两种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公布了两种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用。发明提供了两种单链抗体（即scFv抗体），scFv抗体具有与IBDV结构蛋白2（VP2）蛋白及多种IBDV毒株特异性结合的能力，可阻断IBDV对鸡胚成纤维细胞产生细胞病变（CPE），可保护IBDV感染的青年鸡。免疫血清和卵黄抗体在使用过程中存在制备繁琐、生产成本高、效果不稳定以，工业化生产质量难以控制及引发水平传播疾病等弊端。本发明提供的scFv抗体可以克服上述弊端，具有特异性强、治疗效果好，工业化生产质量可控，避免了卵黄抗体引起的水平传播疾病等优点，将在IBDV的防制史上，乃至整个动物病毒病的防治史上开辟了一个新的局面。
【专利说明】两种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及两种SCFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用。
【背景技术】
[0002]鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一种急性、高度接触性鸡传染病,具有传播速度快、传染性强、感染率及死亡率均高的特点。该病给养禽业造成重大经济损失。
[0003]IBDV可在雏鸡法氏囊中的淋巴细胞，尤其是B淋巴细胞中迅速繁殖，促使B淋巴细胞凋亡，法氏囊极度萎缩，最终导致免疫缺陷和免疫抑制。因此极易造成细菌(大肠杆菌和沙门氏菌）的继发感染，同时可还造成其他疫苗的免疫失败。多克隆抗体(高免血清和卵黄抗体）是目前有效的治疗手段，在发病早期治疗效果良好，但是由于工业化生产可控性差和存在水平传播疾病(鸡白痢、霉形体、减蛋综合症和禽白血病）以及由一些非特异性抗体引起的过敏性反应等原因而受到限制。
[0004]基因工程抗体即将抗体的基因按不同需要进行加工、改造和重新装配，然后导入适当的受体细胞中进行表达的抗体分子。在原核细胞中表达基因工程抗体目前技术已经相对成熟，可实现工业化的生产，产品质量可控均一。同时原核表达系统不存在水平传播传染性疾病的危险。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供两种单链抗体（scFv抗体)、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用。
[0006]本发明提供了两种单链抗体，命名为IBDV-VP2 scFv29抗体和IBDV-VP2 scFv30抗体，包括由重链可变区、轻链可变区以及它们之间的连接区组成；
所述IBDV-VP2 scFv29抗体的重链可变区为如下（a)或（b): (a)由序列表中序列I自N末端第1-129位氨基酸残基组成的蛋白质；（b)将（a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；
所述IBDV-VP2 scFv29抗体轻链可变区为如下（c)或（d) :(c)由序列表中序列I自N末端第145-250位氨基酸残基组成的蛋白质；（d)将（c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
[0007]所述单链抗体IBDV-VP2 scFv29具体可为如下（e)或（f) : (e)由序列表中序列I所示的蛋白质；（f)将（e)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
[0008]编码所述单链抗体IBDV-VP2 scFv29的基因也属于本发明的保护范围。
[0009]所述单链抗体IBDV-VP2 scFv29基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下(I)或（2)或（3) :(1)序列表的序列2自5’末端第1-387位核苷酸所示的DNA分子；（2)在严格条件下与（I)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（3)与(O限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0010]所述单链抗体IBDV-VP2 scFv29基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下
(4)或（5)或（6): (4)序列表的序列2自5’末端第433-753位核苷酸所示的DNA分子；（5)在严格条件下与（4)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6)与
