150]本文提供的某些活化剂可以有效恢复经金属淬灭的半导体纳米晶体的经淬灭荧光发射的发现现在为半导体纳米晶体提供用在各种要求与金属和有机金属化合物、底物(例如铜、黄铜、不锈钢、青铜等)和金属催化剂(例如Cu⑴和Cu(II))接触的新领域的能力。
[0151]一种特别受关注的领域是将铜催化环加成反应如“点击化学”用于官能化半导体纳米晶体。“点击化学”通常指叠氮化物和炔之间的1，3_偶极环加成反应。该反应在铜催化剂(通常铜离子)存在下进行。
[0152]点击化学是广泛采用的有效缀合技术，尤其用于在水性介质中缀合。但是，利用铜催化点击反应官能化半导体纳米晶体迄今并没有实践，这是因为铜催化剂的存在导致纳米晶体荧光发射发生不可逆的淬灭。本文提供的某些活化剂(例如氰根离子)的使用现在使得能够将铜催化的缀合反应用于将分子接枝到半导体纳米晶体表面上。
[0153]本文提供用于将铜催化点击化学与半导体纳米晶体一起使用的方法。在利用点击化学使化合物附着到半导体纳米晶体上的代表性方法中，将包含炔反应性基团或叠氮化物反应性基团的荧光半导体纳米晶体与包含在铜催化剂(例如Cu(I)或Cu(II)离子)存在下能够与炔反应性基团或叠氮化物反应性基团反应的反应性材料接触。该纳米晶体缀合物可以与如本文所公开的活化剂接触，以使得纳米晶体的荧光发射强度增加。
[0154]反应性材料的例子包括氨基酸、肽、蛋白质(包括酶(例如聚合酶)、抗体、抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白)、碳水化合物、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、药物、脂质、合成聚合物、生物素和固体载体。
[0155]反应性材料可以还包括用于检测的标记物(例如染料)。在本文所述利用“点击”化学标记改性半导体纳米晶体的方法的某些实施方案中，改性纳米晶体可以具有叠氮化物基团，而标记物具有炔基团。在其它实施方案中，改性纳米晶体可以具有炔基团，而标记物具有叠氮化物基团。
[0156]在某些实施方案中，炔或叠氮化物衍生化的纳米晶体是可水分散的，以使得该反应可以在水性介质中进行。铜源通常以溶液形式加入。但是，在某些实施方案中，使用被铜离子淬灭的发荧光纳米晶体。在这种方法中，表面结合的铜离子可以有助于催化该点击反应，以使得可以减少额外铜离子的量；在一些方法中，可以完全不需要加入额外的铜离子。因此，任选地点击反应可以在至少一种还原剂的存在下进行。
[0157]在本文所述利用“点击”化学标记改性生物分子的方法的某些实施方案中，包含“点击”化学反应物的溶液还包含Cu(I)离子；Cu⑴离子和铜螯合剂；Cu(II)离子和至少一种还原剂；或Cu(II)离子、至少一种还原剂和铜螯合剂。
[0158]缀合后，纳米晶体缀合物的荧光发射通常减小或甚至完全淬灭。纳米晶体与活化剂(例如含活化剂的溶液)接触引起纳米晶体的荧光发射强度增加。可用于恢复点击缀合后纳米晶体发射的代表性活化剂包括如本文所公开的氰化物源。在某些实施方案中，氰化物源包括如本文所公开的氰根离子、有机氰化物化合物(例如异腈)或生氰底物。用活化剂处理缀合纳米晶体可以将纳米晶体的荧光发射恢复至其初始值的至少50%、或至少60%、或至少70 %、或至少80 %、或至少90 %。 [0159]用作“点击”化学反应催化剂的铜通常呈Cu(I)还原态。用在铜催化叠氮化物-炔环加成中的合适Cu(I)源可以是任何亚铜盐，包括但不限于卤化亚铜如溴化亚铜或碘化亚铜。区域选择性环加成也可以在金属催化剂和还原剂存在下进行。在某些实施方案中，在还原剂存在下铜可以以Cu(II)还原态(例如作为盐，例如但不限于Cu(N03)2、Cu(OAc)2或CuSO4)提供，其中Cu(I)通过Cu(II)还原原位形成。这种还原剂包括但不限于抗坏血酸盐、三(2-羧乙基)膦(1^^?)、應0!1、應0?!1、硫代硫酸盐、金属铜、氢醌、维生素1(1、谷胱甘肽、半胱氨酸、2-巯基乙醇、二硫代苏糖醇、Fe2+、Co2+或施加电势。在其它实施方案中，还原剂包括选自 Al、Be、Co、Cr、Fe、Mg、Mn、N1、Zn、Au、Ag、Hg、Cd、Zr、Ru、Fe、Co、Pt、Pd、N1、Rh 和 W的金属。
[0160]铜(I)-催化叠氮化物-炔环加成可以在水和各种溶剂中进行，包括水和各种(部分)混溶有机溶剂包括醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、叔丁醇(tBuOH)和丙酮的混合物。
[0161]铜离子在水性溶剂中可以不稳定。因此，稳定化配体/螯合剂可以用于提高反应效率。在某些实施方案中，至少一种铜螯合剂用在本文所述方法中，其中这种螯合剂结合Cu(I)态的铜。在其它实施方案中，至少一种铜螯合剂用在本文所述方法中，其中这种螯合剂结合Cu(II)态的铜。在某些实施方案中，铜⑴螯合剂是含1，10-邻二氮菲的铜⑴螯合剂。这种含邻二氮菲的铜(I)螯合剂的非限制性例子包括但不限于红菲绕啉二磺酸(4，7-二苯基-1，10-邻二氮菲二磺酸)和浴铜灵二磺酸(BCS ;2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-邻二氮菲二磺酸酯)。在其它实施方案中，铜(I)螯合剂是THPTA、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、吡啶-2，6- 二羧酸(PDA)、S-羧甲基-L-半胱氨酸(SCMC)、曲恩汀、四亚乙基多胺(TEPA)、N，N，N，，N，-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)、EDTA、新亚铜试剂、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、吡啶-2，6- 二羧酸(PDA)、S-羧甲基-L-半胱氨酸(SCMC)、三-(苄基-三唑基甲基)胺(TBTA)或其衍生物。在某些实施方案中，EDTA用作螯合剂。在某些实施方案中，组氨酸用作螯合剂，而在其它实施方案中，谷胱甘肽用作螯合剂和还原剂。
[0162]本文所述“点击”化学反应中所用还原剂的浓度可以在微摩尔至毫摩尔的范围中。在某些实施方案中，还原剂的浓度为约100微摩尔至约100毫摩尔。在其它实施方案中，还原剂的浓度为约10微摩尔至约10毫摩尔。在其它实施方案中，还原剂的浓度为约I微摩尔至约I毫摩尔。
