专利名称：一种结核分枝杆菌cfp10抗原蛋白串联重组表达方法及其在结核检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域及医学免疫学领域，具体涉及结核病病人和结核杆菌感染者的快速、早期特异的检测方法，具体的涉及一种结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白及其应用，特别是一种结核病抗原CFPlO串联重组融合蛋白特异的全血IFN- Y结核诊断试剂盒及TCELL-SP0T结核感染诊断试剂盒的制作方法和应用方法。
背景技术：
结核病是由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染所致的人类疾病，主要通过呼吸道传播，且疫情发展日趋严重。结核病的预防、早期诊断和及时治疗意义重大。MTB标准菌株H37Rv被广泛应用于TB相关的生物医药研究，其特异性抗原的制备备受关注。目前常用的结核特异抗原可以通过基因工程方法大量制备，是结核诊断的基础。但是目前多集中于单独一种抗原的表达、单独抗原表位的表达、多种抗原联合表达的方法获得结核特异抗原，少有单一抗原串联重组表达的研究，且结核特异性抗原多直接用血清学方法检测结核感染，灵敏度低、特异性差。
发明内容
为克服上述现有技术的不足，本发明提供一种用基因工程方法生产的结核CFPlO串联重组融合蛋白作为抗原，特异性强且易于纯化，用其作为特异抗原制备了全血IFN-Y结核诊断试剂盒及TCELL-SP0T结核感染诊断试剂盒，为结核病感染的检测提供更为特异、灵敏、准确的工具。一种编码结核分枝杆菌CFPlO的密码子优化基因序列，其单拷贝核昔酸序列CFPIOcI如SEQ ID N0.1所示，2次拷贝串联核苷酸序列CFP10c2如SEQ ID N0.2所示，3次拷贝串联核苷酸序列CFP10 c3如SEQ ID N0.3所示，4次拷贝串联核苷酸序列CFP10c4如SEQ ID N0.4所示，5次拷贝串联核苷酸序列CFP10c5如SEQ ID N0.5所示，6次拷贝串联核苷酸序列CFP10c6如SEQ ID N0.6所示，CFPlO基因串联次数包括但不限于I 一 6次。结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白，它由所述的密码子优化基因序列编码，其单拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，2次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示，3次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示，4次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.10所示，5次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.11所示，6次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.12所示，CFPlO蛋白串联次数包括但不限于I 一 6次。结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白的表达载体，其将上述的密码子优化基因序列分别插入到质粒pET-16b上，得到重组质粒CFP10cl-pET16b、CFP10c2_pET16b、CFP10c3-pET16b、CFP10c4_pET16b、CFP10c5_pET16b 或 CFP10c6_pET16b，载体包括但不限于 pET16b。一种表达结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白的工程菌株，它含有上述的表达载体，其宿主菌为大肠杆菌{Escherichia coli) 一种基于所述结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白建立的体外检测结核杆菌感染的化学发光法试剂盒，其利用上述的结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白，刺激受检者的外周血释放Y-干扰素，并通过化学发光方法测定Y-干扰素的变化，诊断是否感染结核分枝杆菌。一种基于所述结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白建立的体外检测结核杆菌感染的TCELL-SP0T试剂盒，其上述的结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白，刺激受检者的外周血T淋巴细胞，并通过ELISPOT方法测定斑点形成的多少，诊断是否感染结核分枝杆菌。所述的结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白在制备单抗、多抗、检测试剂盒及蛋白芯片中的应用。
