一种四环素菌种选育方法
【专利摘要】本发明涉及一种四环素菌种选育方法，其特征在于其选育步骤为：生产菌种斜面培养，制备单孢子悬浮液，涂布分离培养出单菌落，挑取单菌落点种于点种培养基平板上，培养成熟后铲下、经HPLC法检测产素能力，同时挑取相应单菌落制备斜面，待斜面培养成熟后，经液体摇瓶培养并用HPLC法检测菌株生产性能，考察摇瓶初筛流程与琼脂块培养初筛流程的相关性。初筛高产的菌株保藏后经摇瓶HPLC法复筛，考察高产菌株的稳定性，最终留种。本发明可以有效缩短四环素的选育周期、提高筛选效率、节约筛选成本。与传统的四环素摇瓶初筛选育方法相比，本发明可以将筛选周期缩短近半个月，并且琼脂块培养初筛法得到的菌种性能与相应的增殖斜面得到的验证结果能有效对应。
【专利说明】一种四环素菌种选育方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物发酵医药【技术领域】，特别是涉及一种四环素菌种选育方法。
【背景技术】
[0002] 四环素具有抗菌谱宽、急性、毒性低、副作用小的优点，虽然在医药方面的直接用 量并不大，但它以其抑菌、促生长、饲料利用率高及其在肌体内残留量低等优点，在畜牧业 上大量用作饲料添加剂；此外通过化学改造可以制备或者发明具有高的临床价值且疗效更 为优越的半合成抗生素，近年来四环类抗生素在抗肿瘤、抑制骨吸收、促进骨形成等方面的 研究，拓宽了这类产品在医药方面的应用范围。目前，在我国四环素菌种选育中，其性能的 优劣由摇瓶培养发酵液生产抗生素效价的高低来判定。现有技术中四环素筛选自然选育流 程如下：选择出发株、制备分离平板培养基、制备单孢子悬浮液、涂布分离培养、挑单菌落接 斜面、摇瓶初筛(摇瓶培养、HPLC法检测)、初筛留种、接复筛斜面、摇瓶复筛(摇瓶培养、HPLC 法检测)、复筛留种、性状考察和高产菌种复筛留种。上述方法存在着流程繁琐、选育周期 长、工作量大、需要专用设备(恒温振荡器)、能耗大、成本高、筛选效率低等缺陷。因此，在实 际生产中，本着"初筛以量为主、复筛以质为主"的筛选原则，尽可能地放大初筛数量，使初 筛的手段尽可能地快速、简单；但现行工艺从单菌落培养到菌种性能的初筛检测还是需要 一定的周期，缓慢又繁琐；并且，在此期间菌种培养恒温室、摇瓶培养恒温振荡器均处于在 线使用状态，设备及功能间的利用率低、菌选耗时长，对于四环素菌种选育工作来说，筛选 工作依然处于低效率状态。因此，提供一种快速初筛方法对于四环素的生产来说具有非常 重要的意义。
[0003] 尽管抑菌圈测定抗生素效价方法是传统的快速初筛测定法。其原理是：待筛选的 菌株能分泌产生某些能抑制试验菌生长的物质，或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对 试验菌有毒的物质，从而在该菌落周围形成试验菌不能生长的抑菌圈。方法是：将待检测菌 种的单菌落琼脂块移至含有试验菌(多采用短小芽孢杆菌）的琼脂块培养基上，在适宜温湿 度下培养一段时间后取出，用游标卡尺来分别测定各抑菌圈的直径，直径大小反映了琼脂 块产抗生素能力的大小，以此判断、择优选取。虽然四环素有抑菌活性，其自身能分泌抑制 试验菌生长的物质或分泌某种对试验菌有利的物质，但四环素抑菌圈法检测效价时由于自 身基内菌丝分泌色素导致测量抑菌圈直径时抑菌圈的分界线不好划分，抑菌圈法检测的效 价与摇瓶效价比较误差较大。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于提供一种有效缩短四环素菌种选育周期，提高筛选效率，降低筛 选成本的菌种选育方法。
[0005] 本发明采用琼脂块培养初筛流程选育法，过程为：生产菌种斜面培养，制备单孢子 悬浮液，涂布分离培养出单菌落，挑取单菌落点种于固体培养基平板上，HPLC法检测产素能 力，挑取相应初筛高产菌株斜面摇瓶复筛，复筛摇瓶效价HPLC法检测，高产菌株复筛留种， _广菌株性能考察，最终留种。