[0163]本文提供的半导体纳米晶体也可以用在许多其它类型的缀合反应中，包括但不限于用以将分子接枝到纳米晶体表面上的环加成反应。例如，可以为纳米晶体提供叠氮化物和炔基团，以使得它们可以通过利用激活炔与叠氮化物的反应而经历无催化剂的[3+2]环加成。炔可以通过环张力激活，例如仅作为例子的八元环结构，使吸电子基团附到这种炔环上，或炔可以通过加入路易斯酸例如仅作为例子的Au(I)或Au (III)来激活。
[0164]在利用本文所述激活炔标记改性纳米晶体的方法的某些实施方案中，半导体纳米晶体可以具有叠氮化物基团，而反应配偶体可以具有经激活的炔基团；在其它实施方案中，改性纳米晶体可以具有经激活的炔基团，而反应配偶体具有叠氮化物基团。
[0165]或者，将分子缀合到本文提供的半导体纳米晶体上也可以利用Staudinger连接反应来实现，该反应涉及三价磷化合物与有机叠氮化物之间的反应，这两种物质都可以与半导体纳米晶体缔合。本文所述Staudinger连接方法中所用的膦包括但不限于环状或无环的、卤化的、双磷或甚至聚合物的。类似地，叠氮化物可以是烷基、芳基、酰基或磷酰基。
[0166]在利用本文所述Staudinger连接标记改性纳米晶体的方法的某些实施方案中，改性纳米晶体可以具有叠氮化物基团，而反应配偶体具有膦基团，包括但不限于三芳基膦基团；而在其它实施方案中，改性反应配偶体可以具有膦基团，标记物具有叠氮化物基团。
[0167]本文所述的发荧光纳米晶体和组合物还可以构成试剂盒的一部分。本文提供用于各种生物应用和测定的试剂盒。
[0168]本文所公开的任一试剂盒所用的试剂盒试剂可以以溶液形式封装，可以作为液体介质(例如水或有机溶剂)中的悬浮液封装，或者可以与固体载体(例如载片、微芯片、珠粒、纤维、微孔板、纳米孔、磁盘或磁带)缔合。本文所公开的试剂盒还可以提供有关于使用试剂盒的说明书。
[0169]在一个实施方案中，试剂盒包括用于编码细胞或细胞组分的发荧光纳米晶体群。可用于用纳米晶体群编码细胞的额外缓冲液或其它试剂也可以包括在试剂盒(例如洗涤缓冲液如PBS、培育缓冲液，活化剂包括蛋白质或聚合物用以增强激活)中。此外，试剂盒可以设计用于多样应用，包含可用于同时编码多个不同细胞群的多个发荧光纳米晶体群。
[0170]本文所公开的试剂盒可以包括活化剂。例如，活化剂可以是氰化物源如氰化物盐，有机氰化物化合物，或生氰酶底物，以及对生氰底物呈特异性并且能切割生氰底物以释放氰根离子或异腈基团的生氰酶。
[0171]因此，一方面提供一种用于实施发荧光测定的试剂盒，包括如本文所公开的一个或多个发荧光纳米晶体群和活化剂，其中活化剂激活并增强发荧光纳米晶体的荧光发射。对于某些类型的试剂盒，发荧光纳米晶体可以与一种或多种抗体或寡核苷酸缔合。
[0172]还提供用于实施环加成反应例如点击反应的试剂盒。用于实施铜催化环加成反应的试剂盒可以包括一个或多个被炔反应性基团(例如叠氮基)或叠氮化物反应性基团(例如端炔、环辛炔或膦)官能化的荧光半导体纳米晶体群；可以包括例如作为Cu(I)或Cu(II)离子的铜源；至少一种活化剂如氰化物源(例如氰化物盐或有机氰化物化合物)；和任选至少一种还原剂。
[0173]在用于实施环加成反应的另一类型试剂盒中，试剂盒包括至少一个被Cu(I)或Cu(II)离子淬灭并用炔反应性基团或叠氮化物反应性基团官能化的发荧光半导体纳米晶体群。在某些包含发荧光、经铜淬灭的纳米晶体的试剂盒中，不包括额外的铜源。
[0174]下面实施例用来举例说明本文所述的实施方案，但并不限于这些实施方案。
实施例
[0175]实施例1
[0176]在水性溶剂中制备经淬灭的半导体纳米晶体
[0177]如下确定铜离子浓度对亲水性半导体纳米晶体的荧光发射的影响:将硫酸铜
(II)在水或缓冲液中的溶液(IOOnM-1OmM)缓慢加入亲水性半导体纳米晶体(例如LifeTechnologies Corporation, Carlsbad, CA的QDOT羧基或氨基半导体纳米晶体或QDOT抗生蛋白链菌素缀合物)的水性溶液(1ηΜ-500ηΜ)中。采用超滤浓缩该组合溶液，或利用尺寸排阻或离子交换色谱将其纯化。如图4所示，亲水性纳米晶体的荧光强度随铜离子浓度增加而下降。
[0178]实施例2
[0179]在非水性溶剂中制备经淬灭的半导体纳米晶体
[0180]将金属化合物(例如三氟甲磺酸铜(II))在有机溶剂(例如THF)中的溶液(IOOnM-1OmM)缓慢加入疏水性核/壳半导体纳米晶体在有机溶剂(例如氯仿)中的溶液(IOnM-1OuM)中。可以进一步处理疏水性经铜淬灭的粒子而使它们呈可水分散的。例如,可以使用醇沉淀离子，离心收集，接着再将其分散到所需的溶剂中。或者，可以使用两性聚合物将疏水性粒子交换到缓冲液中。图5是包覆聚合物的纳米晶体的荧光强度与淬灭溶液中铜离子浓度的函数关系图。
[0181]实施例3
[0182]氰化物激活经淬灭的半导体纳米晶体
[0183]将氰化物盐(例如氰化钾)在水或缓冲液中的溶液(10uM-500mM)缓慢加入如实施例1或实施例2所述制备的经铜淬灭的半导体纳米晶体(Life TechnologiesCorporation的QD0T625ITK羧基纳米晶体)在水或缓冲液中的(InM-1OOnM)溶液中。经铜淬灭的纳米晶体的发荧光响应与KCN浓度的函数关系示于图6。
[0184]实施例4
[0185]光激活经淬灭的半导体纳米晶体
[0186]采用激光器照明(在405nm)来激活经铜淬灭的纳米晶体的荧光。亲水性纳米晶体按实施例2所述使用两性和PEG聚合物的组合制备。将纳米晶体在pH为7.8或10的缓冲液中激活，可以经过和不经过氰化物处理。图7示出所测试的各材料的发荧光响应:A)经照明的未经淬灭的荧光纳米晶体(对照)；B)经淬灭的(pHIO，有照明);C)经淬灭的(pHIO，2mM KCN) ；D)经淬灭的(pHIO，有照明，2mM KCN) ；E)经淬灭的(pH7.8，有照明)JPF)经淬灭的(PH7.8，有照明，2mM KCN)。数据证实照射可以恢复经淬灭的纳米晶体的荧光发射强度。此外，激活可以通过照射纳米晶体与氰化物激活一起来显著增强和加速。
[0187]实施例5
[0188]酶促激活经淬灭的半导体纳米晶体
[0189]可以采用催化(例如酶促)、化学和光化学方法选择性生成用于恢复经淬灭的发荧光纳米晶体的荧光的活化剂。一旦纳米晶体的荧光发射恢复，这些纳米晶体可以用于利用许多类型的不同测定来检测宽范围的被分析物(例如蛋白质、寡核苷酸、小分子等)。