图1重组质粒CFP10cl-pET16b的构建示意 图2重组质粒CFP10c2-pET16b的构建示意 图3重组质粒CFP10c3-pET 16b的构建示意 图4重组质粒CFP10c4-pET16b的构建示意 图5重组质粒CFP10c5-pET16b的构建示意 图6重组质粒CFP10c6-pET16b的构建示意 图7 CFPIOcI重组融合蛋白的纯化图，图中泳道1，2，3 =CFPIOcI纯化带；泳道4:CFPIOcI纯化前；泳道5 =CFPIOcI纯化后；泳道6:NEB蛋白Marker ；
图8 CFP10c2重组融合蛋白的纯化图，图中泳道1，2，3，4:CFP10c2纯化带；泳道:5:CFP10c2纯化后；泳道6:CFP10c2纯化前；泳道7 =NEB蛋白Marker ；
图9 CFP10c3重组融合蛋白的纯化图，图中泳道1:NEB蛋白Marker ;泳道2:CFP10c3纯化前；泳道3:CFP10c3纯化后；泳道4，5，6，7:CFP10c3纯化带；
图10 CFP10c4重组融合蛋白的纯化图，图中泳道1: NEB蛋白Marker ;泳道2:CFP10c4纯化前；泳道3:CFP10c4纯化后；泳道4，5，6，7:CFP10c4纯化带；
图11 CFP10c5重组融合蛋白的纯化图，图中泳道1，2，3:CFP10c5纯化带；泳道4:CFP10c5纯化前；泳道5:CFP10c5纯化后；泳道6 =NEB蛋白Marker ；
图12 CFP10c6重组融合蛋白的纯化图，图中泳道1:CFP10c6纯化后；泳道2:CFP10c6纯化前；泳道3，4，5，6，7:CFP10c6纯化带；泳道8 =NEB蛋白Marker ；
图13为:TCELL-SP0T的检测结果图，图中a为结核感染者阳性对照孔；b为结核感染者CFPIOcI检测孔；c为结核感染者CFP10c2检测孔；d为结核感染者CFP10c3检测孔；e为结核感染者CFP10c4检测孔；f为结核感染者CFP10c5检测孔；g为结核感染者CFP10c6检测孔；h为结核感染者阴性对照孔。
具体实施例方式以下以通过优选实施例对本发明工艺作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。
具体实施例方式下面对本发明进一步说明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。实施例1结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白的制备
分析编码结核特异性抗原CFPlO的核苷酸序列，并结合疋coli的密码子偏好性，对CFPlO的核苷酸进行同义密码子的优化，并在其编码序列的两端加入设计好的限制性酶切位点，从而实现序列的串联表达。经过优化的核苷酸序列如下:
catatgggaattcccatggaggatccgatggcagagatgaagaccgatgccgctaccctggcgcaggaggcaggtaatttcgagcgtatctccggcgacctgaaaacccagatcgaccaggtggagtctacggcaggttcgttgcagggtcagtggcgcggtgcagcaggtacggcagcacaggcagcagtggtgcgcttccaagaagcagccaataagcagaagcaggaactcgacgaaatctcgacgaatattcgtcaggccggcgtccaatactctcgtgccgacgaggagcagcagcaggcgctgtcctcgcaaatgggcttcgcagatctggctaagcttcccgggtcgactcgagcggccgc
序列上游加入NdeI, NcoI和BamHl ;在序列下游加入HindIII, BglII和XhoI等限制性酶切位点。并将上述序列委托大连宝生物通过基因合成的方式连入PMD-19T simple，命名为 CFP10cl-19T simple。1.碱小量法质粒提取
a.将含有CFP10cl-19T simple的大肠杆菌培养过夜后离心。向细菌沉淀中加入200μ L Solution I (GTE: 50 mmol/L 葡萄糖；25 mmol/L pH 8.0 Tris.HCl ; 10 mmol/LEDTA)，充分混匀，直至菌体完全重悬。b.再向离心管加入新配制的 200 μ LSolutionI 1(1% SDS ; 0.2 mo I/L NaOH)，立即轻缓倒置数次，直至混合均匀溶液澄清。c.加入 200 M-L SolutionIII ( 5mol/L 乙酸钾 60mL ;冰乙酸 11.5mL ;水28.5mL)，立即轻缓倒置数次，有大量白色沉淀出现，冰水浴中放置5 min。d.2，000 r/min离心5 min,取上清,加入等体积的氯仿/异戍醇充分混勻。e.12, 000 r/min离心10 min,取上清,加入2倍体积无水乙醇沉淀。f.12, 000 r/min离心10 min,弃上清,加入500 70%乙醇洗漆沉淀。g.12, 000 r/min离心5 min,弃上清,烘干后加入100 ρΗ8.0的TE缓冲液或无菌水，置于-20°C保存备用。2.酶切