(4)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0011]所述单链抗体IBDV-VP2 scFv29基因具体可为如下（7)或（8)或（9)或（10): (7)序列表的序列2自5’末端第1-753位核苷酸所示的DNA分子；（8)序列表的序列2所示的DNA分子；（9)在严格条件下与（7)或（8)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10)与（7)或（8)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0012]所述IBDV-VP2 scFv30抗体的重链可变区为如下（a’）或（b’）：（a’）由序列表中序列3自N末端第1-135位氨基酸残基组成的蛋白质；（b’）将（a’）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；
所述IBDV-VP2 scFv30抗体轻链可变区为如下（c’）或（d’）：（c’）由序列表中序列3自N末端第151-255位氨基酸残基组成的蛋白质；（d’）将（c’）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
[0013]所述单链抗体IBDV-VP2 scFv30具体可为如下（e’）或（f ’）：（e’）由序列表中序列3所示的蛋白质；（f ’）将（e’）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
[0014]编码所述单链抗体IBDV-VP2 scFv30的基因也属于本发明的保护范围。
[0015]所述单链抗体IBDV-VP2 scFv30基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下(I’）或（2’）或（3’）：（ I’）序列表的序列4自5’末端第1-405位核苷酸所示的DNA分子；(2’）在严格条件下与（1' )限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(3’）与（1')限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0016]所述单链抗体IBDV-VP2 scFv30基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下(4’ )或（5’ )或（6’ ) ： (4’ )序列表的序列4自5’末端第451-768位核苷酸所不的DNA分子；（5’）在严格条件下与（4’ )限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6’）与（4’）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0017]所述单链抗体IBDV-VP2 scFv30基因具体可为如下（7，）或（8，）或（9，）或（10’）：(7’）序列表的序列4自5’末端第1-768位核苷酸所示的DNA分子；（8’）序列表的序列2所示的DNA分子；（9’）在严格条件下与（7’）或（8’）限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10’）与（7’）或（8’）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0018]上述严格条件可为在6 X SSC，O. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2 X SSC、
O.1% SDS 和 I X SSC,O. 1% SDS 各洗膜一次。[0019]含有以上任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
[0020]基于所述两种单链抗体的其它形式的抗体也属于本发明的保护范围。所述其它形式的抗体可为Fab形式的抗体、IgG形式的抗体等。
[0021]本发明还保护所述单链抗体或所述其它形式的抗体在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下（I )、（II)或(III)或(IV) :( I )检测鸡传染性法氏囊病病毒；（II)辅助鉴定鸡传染性法氏囊病病毒；（III)预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病；（IV)预防和/或治疗由鸡传染性法氏囊病病毒诱发的其它疾病。
[0022]含有所述单链抗体或所述其它形式的抗体的产品也属于本发明的保护范围；所述产品的功能为如下（I )、（II)或(III)或(IV) :( I )检测传染性法氏囊病病毒；（II)辅助鉴定传染性法氏囊病病毒；（III)预防和/或治疗传染性法氏囊病病毒引起的疾病；（IV)预防和/或治疗传染性法氏囊病。
[0023]本发明还保护所述单链抗体或所述其它形式的抗体在辅助鉴定传染性法氏囊病病毒中的应用。所述应用为非疾病诊断方法。
[0024]本发明提供了两种单链抗体（即scFv抗体)，scFv抗体具有与IBDV结构蛋白2(VP2)蛋白及多种IBDV毒株特异性结合的能力，可阻断IBDV对鸡胚成纤维细胞产生细胞病变（CPE)，可保护IBDV感染的青年鸡。免疫血清和卵黄抗体在使用过程中存在制备繁琐、生产成本高、效果不稳定以，工业化生产质量难以控制及引发水平传播疾病等弊端。本发明提供的scFv抗体可以克服上述弊端，具有特异性强、治疗效果好，工业化生产质量可控，避免了卵黄抗体引起的水平传播疾病等优点，将在IBDV的防制史上，乃至整个动物病毒病的防治史上开辟了一个新的局面。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图I 为 IBDV-VP2 scFv29 和 IBDV-VP2 scFv30 抗体溶液的 SDS-PAGE 图谱。