[0190]酶促激活纳米晶体荧光可以在多孔板中得到证实。多孔板的每个孔包含在10至300mM 的 pH 为 6 至 9 的缓冲液(例如 MES、ACES、MOPS、HEPES 或 Tris.CHES)中的 I 至 50nM经铜淬灭的QD0T585或QD0T625纳米晶体(例如按实施例1所述制备的)、10至200mM生氰底物(例如苦杏仁苷或野黑樱苷)和O至10 μ M β-葡糖苷酶。每个孔中最终的溶液体积可以为约10至300yL。将所有组分加入每个孔中，其中酶最后加入以起动荧光恢复。测定可以在约15至约60°C的温度下进行。根据测定约束条件，激活和读出可以在相同或不同温度和/或酸度下进行。可以在各种类型的仪器例如荧光读取器(例如Tecan Group Ltd.(Switzerland)的 M1000 读板器)或 qPCR 设备，例如 Applied Biosystems (Foster City,CA)的St印OnePlus?实时PCR系统上读取测定结果。
[0191]实施例6
[0192]两步生氰酶激活经淬灭的半导体纳米晶体
[0193]按实施例1或实施例2所述淬灭QD0T625纳米晶体(Life TechnologiesCorporation),并用通过在葡糖苷酶存在下水解苦杏仁苷生成的氰化物激活。将杏仁β -葡糖苷酶(Sigma ;St.Louis, MO)滴定成一系列样品，每个样品包含苦杏仁苷(Sigma)(IOOmM)。将酶、纳米晶体和底物在pH6-8下培育0_3小时。培育后，将溶液在冰上冷却，并加入在碱性缓冲液中的纳米晶体，以使溶液的PH为10。这同时起动纳米晶体激活并停止酶活性。使用 StepOnePlus? 实时 PCR 系统(Life Technologies Corporation)测量纳米晶体随时间的荧光发射。图8所示的终点滴定曲线表明发荧光纳米晶体激活发生在与生氰酶和底物生成的氰化物接触后。
[0194]实施例7
[0195]数字检测化学切换的半导体纳米晶体
[0196]本实施例描述采用全内反射荧光显微术在流动细胞模式化学切换纳米晶体荧光和在单分子水平的数字检测。用淬灭剂(例如Cu(II)盐)和活化剂(例如KCN)的溶液交替洗涤表面结合的发荧光纳米晶体，同时采集荧光显微镜上的图像。用5pM至IOnM的QD0T625抗生蛋白链菌素纳米晶体(Life Technologies Corporation)的含水溶液处理低密度生物素表面(例如MicroSurfaces，Inc.(Austin, TX)的BIO-Ol载片)以将纳米晶体结合到载片上。在充分的培育时段后，用大量的缓冲液洗掉没有结合的纳米晶体，接着使IOOnM至10μ M的Cu(II)溶液流过表面以淬灭剩余表面结合的纳米晶体的荧光。第二次洗涤除去多余的Cu(II)离子。通过用IOOyM至IOOmM KCN处理来激活经淬灭的纳米晶体。在激活后，从纳米晶体上洗去多余的KCN，并检测405nm激发下的荧光发射(图9)。
[0197]实施例8
[0198]数字检测化学切换的半导体纳米晶体
[0199]本实施例描述采用荧光显微术在流动细胞模式光激活纳米晶体荧光和在单分子水平的数字检测。用405nm激光器照射表面结合的发荧光纳米晶体，同时采集荧光显微镜上的图像。如实施例7所述制备并处理低密度生物素表面。在充分的培育时段后，用大量的缓冲液洗掉没有结合的纳米晶体。以适当功率(I至100W / cm2)照射相关区域，同时成像。图10示出以?20mW / cm2的功率照射之前(A)和之后(B)的经淬灭的纳米晶体。以20W / cm2至80W / cm2的功率照射的经光激活的纳米晶体的荧光响应示于图11。加入KCNdOuMM IOOmM)明显增大经淬灭的纳米晶体的光激活速率。照射(20W / cm2)与2mMKCN处理组合的影响绘于图11 (D)。
[0200]实施例9
[0201]增强量子产率
[0202]描述在不同反应条件下用氰化物处理亲水性半导体纳米晶体的效果。将硫醇包覆的纳米晶体分散在含水缓冲液(pH7.5，50mM Tris、4mM NaCl)中。将在水中的0.5M KCN加入纳米晶体分散液中以提供143mM KCN溶液，并培育反应混合物。在不同时间点后测量纳米晶体的量子产率。图12示出处理(A)前以及用氰化物培育(B) 12分钟、(036分钟和(D) 135分钟后的量子产率图。这些数据证实荧光纳米晶体的量子产率可以通过用氰化物源处理显著增强。
[0203]实施例10
[0204]光学检测活细胞中的发荧光纳米晶体
[0205]将活HeLa细胞用发荧光纳米晶体编码，并利用光激活恢复该活细胞中的发荧光纳米晶体的荧光。通过将1-8 μ M按实施例2所述制备的，最大发射波长为625nm的亲水性经铜淬灭的纳米晶体与l-3mL新鲜生长介质或Ix HBSS (Life Technologies Corporation)混合来制备标记溶液。生长介质包括GIBCO最低必需介质(MEM) (Life TechnologiesCorporation)和 10%FBS(Life Technologies Corporation)。将该标记溶液加入在 35mm玻璃底盘传代培养过夜的单层HeLa细胞上。在37°C和95%空气、5% CO2的湿气氛中培育45-120分钟后，用新鲜的生长介质(包含MEM和10% FBS)或缓冲液(例如Ix PBS或IxHBSS)两次洗涤细胞。
[0206]利用共焦显微镜，在整个细胞或细胞区域中，使用激光器照射(在405nm或458nm)激活经铜淬灭的纳米晶体的荧光。测量激活前(即正好在照射开始之后)和一段长时间照射后(?7分钟)的荧光强度。图13示出针对在HPSS或生长介质中培育或成像的样品采集的荧光数据。结果表明，发荧光响应对于在MEM和10% FBS存在下成像的纳米晶体大部分增强。
[0207]实施例U
[0208]激活并检测溶液中的发荧光纳米晶体
[0209]利用LED (Mouser Electronics的UV VCC标准)对在96孔板中的经铜淬灭的纳米晶体进行实时光激活和成像。通过将1-8 μ M按实施例2所述制备的，最大发射波长为625nm的亲水性经铜淬灭的纳米晶体与l_3mLGIBC0最低必需生长介质(60% MEM)和/或20% FBS混合来制备标记溶液。所有样品包含50mM MES或HEPES缓冲液并且在pH6_8。
[0210]图14 示出在(A) FBS (20% ), (B)MEM(60% ) FBS (20 % ), (C)MEM(60% )、或(D)单独的缓冲液中激活和成像的样品随时间的发荧光响应。经淬灭的纳米晶体的光激活动力学和终点荧光在FBS存在下显著增强。当该实验使用聚乙烯亚胺或BSA进行时还实现增强。
[0211]实施例12
[0212]苯乙醇腈激活经淬灭的半导体纳米晶体