用BamH I和Hind III 37°C过夜双酶切对CFP10cl_19T simple，获得带粘性末端的CFP10目的基因。酶切体系如下:
BamH I2ul
Hind III2ul
Buffer4ul
CFP10cl-19T simple20ul
水12ul
用Bgl II和HindIII 37°C过夜 双酶切CFP10cl_19T simple，获得带同样粘性末端的CFP10cl-19T’ simple片段。酶切体系如下:
Bgl II2ul
Hind III2ul
Buffer4ul
CFP10cl-19T simple20ul
水12ul
3.胶回收
a.对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外条件下切除含有目的带的胶块，称重后加入3倍的Binding Buffer, 55°C水浴使胶完全溶解。b.将DNA溶液转入DNA结合柱，套入到一个2 mL的收集管中室温10000 rpmin离心I min。c.弃废液,用Wash Buffer洗柱两边后烘干。d.将DNA结合住套入新的无菌离心管中，加入50 μ L无菌水，室温放置I min，大于13000 r/min离心I min。即得到目的基因的胶回收产物。4.连接
16°C条件下用T4连接酶，连接过夜。反应体系如下:
CFP10cl-19T’ simple1.5ul
CFPlO5.5ul
BufferIul
T4 LigaseIul
5.^.coli感受态细胞的制备
a.挑取平板上的大肠杆菌DH5 α单菌落接种于3 mL LB液体培养基中，37°C振荡(约150rpm)培养过夜。b.取该过夜菌体培养液以1:100的比例接种于100 mL新鲜LB培养液中，37°C剧烈振荡(约150 rpm)培养至OD6tltl = 0.4 - 0.6 (约2.5 h)，放置冰浴中停止培养。c.将b中新培养的菌液分装于已灭菌的离心管中，ImL/管，1，500 g，4°C离心5min,弃去上清(尽量除尽上清)。d.在每个离心管加入100 μ L冰中预冷的solution A，轻轻弹动离心管使沉淀
悬浮，禁止剧烈震荡。e.1, 500 g,4°C离心5 min,弃去上清(尽量除尽上清)。f.在每个离心管加入100 μ L冰中预冷的solution B，轻轻弹动离心管使沉淀悬浮。6.转化
b.于每管感受态细胞中加入5 μ L连接反应物(体积比2 - 5%)，轻轻转动混匀后冰浴中放置30 min。c.42°C热击60 sec后，迅速置冰上2 min。d.每个离心管中加入900 yL37 °C预温的LB培养基。e.37°C震荡(100 r/min)培养 I h。f.取400 μ L上述菌液,涂布于含氨节青霉素(Amp, 100 μ g/mL)的LB平板上，37 °C倒置培养过夜。7.重组质粒鉴定
将挑取转化后的平板单菌落过夜培养后，取Iml进行DNA测序，测序结果与所预期的结果一致，无突变，编码框正确无移码，命名为CFP10c2-19T simple。提取测序正确的重组质粒，用BamH I和Hind III双酶切，酶切后电泳检测为710bp左右，与CFP10c2大小一致。Bgl II和Hind III双酶切，以CFP10cl_19T为参照，电泳显示CFP10c2-19T用Bgl II和Hind III双酶切后片段大于CFP10cl_19T用Bgl II和Hind III双酶切后的片段，与预期结果一致。8.目的基因三次串联重组质粒的构建
回收CFP10c2-19T用BamH I和Hind III双酶切后产生的CFP10c2片段，与具有粘性末端的CFP10cl-19T相连，转化后同样进行酶切和测序鉴定，鉴定正确的即为CFP10c3-19T。9.目的基因四次串联重组质粒的构建
回收CFP10c3-19T用Bgl II和Hind III双酶切后产生的CFP10c3_19T片段，与CFPIOcI片段相连，转化后同样进行酶切和测序鉴定，鉴定正确的即为CFP10c4_19T。10.目的基因五次串联重组质粒的构建
回收CFP10c4-19T用Bgl II和Hind 111双酶切后产生的0 1(^4-191'片段，与经83111!1I和Hind III双酶切后产生的CFP10c4片段相连，转化后同样进行酶切和测序鉴定，鉴定正确的即为CFP10c5-19T。 11.目的基因六次串联重组质粒的构建
回收CFP10c5-19T用Bgl II和Hind III双酶切后产生的CFP10c5_19T片段，与经BamHI和Hind III双酶切后产生的CFP10c5片段相连，转化后同样进行酶切和测序鉴定，鉴定正确的即为CFP10c6-19T。12.重组表达质粒的构建