[0026]图2为两种scFv抗体溶液的SEC-HPLC图谱。
[0027]图3为ELISA检测两种scFv抗体对VP2蛋白的特异性和亲和力的结果。
[0028]图4为ELISA检测两种scFv抗体对不同IBDV病毒的特异性和亲和力结果。
【具体实施方式】
[0029]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0030]pET_27b (+)载体：购自 Novagen 公司，Cat. No. 69337-3。大肠杆菌 Rosetta :购自Novagen公司，Cat. No. 71403-4。DFl细胞(鸡成纤维细胞）：购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，Cat. No. 3131C0001000400030。SPF雏鸡：购自哈尔滨兽医研究所。鸡新城疫灭活疫苗（La Sota株)，购买自哈兽研维科生物公司，编号080012008。
[0031]鸡传染性法氏囊病活疫苗（Gt株):哈兽研维科生物公司，编号080012122。鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗（NF8株）：扬州威克生物工程有限公司，编号101042056。鸡传染性法氏囊病活疫苗（1-65株):Shafit InterGumboro，编号S20651010A。鸡传染性法氏囊病活疫苗（BJ836株）：上海海利生物药品有限公司，编号090202026。鸡传染性法氏囊病活疫苗（MB株）：ABIC，编号20621150B。鸡传染性法氏囊病活疫苗（B87株）：湖南省中岸生物药业有限公司，编号180022026。
[0032]质粒pHisSUMO:参考文献：姜媛媛，尹成凯，李晋南，任桂萍，张薇，李德山.利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究.东北农业大学学报，2008，39(10) : 57-62;李璐，尹成凯，李德山.高效表达可溶性重组蛋白表达载体——pHisSUMO.生物技术，2009，19(3) : 11-14·。
[0033]包被液（pH9.6) -M Na2CO3 O. 15g、NaHCO3 O. 293g，溶于水并用水定容至 100mL。
[0034]PBS 缓冲液：取 NaCl 8g、KCl 0. 2g、Na2HPO4. 12H20 3. 58g、KH2PO4 0. 24g，溶于 IL水。
[0035]实施例I :SCFv抗体(单链抗体）及其编码基因的发现
1、抗体库的构建
取IBDV免疫后的鸡脾脏，提取RNA后反转录成cDNA。根据GenBank上的抗体序列，设计出克隆抗体可变区的基因引物，以cDNA为模板，使用PCR的方法克隆抗体可变区。将VH与VL片段分别插入到pTlinker载体的Linker的上游和下游,构建出scFv抗体库。将scFv抗体库进行酶切并与细菌展示载体PBSD进行连接，构建抗IBDV抗体的细菌表面展示文库。VH 约 380bp、VL 约 320bp, VH-Tlinker-VL 约 740bp ；
2、抗体库的筛选
收集转化后全部克隆，经IPTG (0. 25mmol/ml)诱导4h，经EDTA-MgCl2处理，与FITC标记的VP2蛋白孵育lh，PBS洗涤后利用流式细胞仪对其进行筛选；
经三轮筛选后，得到两个与FITC标记的VP2蛋白具有结合能力的单链抗体，将其命名为 IBDV-VP2 scFv29 抗体和 IBDV-VP2 scFv30 抗体；
IBDV-VP2 scFv29抗体（为单链抗体，又称scFv蛋白）如序列表的序列I所示，其编码基因如序列表的序列2所不；
IBDV-VP2 scFv30抗体(为单链抗体，又称scFv蛋白）如序列表的序列3所示，其编码基因如序列表的序列4所不。
[0036]实施例2、scFv抗体的制备
1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子；
2、以步骤I合成的双链DNA分子为模板，用Fl和Rl组成的引物以流式筛选阳性菌所提取质粒为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
Fl :5’ - CATGCCATGGGCCGTGACGTTGGACGAG-3’ ；
Rl : 5，- CCCAAGCTTTTAACCTAGGACGGTCAGGG-3 ；
3、用限制性内切酶AfcoI和Λ?/^ΙΙΙ双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物；
4、用限制性内切酶AfcoI和历/^111双酶切pET-27b(+)载体，回收约5367bp的载体骨
架；
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：在pET-27b(+)载体的AfcoI和Λ?/^ΙΙΙ酶切位点之间插入了序列表的序列2所不的双链DNA分子；6、将步骤5得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta，得到重组菌；