[0213]在IOOmM MES、pH6.0中制备一系列苯乙醇腈稀释液。该系列稀释液中苯乙醇腈浓度为40mM至0.68 μ M，并与仅有缓冲液的对比反应比较。将如本文所述制备的(20ηΜ，在IM CHES中、pHI0.0)经铜淬灭的核-壳半导体纳米晶体加入苯乙醇腈稀释液中，最终浓度为4nM。将反应物混合，并以IOOOXg离心I分钟。在室温用405nm LED照射一组激活反应物15分钟。第二组反应在不存在任何照射下继续并保护起来避光15分钟。检测激活实验后的纳米晶体的荧光(405nm激发/ 625nm发射)。经铜淬灭的纳米晶体在(A) LED照射下和(B)没有LED照射的发荧光响应与苯乙醇腈浓度的函数关系示于图15。
[0214]实施例13
[0215]缀合和提纯AbG-抗生蛋白链菌素用于ELISA
[0216]将杏仁的β -葡糖苷酶(AbG) (Sigma-Aldrich C0.，St.Louis, MO)溶解在 50mMM0PS、pH7.0和IOOmM NaCl中至最终浓度为25mg / mL。将该溶液装载到4°C用50mM MOPS、ρΗ7.0 和 IOOmM NaCl 平衡的 SUPERDEX200 (GE Healthcare Bio-Sciences, AB, Sweden)尺寸排阻柱上。筛分洗脱级分(每个1.5mL)用于对硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷(pNPbG)水解。通过SDS-PAGE拆分水解阳性的级分，并合并包含纯AbG的那些。对于抗生蛋白链菌素(SA)标记，将0.5mg AbG与10倍摩尔过量的SM(PEG)24交联剂(Thermo Scientific,Rockford, IL)(溶解在纯DMSO中)组合在pH为7.0的IOOmM磷酸钠中。同时，使Img SA与10倍摩尔过量的Traut试剂(溶解在纯DMS0)在pH为7.0的IOOmM磷酸钠中反应。将这两种反应体系在室温摇动培育30分钟，之后使用用IOOmM磷酸钠、pH7.0和5mM EDTA平衡的 P30 脱盐柱(Bio-Rad Laboratories 的 B10-SPIN30 柱)分离 AbG-PEG24-马来酰亚胺和SA-SH。将从以上反应获得的AbG-PEG24-马来酰亚胺和SA-SH混合，并室温摇动培育2小时。使用用50mM M0PS、pH7.0和IOOmM NaCl溶液平衡的P30脱盐旋转柱分离AbG-PEG24-SA缀合物。通过SDS-PAGE拆分确认缀合。在SUPERDEX200柱上通过尺寸排阻从游离抗生蛋白链菌素中提纯缀合物。筛分柱级分用于用生物素包覆的96孔板(Thermo Scientific)的生物素结合。筛分来自板结合测定的结合和可溶物质用于PNPbG水解活性。将在结合相中而非在可溶相中包含水解活性的尺寸排阻级分合并并用于ELISA。
[0217]实施例14
[0218]经铜淬灭的半导体纳米晶体和AbG-SA IL-6ELISA
[0219]利用人类IL-6 超灵敏 ELISA 试剂盒(KHC0064C ;Life Technologies, Carlsbad,CA)进行ELISA实验。制备一系列2倍IL-6稀释液，浓度覆盖400pg / mL至6.25pg/mL的范围。将含IL-6的反应体系与仅有缓冲液(不含IL-6)的阴性对照进行比较。对每个IL-6滴定点制备重复液(N=6)。按照制造商的规定形成抗IL-6免疫复合物。对于IL-6检测，将AbG-PEG24-SA缀合物替代来自ELISA试剂盒的辣根过氧化物酶抗生蛋白链菌素缀合物(HRP-SA)加入。用免疫复合物将AbG-PEG24-SA(10皮摩尔、830ng/孔)缀合物在定轨摇床上室温培育45分钟。除去上清液，并通过用0.4mL ELISA试剂盒洗涤缓冲液清洗每个孔6次来洗掉未结合的AbG-PEG24-SA。通过加入IOOmM苦杏仁苷(Sigma-Aldrich)在5OmMMES、pH5.5中的溶液(50 μ L)并在50°C摇动培育2小时，使苦杏仁苷水解反应在ELISA板孔中进行。2小时后，将16 μ L的各水解反应体系转移到新的96孔板中，并将其与20ηΜ如实施例2制备的亲水性经铜淬灭的纳米晶体(最终浓度为4ηΜ)(用PEG包覆)在IM CHES,pHI0.0 (最终浓度为200mM)的溶液(4 μ L)混合。用光学粘附膜密封该板，并在4°C用405nmLED照射激活反应体系30分钟。检测激活后的纳米晶体荧光(405nm激发/ 625nm发射)。纳米晶体的发荧光响应与IL-6浓度关系示于图16。[0220]前面实施例举例说明本发明的多个方面和本发明方法的实施。这些实施例并非意在提供对本发明许多不同实施方案的穷举性描述。因此，虽然为了理解清楚已经通过举例说明和实施例详细地描述前面的发明，但是本领域普通技术人员将容易实现在不脱离下面各项和所附权利要求的精神或范围下可以对其进行许多变化和修改。
[0221]实施方案可以符合下面编号的各项:
[0222]1.一种发荧光半导体纳米晶体，包括:
[0223]荧光半导体纳米晶体；和
[0224]与半导体纳米晶体缔合的淬灭基团，其中荧光半导体纳米晶体在不存在淬灭基团下具有初始荧光强度(Ftl),发荧光半导体纳米晶体具有经淬灭的荧光强度(Fq)，其中Fq /F。小于约1.0。
[0225]2.根据第I项的纳米晶体，其中发荧光半导体纳米晶体是基本非发射性的。
[0226]3.根据第I或2项的纳米晶体，其中多于50个淬灭基团与纳米晶体缔合。
[0227]4.根据第1、2或3项的纳米晶体，其中淬灭基团是或包括金属源。
[0228]5.根据第1、2或3项的纳米晶体，其中淬灭基团是或包括过渡或非过渡金属离子。
[0229]6.根据第1、2或3项的纳米晶体，其中淬灭基团是或包括选自Cu(I)、Cu(II)、Ag (I)、Hg (1、II)、Pb (II)、Pb (IV)、Fe (II)、Fe (III)、Co (II)、Ni (II)和 Cr (1、I1、II1、IV、V或VI)的金属离子。
[0230]7.根据第1、2或3项的纳米晶体，其中淬灭基团是或包括选自S2_、Se' F_、Cl'Br—、T、Te2-或As3—和膦酸根的阴离子；或包含硫醇或硫醇盐基团的有机配体。
[0231]8.根据任一前项的纳米晶体，还包括在半导体纳米晶体表面上使得纳米晶体可水分散的亲水层
[0232]9.根据任一前项的纳米晶体，还包括连接到半导体纳米晶体或亲水层上的生物分子，其中生物分子选自核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、氨基酸、多肽、蛋白质、多糖、脂质和生物素。
[0233]10.根据任一前项的纳米晶体，其中纳米晶体包括半导体核和设置在半导体核上的半导体外壳层。
[0234]11.一种纳米晶体群，包括多个根据任一前项的发荧光半导体纳米晶体。
[0235]12.—种组合物，包含:
[0236]第11项的发荧光半导体纳米晶体群；和