[0006] 上述工艺具体来说为：挑选生产使用的四环素斜面一瓶，制备成单孢子悬浮液，梯 度稀释后按一定体积注入分离培养基中，按照菌种工艺培养至4?5天(菌落成型、表面有 孢子分泌)，用灭菌牙签选取各型单菌落(菌落形态要有记录）点种于点种优化培养基上，点 种培养平皿倒置于恒温培养室培养4?5天，培养温度33 ± 1°C;分离平皿倒置于恒温培养 室继续培养2天左右，认真观察菌落的生长变化。待分离培养基上单菌落生长成熟，挑取单 菌落制备斜面；待点种培养基上单菌落生长成熟，用接种铲铲下单菌落、用适宜溶剂提取后 经HPLC做初筛检测；待斜面生长成熟，铲下并用适宜溶剂提取后经HPLC做初筛检测。在试 验过程中认真观察各阶段菌株的生长情况、统计HPLC检测结果、分析各数据统计表之间的 相关性，得到以下发明效果：本发明可以有效缩短四环素的选育周期、提高筛选效率、节约 筛选成本；琼脂块培养初筛法得到的菌种性能与相应的增殖斜面得到的验证结果能有效对 应。本发明的效果：与传统的四环素摇瓶初筛选育方法相比，本发明可以将筛选周期缩短近 10天，并且琼脂块培养初筛法得到的菌种性能与相应的增殖斜面得到的验证结果能有效对 应。
【具体实施方式】
[0007] 1、仪器与材料： 1. 1仪器： 漩涡混合器、台式低速离心机、安捷伦高效液相色谱仪。
[0008] 1. 2 材料： 出发菌株(挑选生产使用菌株四环素菌)，分离(斜面）培养基、点种培养基、种子摇瓶培 养基、发酵摇瓶培养基；盐酸(分析纯)、甲醇(分析纯)、无水甲醇(色谱纯)，有机滤膜。
[0009] 1. 2. 1 培养基： 1. 2. 1. 1分离(斜面）培养基（g/L): 可溶性淀粉 10、（NH4)2S042. 5、NaCL0. 6、MgS04. 7H201. 2、K2HP04. 3H203. 0、CaC033. 0、琼脂 粉12 ; PH7. 2?7. 4,用蒸馏水配制，121°C灭菌30min。
[0010] 1. 2. 1. 2 点种培养基（g/L): 1#玉米淀粉 10、（NH4)2S042. 5、NafcO. 6、MgS04. 7H201. 2、 K2HP04. 3H203. 0、CaC033. 0、琼脂粉 12 ; PH7. 2?7. 4,用蒸馏水配制，121°C灭菌30min。
[0011] 2#---玉米淀粉70、黄豆饼粉5. 0、花生饼粉8、酵母粉3. 0、（NH4)2S042. 5、NaBrO. 6、 酵母膏 4. 0、MgS04. 7H201. 2、K2HP04. 3H203. 0、CaC033. 0、、淀粉酶 0? 0025、琼脂粉 12 ; PH7. 0?7. 2,用蒸馏水配制，121°C灭菌30min。
[0012] 3#玉米淀粉70、黄豆饼粉5. 0、花生饼粉5、酵母粉5. 0、酵母膏3. 0、 (NH4)2S042. 5、NaBrO. 6、玉米浆 2. 2、MgS04. 7H201. 2、K2HP04. 3H203. 0、CaC033. 0、淀粉酶 0.0025、琼脂粉 12 ; PH7. 0?7. 2,用蒸馏水配制，121°C灭菌30min。
[0013] 4#玉米淀粉25、黄豆饼粉4.0、花生饼粉5.0、酵母粉5.0、（NH4)2S042. 5、 NaBrO. 6、酵母膏 5. 0、玉米浆 4. 0、MgS04. 7H201. 2、K2HP04. 3H203. 0、CaC033. 0、、淀粉酶 0.0025、琼脂粉 12 ; PH7. 0?7. 2,用蒸馏水配制，121°C灭菌30min。
[0014] 分离优化配方后发现：1#配方菌落形态饱满、孢子分泌多且色素深、主型以馒头 型为主但直径略大于正常分离菌落，所以选择1#配方为点种培养基配方 1.2. 1.3摇瓶种子培养基（g/L): 玉米淀粉25、黄豆饼粉8. 0、花生饼粉3. 0、酵母粉5. 0、酵母膏5. 0、玉米浆4. 0、 (NH4)2S042. 5、NaBrO. 6MgS04. 7H201. 2、K2HP04. 3H203. 0、淀粉酶 0? 0025 ; PH7. 0?7. 2,用自来水配制，121°C灭菌30min。
[0015] 1.2. 1.4摇瓶发酵培养基（g/L): 玉米淀粉70、黄豆饼粉8. 0、花生饼粉2. 0、酵母粉5. 0、酵母膏3. 0、玉米浆2. 2、 (NH4)2S042. 5、NaBrO. 6MgS04. 7H201. 2、K2HP04. 3H203. 0、淀粉酶 0? 0025 ; PH7. 0?7. 2,用自来水配制，121°C灭菌30min。