7、将步骤6得到的重组菌接种至含50μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基，37°C、IOOr/min振荡培养至OD6tltlnm=O. 35 ;加入IPTG并使其浓度为O. 25mmol/L, 37°C U00r/min振荡培养4h ；
8、取25L完成步骤7的培养体系，4°C、4000r/min离心30min并收集菌体沉淀；
9、取步骤8得到的菌体沉淀，用PBS缓冲液重悬，加入溶菌酶溶液(购自Amresco)并使溶菌酶的浓度为lmg/ml，4°C放置lh，然后进行超声破碎（25瓦的功率，3min)，4°C、1000Og离心30min,收集沉淀；
10、使用AKTAPurifier 100蛋白层析系统（购自GE公司）纯化目的蛋白
取步骤9得到的沉淀，用100毫升溶解缓冲液（8mol/L尿素水溶液，pH8. O)充分溶解，然后上样于HiLoad 16/60 Superdex75 pg柱子（购自GE公司），然后用500毫升复性缓冲液（2mol/L尿素水溶液，pH8. O)洗脱并收集过柱后的洗脱液，然后在PBS缓冲液中透析过夜，得到溶液即为scFv抗体溶液。所有步骤均在4°C环境下。scFv抗体溶液的SDS-PAGE图谱见图1，显示约为28KD的条带，与预期相符；
11、取步骤10得到的scFv抗体溶液，进行SEC-HPLC分析
硅胶填充物，型号为G-3000sWXl ;将scFv抗体溶液上样后，用流速为O. 5ml/min的洗脱液（PH8. 0，溶剂为水，含50mM Na3POjP 150mM NaCl)进行洗脱。SEC-HPLC图谱见图2，目的蛋白的纯度可达90%。
[0037]实施例3、VP2蛋白的制备 一、重组质粒的构建`
1、合成序列表的序列6所示的IBDVvp2双链DNA分子；
2、以步骤合成的双链DNA分子为模板，用F2和R2组成的引物对vp2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
F2 :5， -GAAGACTTAGGT ACAAACCTGCAAGATCAA-3，；
R2 :5’ -GGATCCTTATGCTCCTGCAATCTTCAG-3，；
3、用限制性内切酶助I取BamHl双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物；
4、用限制性内切酶助SI取BamHl双酶切质粒pHisSUMO，回收约5700bp的载体骨架；
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。重组质粒中，VP2蛋白的编码基因和载体骨架上的分子伴侣SUMO的编码序列、以及载体骨架上的His标签的编码序列(位于SUMO的编码序列的上游，由6个组氨酸残基组成)融合，形成融合基因，表达融合蛋白（融合蛋白自N端至C端依次为His标签、分子伴侣SUMO和VP2蛋白）。
[0038]二、VP2蛋白的制备和纯化
1、将步骤一得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta，得到重组菌；
2、将步骤I得到的重组菌接种至含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C、100r/min 振荡培养至 OD6citlnm=O. 35 ;加入 IPTG 并使其浓度为 0. 4mmol/L, 25°C、65r/min 振荡培养IOh ；
3、取完成步骤2的培养体系，4°C、4000r/min离心30min，并收集菌体沉淀；
4、取步骤3得到的菌体沉淀,用Bindingbuffer重悬,加入溶菌酶溶液(购自Amresco)并使溶菌酶的浓度为lmg/ml，4°C放置lh，然后进行超声破碎（25瓦的功率，3min)，4°C、1000Og离心30min,收集上清液；
5、取步骤4得到的上清液,进行HisTrapTMFF crude colum亲和层析；
柱子型号为：柱长O. 7cm,柱高2. 5cm ；
上样量为IOml ；
洗脱过程：先用5倍柱体积的杂蛋白洗脱液(溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质：40mmol/L 咪唑、500mmol/L NaCl 和 SOmmoI/T, Na3PO4 ；pH7. 4)洗脱以去除杂蛋白，流速为lml/min ;然后用3倍柱体积的目的蛋白洗脱液(溶剂为水,含有如下浓度的各个溶质：500mmol/L 咪唑、500mmol/L NaCl 和 SOmmoI /T, Na3PO4 ；pH7. 4)洗脱,流速为 lml/min, 280nm波长监测，收集目标峰(即峰值高于SOmAU的峰)，即为融合蛋白溶液；
6、采用HiPr印TM26/10 Desalting将步骤5得到的融合蛋白溶液进行脱盐；
7、取步骤6得到的溶液，用SUMO蛋白酶I(SUMO蛋白酶I与融合蛋白的摩尔比为1:50 )和终浓度为2mmol/L的DTT 4°C切割过夜；
8、取步骤7得到的溶液,进行HisTrapTMFF crude colum亲和层析。