用 Nde I 及 Xho I 双酶切 CFP10cl_19T，CFP10c2_19T，CFP10c3_19T，CFP10c4_19T，CFP10c5-19T, CFP10c6-19T 和表达载体 pET16b。分别回收 CFPlOcl，CFP10c2, CFP10c3,CFP10c4, CFP10c5, CFP10c6目的片段和pET16b质粒片段。连接后转化大肠杆菌Rosetta-gami (DE3)菌株，37°C倒置过夜培养。挑取单菌落于氨苄和卡那双抗LB培养基中(氨苄终浓度100ug/ml，卡那终浓度50ug/ml)，37°C震荡培养过夜，提取重组表达质粒。13.重组表达质粒的鉴定
以所提取重组表达质粒为模板，用pET16b的测序引物做PCR鉴定；同时做Nde I和Xho I双酶切鉴定。将鉴定的阳性克隆分别命名为CFP10cl-pET16b，CFP10c2_pET16b,CFP10c3-pET16b, CFP10c4_pET16b，CFP10c5_pET16b 和 CFP10c6_pET16b。14.基因工程菌的诱导表达与鉴定
将含有 CFP10cl-pET16b， CFP10c2_pET16b， CFP10c3_pET16b， CFP10c4_pET16b，CFP10c5-pET16b 和 CFP10c6_pET16b 的 Rosetta-gami (DE3) 37°C震荡培养过夜，再按 1% 的接种量转接与氨苄和卡那双抗LB培养基中，待OD值为0.60.8时，加入IPTG诱导表达。取诱导表达后的菌体Iml,离心后按比例加入Loading buffer和PBS后，重悬菌体，至沸水中煮510min，12000rpm离心5min后取IOul进行SDS-PAGE电泳，同时以pET16b-Rosetta-gami (DE3)作为对照。12%分离胶，100V恒压，电泳2h,电泳结束后，脱色至条带清晰。根据电泳结果将有明显的表达带的菌株分别命名为CFP10cl-pET16b-ROSetta-gami (DE3)、CFP10c2-pET16b-Rosetta_gami(DE3)、CFP10c3-pET16b-Rosetta_gami(DE3)、CFP10c4-pET16b-Rosetta-gami(DE3)、CFP10c5-pET16b-Rosetta_gami(DE3)和 CFPlOc6-pET16b-Rosetta-gami(DE3)。15.基因工程菌诱导条件的优化
应用 0.2，0.4，0.6，0.6，0.8，1.0，1.2mM 浓度的 IPTG 进行诱导，并在 2h，4h，6h，8h，及过夜条件下分别取样进行SDS-PAGE电泳。同时将过夜诱导菌进行超声破碎，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳。从而确定IPTG浓度和诱导时间以及是上清表达或包涵体。16.重组蛋白的纯化
诱导菌收集后破碎，用0.22um滤膜过滤后，采用GE公司的AKTA plus蛋白纯化系统和HisTrap HP 预装柱亲和纯化 CFPlOcl，CFP10c2, CFP10c3, CFP10c4, CFP10c5 和 CFP10c6 重组蛋白。SDS-PAGE检测结果表明目的条带单一，无杂带。实施例2基于结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白的人结核杆菌检测试剂盒(化学发光法)
包装规格
9人份/盒(48T) 21人份/盒(96T)
预期用途
本试剂盒采用化学发光双抗体夹心法定量测定人血液样本中T淋巴细胞在结核杆菌特异抗原多肽刺激后分泌的人干扰素-Y (Interferon- y，IFN- Y )的含量。结核杆菌感染主要引起的是细胞介导的免疫应答。作为免疫应答的一部分，T淋巴细胞接受结核杆菌特异抗原多肽刺激成为活化的效应T淋巴细胞，分泌细胞因子IFN- Y。通过检测样本中IFN- Y的含量可以推测体内是否存在对结核杆菌反应的效应T淋巴细胞，从而对结核杆菌感染进行辅助诊断。检验原理
本试剂盒是利用结核杆菌感染者血液样本中存在结核杆菌特异的活化T淋巴细胞，这些T淋巴细胞在受到结核杆菌特异抗原多肽刺激后分泌IFN-Y设计而成的。将新鲜血液样本、结核杆菌特异抗原多肽A/结核杆菌特异抗原多肽B或阳性对照试剂一起加入细胞培养板进行培养。当血液样本中存在针对结核杆菌的效应T淋巴细胞时，培养液中加入的结核杆菌特异抗原多肽A和B将刺激这些效应T淋巴细胞分泌IFN-Y。将抗IFN-Y抗体包被微孔反应板，制成固相抗体，加入培养液上清，同时加入辣根过氧化物酶标记的抗IFN-Y抗体。如培养液上清中含有IFN-Y时，就与包被抗IFN-Y抗体、酶标记抗IFN-Y抗体结合形成复合物，加入底物液而发光，测定相对光信号(RLU)。通过数据处理分析，即可判定培养液上清中IFN-Y的含量，以此推测体内是否存在对结核杆菌反应的效应T淋巴细胞，从而对结核杆菌感染进行辅助诊断。主要组成成份