[0237]水性或有机介质或固体载体，其中纳米晶体与载体(如果存在)缔合。
[0238]13.一种用于制备发荧光纳米晶体的方法，包括:
[0239]a)提供包含荧光半导体纳米晶体和至少一种溶剂的反应混合物；以及
[0240]b)向反应混合物中加入其量足以减小半导体纳米晶体的荧光发射的淬灭基团。
[0241]14.根据第13项的方法，其中将多个淬灭基团加入反应混合物中。
[0242]15.根据第13或14项的方法，其中在加入淬灭基团后荧光发射信号减少至少50%。
[0243]16.根据第14或15项的方法，其中约10_8M至约10_3M淬灭基团存在于反应混合物中。
[0244]17.根据任一前项的方法，其中将多于50个淬灭基团/纳米晶体加入反应混合物中。
[0245]18.根据任一前项的方法，其中淬灭基团是或包括金属源。
[0246]19.根据任一前项的方法，其中淬灭基团是或包括过渡或非过渡金属离子。
[0247]20.根据任一前项的方法，其中淬灭基团是或包括选自Cu(I)、Cu(II)、Ag(I)、Hg (I, II) >Pb(II) ,Pb(IV) ,Fe(II) ,Fe (III), Co (II) ,Ni(II)和 Cr (1、I1、II1、IV、V 或 VI)的金属离子；或选自S2_、Se2_、F_、Cl_、Br_、r、Te2_*As3_和膦酸根的阴离子；或包含硫醇或硫醇盐基团的有机配体。
[0248]21.根据任一前项的方法，其中荧光半导体纳米晶体是可水分散的。
[0249]22.根据任一前项的方法，还包括在加入淬灭基团后用使得纳米晶体可水分散的亲水性化合物处理半导体纳米晶体。
[0250]23.根据任一前项的方法，还包括将有机分子(例如生物分子)附着到纳米晶体上。
[0251]24.一种根据任一前项的方法制备的发荧光纳米晶体群。
[0252]25.一种激活发荧光半导体纳米晶体的方法，包括:
[0253]a)提供根据第I至10项中任一项的发荧光半导体纳米晶体；
[0254]b)使纳米晶体与活化剂接触，其中发荧光半导体纳米晶体在与活化剂接触后的荧光强度增加。
[0255]26.根据第25项的方法，其中纳米晶体在与活化剂接触后具有经激活的荧光强度(Fa)，其中Fa / Fq大于I。
[0256]27.根据第25或26项的方法，其中Fa / Fq为10或更大。
[0257]28.根据第25、26或27项的方法，其中活化剂是还原剂、氧化剂、质子或金属离子
结合化合物。
[0258]29.根据第25、26或27项的方法，其中活化剂选自氰化物、腈、异腈、叠氮化物、硫氰酸酯、胺、咪唑、硫醇盐、羧酸盐、NO、CO、卤化物、过氧化物、ROS和氢氧化物。
[0259]30.根据第25、26或27项的方法，其中活化剂包括氰化物、异腈或腈源。
[0260]31.根据第25、26或27项的方法，其中活化剂是氰根离子、氰化物盐或有机氰化物。
[0261]32.根据第25、26或27项的方法，还包括使纳米晶体与能够释放异腈或氰化物基团的生氰底物接触。
[0262]33.根据第32项的方法，还包括使底物水解以释放氰根离子。
[0263]34.根据第32或33项的方法，其中底物是生氰酶底物。
[0264]35.根据第32、33或34项的方法，其中底物选自苦杏仁苷、野黑樱苷、蜀黍苷、巢菜苷、亚麻苦苷、百脉根苷、氰醇、氰醇酯、氰醇酰胺、丙酮氰醇、苯乙醇腈和酰基氰化物。
[0265]36.根据第34或35项的方法，还包括使生氰底物与能够切割生氰底物以释放包含异腈基团或氰化物基团的化合物的生氰酶接触。
[0266]37.根据第35或36项的方法，其中生氰酶是葡糖苷酶。
[0267]38.根据第35或36项的方法，其中生氰酶选自杏仁β -葡糖苷酶、苦杏仁苷酶和亚麻仁苷酶。
[0268]39.根据第34、35、36或37项的方法，还包括使生氰酶底物与裂解酶、酯酶、蛋白酶或半乳糖酶接触。
[0269]40.根据任一前项的方法，还包括使发荧光纳米晶体与金属螯合剂接触。
[0270]41.一种根据第25至40项中任一项的方法制备的经激活荧光纳米晶体群。
[0271]42.一种检测样品中目标被分析物的存在的方法，包括:
[0272]a)提供能够释放氰化物源的生氰底物；
[0273]b)使样品与根据第I至10项中任一项的发荧光半导体纳米晶体接触，其中纳米晶
体与第一结合基团缔合；
[0274]c)使样品与第二结合基团接触，其中第二结合基团与生氰酶缔合，并且第一和第二结合基团不同，其中第一和第二结合基团与被分析物(如果存在)结合；
[0275]d)使生氰酶与生氰底物接触，由此从生氰底物释放氰化物源；以及
[0276]e)检测发荧光半导体纳米晶体的荧光发射，其中荧光发射信号的强度增加表示样品中存在被分析物。
[0277]43.一种检测样品中被分析物的存在的方法，包括:
[0278]a)提供i)能够释放氰化物源的生氰底物，和ii)根据第I至10项中任一项的发突光纳米晶体；
[0279]b)使样品与结合基团和第二结合基团接触，其中第一结合基团和第二结合基团不同，第一和第二结合基团与被分析物(如果存在)结合，其中第一结合基团与生氰酶缔合；
[0280]c)使生氰酶与生氰底物接触以在纳米晶体存在下释放氰化物源；以及
[0281]d)检测发荧光半导体纳米晶体的荧光发射，其中荧光发射信号的强度增加表示样品中存在被分析物。
[0282]44.根据第43项的方法，其中第一结合基团与第三结合基团缔合，第三结合基团与生氰酶缔合。
[0283]45.一种检测样品中被分析物的存在的方法，包括:
[0284]a)提供固体载体，其中载体与第一结合基团和生氰酶缔合；
[0285]b)使固体载体与样品和第二结合基团接触，其中第一和第二结合基团与被分析物(如果存在)结合，第二结合基团与根据第I至10项中任一项的发荧光半导体纳米晶体缔合，并且其中第一和第二结合基团不同；
[0286]c)使生氰酶与生氰底物接触以释放氰化物源；以及
[0287]d)检测发荧光半导体纳米晶体的荧光发射，其中荧光发射信号的强度增加表示样品中存在被分析物。
[0288]46.根据第42至45项中任一项的方法，其中第一和/或第二结合基团选自抗体、寡核苷酸、适配体和化学结合基团(例如聚合物、金属配体、蛋白质结合化学物质、活性探针)。
[0289]47.根据第42至45项中任一项的方法，其中第一结合基团与固体载体缔合，所述方法任选还包括在加入生氰底物之前洗涤固体载体。
[0290]48.根据第42至45项中任一项的方法，其中被分析物是生物分子、细胞或小的无机或有机分子。
[0291]49.一种检测样品中核酸的存在的方法，包括:
[0292]a)使样品与根据第I至10项中任一项的发荧光半导体纳米晶体接触，其中纳米晶体与具有已知序列的第一核酸缔合；
[0293]b)使样品与具有已知序列的第二核酸接触，其中第二核酸与生氰酶缔合；
[0294]c)使生氰酶与生氰底物接触，由此从生氰底物释放氰化物源(例如氰根离子或异腈基团)；以及
[0295]e)检测发荧光半导体纳米晶体的荧光发射，其中荧光发射信号的强度增加表示存在具有能够与第一和第二核酸链杂交的序列的核酸链。
[0296]50.一种发突光测定体系,包括:
[0297]a)根据第I至10项中任一项的发荧光半导体纳米晶体，其中纳米晶体与第一结合
基团缔合；
[0298]b)与第二结合基团缔合的生氰酶，其中第二结合基团不同于结合基团，并且其中第一和第二结合基团与被分析物缔合；和
[0299]c)在与生氰酶接触后能够释放氰化物源(例如氰根离子或异腈基团)的生氰底物。
[0300]51.根据第50项的测定体系，其中生氰酶和/或第二结合基团与固体载体缔合。
[0301]52.一种激活半导体纳米晶体的方法，包括:
[0302]a)提供至少一种根据第I至10项中任一项的荧光半导体纳米晶体或发荧光纳米晶体；
[0303]b)使半导体纳米晶体与化合物接触以调节纳米晶体的至少一种光学性质；以及
[0304]c)确定纳米晶体的位置。
[0305]53.根据第52项的方法，其中所确定的第一纳米晶体和第二纳米晶体的位置的准确度小于第一和/或第二纳米晶体所发射的光的波长。
[0306]54.一种检测样品中氰根离子的方法，包括:
[0307]a)提供样品；
[0308]b)使样品与根据第I至10项中任一项的发荧光半导体纳米晶体接触，其中淬灭基团能够与氰离子络合；以及
[0309]c)检测纳米晶体的荧光发射，其中荧光发射信号的强度增加表示样品中存在氰根离子。
[0310]55.一种增强半导体纳米晶体的亮度的方法，包括:
[0311]a)提供荧光半导体纳米晶体；以及
[0312]b)使纳米晶体与活化剂接触，以使纳米晶体群的荧光发射强度增加至少10%。
[0313]56.根据第55项的方法，其中活化剂包括氰化物源。
[0314]57.一种将化合物附着到半导体纳米晶体上的方法，包括:
[0315]a)接触包含炔反应性基团或叠氮化物反应性基团的荧光半导体纳米晶体；
[0316]b)使纳米晶体与包含能够在Cu⑴或Cu(II)离子存在下与化合物的炔反应性基团或叠氮化物反应性基团反应的基团的反应性材料接触；以及
[0317]c)使纳米晶体与活化剂接触，其中纳米晶体在与活化剂接触后的荧光发射强度增加。
[0318]58.—种试剂盒，包括:
[0319]a)根据第24项的发荧光纳米晶体群；和[0320]b)活化剂。
[0321]59.—种试剂盒，包括:
[0322]a)根据第24项的发荧光纳米晶体群；
[0323]b)生氰酶；和
[0324]b)生氰底物。
[0325]60.—种试剂盒，包括:
[0326]a)荧光纳米晶体群；
[0327]b)铜源；
[0328]c)生氰酶；和
[0329]d)生氰底物。
[0330]61.—种试剂盒，包括；
[0331]a)荧光半导体纳米晶体群，其中群中每个半导体纳米晶体包含炔反应性基团或叠氮化物反应性基团；
[0332]b)铜源；和
[0333]c)至少一种活化剂。
[0334]62.一种鉴定样品中细胞或细胞组分的方法，包括:
[0335]a)使样品中的细胞或细胞组分与根据第I至10项中任一项的发荧光半导体纳米晶体在其中纳米晶体被输送通过细胞膜的条件下接触以提供经标记的细胞或细胞组分；
[0336]b)将经标记的细胞或细胞组分暴露于激发能量源以激活半导体纳米晶体，使得经激活的纳米晶体具有荧光强度(FA)，其中FA/FQ大于I ;和
[0337]c)检测经激活的纳米晶体的荧光发射，由此鉴别样品中的细胞或细胞组分。
[0338]63.一种鉴别细胞混合群中的细胞的方法，包括:
[0339]a)使第一细胞与根据第I至10项中任一项的发荧光半导体纳米晶体在其中纳米晶体与细胞缔合的条件下接触以提供第一经标记的细胞；
[0340]b)使第一经标记的细胞与和第一细胞不同的第二细胞混合以形成细胞混合群；
[0341]c)培养细胞混合群；
[0342]d)将经标记的细胞暴露于激发能量源以激活半导体纳米晶体，使得经激活的纳米晶体具有荧光强度(Fa)，其中Fa / Fq大于I ;以及
[0343]e)检测经激活的纳米晶体的荧光发射，由此鉴别细胞混合群中的第一经标记的细胞。
[0344]64.根据第62或63项的方法，其中细胞是哺乳动物或酵母细胞。
[0345]65.根据第62、63或64项的方法，其中细胞是活细胞。
[0346]66.根据第62、63、64或65项的方法，还包括在将经标记的细胞或细胞组分暴露于激发能量源之前或过程中使经标记的细胞或细胞组分与活化剂接触。
[0347]67.一种用于检测发荧光纳米晶体的方法，包括:
[0348]a)将根据第I至10项中任一项的发荧光纳米晶体置于光子晶体传感器的表面上；
[0349]b)用光照射光子晶体传感器，由此使传感器表现出引出共振模式，该模式所具有的光谱与发荧光纳米晶体的发射光谱至少部分重叠，其中照射和引出共振模式激活发荧光纳米晶体，使得经激活的纳米晶体具有荧光强度(Fa)，其中Fa / Fq大于I ;和
[0350]c)检测经激活的纳米晶体的发射光，由此检测发荧光纳米晶体。
[0351]68.根据第70项的方法，还包括使发荧光纳米晶体与活化剂接触，由此提高激活速率和/或荧光强度。
[0352]69.根据任一前项的方法或试剂盒，其中活化剂是聚合物或蛋白质。
[0353]70.根据任一前项的方法或试剂盒，其中活化剂是胎牛血清、牛血清白蛋白、酪蛋白、山羊血清或鱼血清。
[0354]71.根据任一前项的方法或试剂盒，其中活化剂是聚乙烯亚胺、多肽、聚乙二醇或聚丙烯酸或其衍生物。
[0355]72.根据任一前项的方法或试剂盒，其中活化剂是还原剂、氧化剂、质子或金属离子结合化合物。
[0356]73.根据任一前项的方法或试剂盒，其中活化剂选自氰化物、腈、异腈、叠氮化物、硫氰酸酯、胺、咪唑、硫醇盐、羧酸盐、NO、CO、卤化物、过氧化物、ROS和氢氧化物.[0357]74.根据任一前项的方法或试剂盒，其中活化剂包括氰化物、异腈或腈源。
[0358]75.根据任一前项的方法或试剂盒，其中活化剂是氰根离子、氰化物盐或有机氰化物。
[0359]76.根据任一前项的发荧光半导体纳米晶体用于鉴定样品中细胞或细胞组分的用途。
[0360]77.根据任一前项的发荧光半导体纳米晶体在生物测定中或用于检测样品中目标被分析物的用途。
[0361]78.根据任一前项的发荧光半导体纳米晶体作为氰根离子传感器的用途。
【权利要求】