[0016] 2、方法： 2. 1培养方法： 2. 1. 1分离平皿的制备： 挑选大生产使用的生长饱满的工作细胞库斜面，加入15ml无菌水，用接种环刮取孢 子，将其悬浮在无菌水中，制成混合均匀的孢子悬浮液。用灭菌的滤纸进行过滤，、收集过滤 孢子液，并进行KT1?1〇_6梯度稀释，取1〇_5、1〇_ 6稀释液〇. 1?〇. 15ml注入于分离培养基 平板上，用不锈钢三角耙耙匀，倒置于恒温培养室32±1°C培养4?5天。
[0017] 2. 1. 2点种平皿的制备： 取培养至第4?5天的上述分离平板，用肉眼筛选出饱满、均匀、分泌孢子量大、形态规 整或经验型产抗能力高的单菌落，在背面标记序号；并在点种培养基背面标记相应的序号 (1个分离单菌落对应3个点种菌落序号；分别用1-1、1-2、1-3标示)，用灭菌过的牙签轻轻 点种于相应序号位置标记处的点种培养基上，点种培养平皿倒置于恒温培养室32土 1°C培 养4?5天；分离平皿倒置于恒温培养室32± 1°C继续培养2天左右，认真观察菌落的生长 变化。
[0018] 2. 1.3斜面制备： 用点种肉眼筛选方法选取优质单菌落和点种后带序号的单菌落，用接种环挑取单菌落 接种于斜面培养基上，倒置于恒温培养室32± 1°C培养4?5天。
[0019] 2. 1.4种子摇瓶： 将培养好的斜面菌种用接种铲铲取1. 〇cm*l.Ocm接种于种子摇瓶培养基中，32±1°C、 220r/min振荡培养16?18hr，观察其菌丝生长情况。
[0020] 2. 1. 5发酵摇瓶： 将培养成熟的种子液按15%的接种量转接于发酵摇瓶中，32± 1°C、220r/min振荡培养 6天。
[0021] 2. 2 初筛： 2. 2. 1液体摇瓶复筛： 取2. 1. 5培养好的发酵液过滤，吸取滤液lml经适量稀释加入EDTA及盐酸提取，经 0. 45u有机滤膜过滤，准确吸取5.Oul样品滤液进样，利用自动高效液相色谱仪检测菌株的 生产能力。
[0022] 2. 2. 2琼脂块培养初筛： 分别将2块2. 1. 2培养好的、同序号点种单菌落铲下置于同一离心管中，加适量EDTA及盐酸，在漩润混合器上充分振荡3min提取，4000r/min离心lOmin、静置lOmin后，经 0. 45u有机滤膜过滤，准确吸取5.Oul样品滤液进样，利用自动高效液相色谱仪检测菌株的 生产能力。
[0023] 3、结果与分析： 3. 1结果： 3. 1. 1点种培养基优化试验结果：见表1 点种培养基设计见1. 2. 1. 2。点种菌落生长情况如下： 表1
【权利要求】
1. 一种四环素菌种选育方法，其特征在于采用琼脂块培养法替代传统的摇瓶培养法， 优化、改进了四环素选育的初筛流程。
2. 按照权利要求1所述的四环素菌种选育方法，其具体步骤为：生产菌种斜面培养，制 备单孢子悬浮液，涂布分离培养出单菌落，挑取单菌点种于固体培养基平板上，原始分离单 菌落培养成熟后挑取制备斜面，点种菌落培养成熟后，用HPLC法检测产素能力作为初筛效 价，挑取相应初筛高产菌株编号斜面摇瓶复筛，复筛摇瓶效价HPLC法检测，高产菌株复筛 留种，1?广菌株性能考察，最终留种。
3. 按照权利要求2所述的四环素菌种选育方法，其特征在于上述挑取单菌落点种于固 体培养基平板上时每个单菌落点种三块。
4. 按照权利要求2所述的四环素菌种选育方法，其特征在于上述分离单菌落在 32±1°C条件下培养4?5天。
5. 按照权利要求2所述的四环素菌种选育方法，其特征在于上述点种单菌落、挑单菌 落制备的斜面均在32± 1°C条件下培养4?5天。
6. 按照权利要求2所述的四环素菌种选育方法，其特征在于上述HPLC法检测产素能力 是指点种固体培养基平板培养结束后，将源于同一单菌落的三块琼脂块取下置于不同离心 管中，加适量EDTA，充分震荡混合，转速4000rpm离心lOmin、静置后，经0. 45um有机滤膜过 滤，收集过滤液，用HPLC法测定单菌落的产素能力。
7. 按照权利要求1、2、3、4、5所述的四环素菌种选育方法，其特征在于上述初筛培养基 为琼脂块固体培养基。
【文档编号】G01N30/02GK104342481SQ201310312193
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月24日 优先权日:2013年7月24日
【发明者】张燕玉, 孙瑞君, 陈卓, 王惠 申请人:宁夏启元药业有限公司