1.人干扰素-Y检测试剂盒(化学发光法)
__48人份_96人份_
标准品_人干扰素 _ Y 含量为 O (A)、50 (B)、125(C)、312.5 (P)、800 (E).2000 (F) pg/ml，6 瓶_ (0.5±0.l)ml/瓶(0.5±0.l)ml/瓶
包被孔包被有抗人干扰素-Y抗体的聚苯乙烯微孔—48孔96孔
30倍酶浓缩液I辣根过氧化物酶标记的抗人干扰素-Y抗体， I管|(100±15)μ1 |(200±15)μ1 _
权利要求
1.一种编码结核分枝杆菌CFPio的密码子优化基因序列，其特征在于:其单拷贝核昔酸序列CFPIOcI如SEQ ID N0.1所示，2次拷贝串联核苷酸序列CFP10c2如SEQ ID N0.2所示，3次拷贝串联核苷酸序列CFP10c3如SEQ ID N0.3所示，4次拷贝串联核苷酸序列CFP10c4如SEQ ID N0.4所示，5次拷贝串联核苷酸序列CFP10c5如SEQ ID N0.5所示，6次拷贝串联核苷酸序列CFP10c6如SEQ ID N0.6所示，CFPlO基因串联次数包括但不限于I 一6次。
2.结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白，其特征在于:它由权利要求1所述的密码子优化基因序列编码，其单拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，2次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示，3次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示，4次拷贝氨基酸序列如SEQID N0.10所示，5次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.11所示，6次拷贝氨基酸序列如SEQ IDN0.12所示，CFPlO蛋白串联次数包括但不限于I 一 6次。
3.结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白的表达载体，其特征在于:将权利要求1所述的密码子优化基因序列分别插入到质粒pET-16b上，得到重组质粒CFPIO c 1-pET 16b、CFP10c2-pET16b、CFP10c3-pET16b、CFP10c4-pET16b、CFP10c5-pET16b 或 CFP10c6_pET16b，载体包括但不限于pET16b。
4.一种表达结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白的工程菌株，其特征在于:它含有权利要求3所述的表达载体,其宿主菌为大肠杆菌{Escherichia coli)
5.一种基于权利要求2所述的结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白建立的体外检测结核杆菌感染的化学发光法试剂盒，其特征在于:利用权利要求2所述的结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白，刺激受检者的外周血释放Y-干扰素，并通过化学发光方法测定Y-干扰素的变化，诊断是否感染结核分枝杆菌。
6.一种基于权利要求2所 述的结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白建立的体外检测结核杆菌感染的TCELL-SPOT试剂盒，其特征在于:利用权利要求2所述的结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白，刺激受检者的外周血T淋巴细胞，并通过ELISPOT方法测定斑点形成的多少，诊断是否感染结核分枝杆菌。
7.权利要求2所述的结核分枝杆菌CFPlO串联重组融合蛋白在制备单抗、多抗、检测试剂盒及蛋白芯片中的应用。
全文摘要
本发明公布一种结核分枝杆菌CFP10串联重组融合蛋白及其应用。本发明提供了一种结核分枝杆菌CFP10密码子优化方法、串联重组融合方法及融合蛋白制备方法，还提供了该重组融合蛋白在全血IFN-γ结核诊断试剂盒及TCELL-SPOT结核感染诊断试剂盒的制作和应用方法，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了结核(TB)感染临床诊断的需要。
文档编号G01N33/68GK103146714SQ201310076460
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月11日 优先权日2012年7月20日
发明者杨艳坤, 林兴兵, 白仲虎, 刘晓磊, 李昕, 朱国珍, 曹成, 付建军 申请人:郑州博赛生物技术股份有限公司