1.一种发荧光半导体纳米晶体，包括: 荧光半导体纳米晶体；和 与所述半导体纳米晶体缔合的淬灭基团，其中所述荧光半导体纳米晶体在不存在所述淬灭基团下具有初始荧光强度(Ftl),所述发荧光半导体纳米晶体具有经淬灭的荧光强度(Fq)，其中Fq / F。小于约1.0。
2.根据权利要求1所述的纳米晶体，其中所述发荧光半导体纳米晶体是基本非发射性的。
3.根据权利要求1所述的纳米晶体，其中多于50个淬灭基团与所述纳米晶体缔合。
4.根据权利要求1所述的纳米晶体，其中所述淬灭基团是或包括金属源。
5.根据权利要求1所述的纳米晶体，其中所述淬灭基团是或包括过渡或非过渡金属离子。
6.根据权利要求1所述的纳米晶体，其中所述淬灭基团是或包括选自Cu(I)、Cu(II)、Ag (I)、Hg (1、II) 、Pb (II)、Pb (IV)、Fe (II)、Fe (III)、Co (II)、Ni (II)和 Cr (1、I1、II1、IV、V或VI)的金属离子。
7.根据权利要求1所述的纳米晶体，其中所述淬灭基团是或包括选自S2_、Se2_、F_、Cl_、Br、I、Te2-或As3—和膦酸根的阴离子；或包含硫醇或硫醇盐基团的有机配体。
8.根据权利要求1所述的纳米晶体，还包括在所述半导体纳米晶体表面上使得所述纳米晶体可水分散的亲水层。
9.根据权利要求1或9所述的纳米晶体，还包括连接到所述半导体纳米晶体或亲水层上的生物分子，其中所述生物分子选自核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、氨基酸、多肽、蛋白质、多糖、脂质和生物素。
10.根据权利要求1所述的纳米晶体，其中所述纳米晶体包括半导体核和设置在所述半导体核上的半导体外壳层。
11.一种纳米晶体群，包括多个根据权利要求1至10中任一项所述的发荧光半导体纳米晶体。
12.—种组合物，包含: 根据权利要求11所述的发荧光半导体纳米晶体群；和 水性或有机介质或固体载体，其中如果存在载体，所述纳米晶体与所述载体缔合。
13.一种用于制备发荧光纳米晶体的方法，所述方法包括: a)提供包含荧光半导体纳米晶体和至少一种溶剂的反应混合物；以及 b)向所述反应混合物中加入其量足以减小所述半导体纳米晶体的荧光发射的淬灭基团或多个淬灭基团。
14.根据权利要求13所述的方法，其中在加入所述淬灭基团后所述荧光发射信号减少至少50%。
15.根据权利要求13所述的方法，还包括将多于50个淬灭基团/纳米晶体加入所述反应混合物中。
16.根据权利要求13所述的方法，其中约10_8M至约10_3M的淬灭基团存在于所述反应混合物中。
17.根据权利要求13所述的方法，其中所述淬灭基团是或包括金属源。
18.根据权利要求13所述的方法，其中所述淬灭基团是或包括过渡或非过渡金属离子。
19.根据权利要求13所述的方法，其中所述淬灭基团是或包括选自Cu(I)、Cu(II)、Ag (I)、Hg (1、II)、Pb (II)、Pb (IV)、Fe (II)、Fe (III)、Co (II)、Ni (II)和 Cr (1、I1、II1、IV、V或VI)的金属离子；或选自S2_、Se2-、F_、Cl' Br' I-、Te2_或As3_和膦酸根的阴离子；或包含硫醇或硫醇盐基团的有机配体。
20.根据权利要求13所述的方法，其中所述荧光半导体纳米晶体是可水分散的。
21.根据权利要求13所述的方法，还包括在加入所述淬灭基团后用使得所述纳米晶体可水分散的亲水性化合物处理所述半导体纳米晶体和/或将有机分子附着到所述纳米晶体上。
22.一种根 据权利要求13至21中任一项所述的方法制备的发荧光纳米晶体群。
23.一种激活发荧光半导体纳米晶体的方法，所述方法包括: a)提供根据权利要求1至10中任一项所述的发荧光半导体纳米晶体； b)使所述纳米晶体与活化剂接触，其中所述发荧光半导体纳米晶体在与所述活化剂接触后的荧光强度增加。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述纳米晶体在与所述活化剂接触后具有经激活的荧光强度(Fa)，其中Fa / Fq大于I。
25.根据权利要求23所述的方法，其中Fa/ Fq为10或更大。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述活化剂是还原剂、氧化剂、质子或金属离子结合化合物。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述活化剂选自氰化物、腈、异腈、叠氮化物、硫氰酸酯、胺、咪唑、硫醇盐、羧酸盐、NO、CO、卤化物、过氧化物、ROS和氢氧化物。
28.根据权利要求23所述的方法，其中所述活化剂包括氰化物、异腈或腈源。
29.根据权利要求23所述的方法，其中所述活化剂是氰根离子、氰化物盐或有机氰化物。
30.根据权利要求23所述的方法，还包括使所述纳米晶体与能够释放异腈或氰化物基团的生氰底物接触。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述底物是生氰酶底物。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述底物选自苦杏仁苷、野黑樱苷、蜀黍苷、巢菜苷、亚麻苦苷、百脉根苷、氰醇、氰醇酯、氰醇酰胺、丙酮氰醇、苯乙醇腈和酰基氰化物。
33.根据权利要求30或31所述的方法，还包括使所述生氰底物与能够切割所述生氰底物以释放包含异腈基团或氰化物基团的化合物的生氰酶接触。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述生氰酶是葡糖苷酶。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述生氰酶选自杏仁β-葡糖苷酶、苦杏仁苷酶和亚麻仁苷酶。
36.一种根据权利要求23至35中任一项所述的方法制备的经激活的发荧光纳米晶体群。
37.一种检测样品中目标被分析物的存在的方法，所述方法包括: a)提供能够释放氰化物源的生氰底物；b)使所述样品与根据权利要求1至10中任一项所述的发荧光半导体纳米晶体接触，其中所述纳米晶体与第一结合基团缔合； c)使所述样品与第二结合基团接触，其中所述第二结合基团与生氰酶缔合，并且所述第一和第二结合基团不同，其中如果存在被分析物，所述第一和第二结合基团与所述被分析物结合； d)使所述生氰酶与所述生氰底物接触，由此从所述生氰底物释放氰化物源；以及 e)检测所述发荧光半导体纳米晶体的荧光发射，其中荧光发射信号强度的增加表示所述样品中存在所述被分析物。
38.一种检测样品中被分析物的存在的方法，所述方法包括: a)提供i)能够释放氰化物源的生氰底物，和ii)根据权利要求1至10中任一项所述的发突光纳米晶体； b)使所述样品与结合基团和第二结合基团接触，其中所述第一结合基团和所述第二结合基团不同，其中如果存在被分析物，所述第一和第二结合基团与所述被分析物结合，其中所述第一结合基团与生氰酶缔合； c)使所述生氰酶与所述生氰底物接触以在所述纳米晶体存在下释放所述氰化物源；以及 d)检测所述发荧光半导体纳米晶体的荧光发射，其中所述荧光发射信号强度的增加表示所述样品中存在所述被分析物。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述第一结合基团与第三结合基团缔合，所述第三结合基团与所述生氰酶缔合。
40.一种检测样品中被分析物的存在的方法，所述方法包括: a)提供固体载体，其中所述载体与第一结合基团和生氰酶缔合； b)使所述固体载体与所述样品和第二结合基团接触，其中如果存在被分析物，所述第一和第二结合基团与所述被分析物结合，其中所述第二结合基团与根据权利要求1至10中任一项所述的发荧光半导体纳米晶体缔合，并且其中所述第一和第二结合基团不同； c)使所述生氰酶与生氰底物接触以释放氰化物源；以及 d)检测所述发荧光半导体纳米晶体的荧光发射，其中所述荧光发射信号强度的增加表示所述样品中存在所述被分析物。
41.一种发突光测定体系,包括: a)根据权利要求1至10中任一项所述的发荧光半导体纳米晶体，其中所述纳米晶体与第一结合基团缔合； b)与第二结合基团缔合的生氰酶，其中所述第二结合基团不同于所述结合基团，并且其中所述第一和第二结合基团与被分析物缔合；和 c)在与所述生氰酶接触后能够释放氰化物源的生氰底物。
42.根据权利要求41所述的测定体系，其中所述生氰酶和/或所述第二结合基团与固体载体缔合。
43.一种激活半导体纳米晶体的方法，所述方法包括: a)提供至少一种根据权利要求1至10中任一项所述的荧光半导体纳米晶体或发荧光纳米晶体；b)使所述荧光或发荧光半导体纳米晶体与化合物接触以调节所述纳米晶体的至少一种光学性质；以及 C)确定所述纳米晶体的位置。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所确定的第一纳米晶体和第二纳米晶体的位置的准确度小于第一和/或第二纳米晶体所发射的光的波长。
45.一种将化合物附着到半导体纳米晶体上的方法，所述方法包括: a)接触包含炔反应性基团或叠氮化物反应性基团的荧光半导体纳米晶体； b)使所述纳米晶体与包含能够在Cu(I)或Cu(II)离子存在下与所述化合物的炔反应性基团或叠氮化物反应性基团反应的基团的反应性材料接触；以及 c)使所述纳米晶体与活化剂接触，其中所述纳米晶体在与所述活化剂接触后的荧光发射强度增加。
46.一种试剂盒,包括: a)根据权利要求11所述的发荧光纳米晶体群；和 b)活化剂。
47.—种试剂盒,包括； a)荧光半导体纳米晶体群，其中所述群中每个半导体纳米晶体包含炔反应性基团或叠氮化物反应性基团； b)铜源；和 c)至少一种活化剂。
48.一种鉴定样品中细胞或细胞组分的方法，所述方法包括: a)使所述样品中的细胞或细胞组分与根据权利要求1至10中任一项所述的发荧光半导体纳米晶体在其中所述纳米晶体被输送通过细胞膜的条件下接触以提供经标记的细胞或细胞组分； b)将所述经标记的细胞或细胞组分暴露于激发能量源以激活所述半导体纳米晶体，使得经激活的纳米晶体具有荧光强度(Fa)，其中Fa/Fq大于I ;和 c)检测所述经激活的纳米晶体的荧光发射，由此鉴别所述样品中的细胞或细胞组分。
49.一种鉴别细胞混合群中的细胞的方法，所述方法包括: a)使第一细胞与根据权利要求1至10中任一项所述的发荧光半导体纳米晶体在其中所述纳米晶体与所述细胞缔合的条件下接触以提供第一经标记的细胞； b)使所述第一经标记的细胞与和所述第一细胞不同的第二细胞混合以形成所述细胞混合群； c)培养所述细胞混合群； d)将所述经标记的细胞暴露于激发能量源以激活所述半导体纳米晶体，使得经激活的纳米晶体具有荧光强度(Fa)，其中Fa / Fq大于I ;以及 e)检测所述经激活的纳米晶体的荧光发射，由此鉴别所述细胞混合群中的所述第一经标记的细胞。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物或酵母细胞。
51.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述细胞是活细胞。
52.根据权利要求48或49所述的方法，还包括在将所述经标记的细胞或细胞组分暴露于所述激发能量源之前或过程中使所述经标记的细胞或细胞组分与活化剂接触。
53.根据权利要求23、37、38、40、48或49所述的方法，或根据权利要求41所述的测定，或根据权利要求46所述的试剂盒，其中所述活化剂是聚合物或蛋白质。
54.根据权利要求23、37、38、40、48或49所述的方法，或根据权利要求41所述的测定，或根据权利要求46所述的试剂盒，其中所述活化剂是胎牛血清、牛血清白蛋白、酪蛋白、山羊血清或鱼血清。
55.根据权利要求23、37、38、40、48或49所述的方法，或根据权利要求41所述的测定，或根据权利要求46所述的试剂盒，其中所述活化剂是聚乙烯亚胺、多肽、聚乙二醇或聚丙烯酸或其衍生物。
56.根据权利要求23、37、38、40、48或49所述的方法，或根据权利要求41所述的测定，或根据权利要求46所述的试剂盒，其中所述活化剂是还原剂、氧化剂、质子或金属离子结合化合物。
57.根据权利要求23、37、38、40、48或49所述的方法，或根据权利要求41所述的测定，或根据权利要求46所述的试剂盒，其中所述活化剂选自氰化物、腈、异腈、叠氮化物、硫氰酸酯、胺、咪唑、硫醇盐、羧酸盐、NO、CO、卤化物、过氧化物、ROS和氢氧化物。
58.根据权利 要求23、37、38、40、48或49所述的方法，或根据权利要求41所述的测定，或根据权利要求46所述的试剂盒，其中所述活化剂包括氰化物、异腈或腈源。
59.根据权利要求23、37、38、40、48或49所述的方法，或根据权利要求41所述的测定，或根据权利要求46所述的试剂盒，其中所述活化剂是氰根离子、氰化物盐或有机氰化物。
【文档编号】G01N33/569GK103765215SQ201280028024
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年6月7日 优先权日:2011年6月7日
【发明者】E.韦尔奇, D.布相, M.伊纳蒂乌斯, L.格林菲尔德 申请人:生命科技公司