[0039]柱子型号为：柱长O. 7cm,柱高2. 5cm ；
上样量为15ml，280nm波长监测，收集目标峰（即峰值高于30mAU的峰)，即为VP2蛋白溶液。将VP2蛋白溶液进行聚丙烯凝胶电泳，显示分子量约为42KDa的单一蛋白条带，回收蛋白条带并测序，N端前15个氨基酸残基如序列表的序列5自N末端第I至15位氨基酸残基所示。
[0040]实施例4、ELISA检测scFv抗体的亲和力和特异性
一、ELISA检测IBDV-VP2 scFv29和IBDV-VP2 scFv30抗体对VP2蛋白的特异性和亲和力；
1、分别用蛋白浓度为300μg/ml>60 μ g/ml>12 μ g/ml、2. 4 μ g/ml的scFv抗体溶液(即实施例2制备的scFv抗体溶液，用包被液调整蛋白浓度)包被酶标板，4°C过夜，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min ；
2、每孔加入100μ I蛋白浓度为40 μ g/ml的VP2蛋白溶液（即实施例3制备的VP2蛋白溶液，用PBS缓冲液调整蛋白浓度)，37°C孵育lh，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min ；
3、加入卵黄抗体（B87株免疫蛋鸡得到的，工作浓度为1:200倍稀释)，371：孵育lh，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min ；
4、加入HRP标记的兔抗鸡抗体（Cat.No. 11-7018购自eBioscience公司，工作浓度为1:7500倍稀释)，37°C孵育lh，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min ；
5、加入TMB底物显色液，37°C避光显色5min；
6、每孔加入50μ 12mol/L的H2SO4水溶液，用酶标仪于波长450nm下检测OD值；
设置用等体积的PBS缓冲液代替步骤I中的scFv抗体溶液、步骤2中的VP2蛋白溶液和步骤3中的卵黄抗体的PBS组。步骤I中用蛋白浓度为300 μ g/ml的scFv抗体溶液包被酶标板时：设置步骤2中不加入VP2蛋白溶液的对照组1，步骤3中不加入卵黄抗体的对照组2，步骤2中不加入VP2蛋白溶液且步骤3中不加入卵黄抗体的对照组3，用等体积且等蛋白浓度的BSA溶液代替VP2蛋白溶液的对照组4 ；
每个处理设置3个复孔；
结果见图3。ELISA结果表明，IBDV-VP2 scFv29和IBDV-VP2 scFv30抗体可以与VP2蛋白特异性结合。
[0041]二、ELISA 检测 sIBDV-VP2 scFv29 和 IBDV-VP2 scFv30 抗体对不同 IBDV 病毒的特异性和亲和力
，1、用蛋白浓度为300μ g/ml的scFv抗体溶液(即实施例2制备的scFv抗体溶液，用包被液调整蛋白浓度）包被酶标板，4°C过夜，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min ；
，2、每孔加入100 μ I IBDV 病毒液(病毒滴度为 IOOTCId50, TCID50=IO^ 8/0. lml)，37。。孵育lh，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min ；
，3、加入卵黄抗体（B87株免疫蛋鸡得到的，工作浓度为1:200倍稀释)，371：孵育lh，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min ；
4、加入HRP标记的兔抗鸡抗体（Cat.No. 11-7018购自eBioscience公司，工作浓度为1:7500倍稀释)，37°C孵育lh，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min ；
5、加入TMB底物显色液，37°C避光显色5min；
6、每孔加入50μ I 2mol/L的H2SO4水溶液，用酶标仪于波长450nm下检测OD值； 分别采用如下IBDV的毒株进行上述实验：Gt株、NF8株、1_65株、BJ836株、MB株、B87
株;
设置用等体积的PBS缓冲液代替步骤I中的scFv抗体溶液、步骤2中的IBDV病毒液和步骤3中的卵黄抗体的PBS组。设置步骤2中不加入IBDV病毒液的对照组1，步骤3中不加入卵黄抗体的对照组2，步骤2中 不加入IBDV病毒液且步骤3中不加入卵黄抗体的对照组3，用等体积等滴度的新城疫病毒液代替IBDV病毒液的对照组4 ;
每个处理设置3个复孔；
结果见图4。ELISA结果表明，IBDV-VP2 scFv29和IBDV-VP2 scFv30抗体可以与不同IBDV毒株特异性结合，对不同的IBDV毒株具有不同的亲和力。
[0042]实施例5、IBDV-VP2 scFv29 和 IBDV-VP2 scFv30 抗体的中和活性 一、IBDV滴度的测定
将处于对数生长期的DFl细胞接种于96孔细胞培养板，将用DMEM培养基IO1至IO11梯度稀释的IBDV病毒液（B87株）接种到单层细胞中（每孔100 μ I)，每一稀释度接种8个细胞孔；设置不加入IBDV病毒液的对照组。将细胞培养板放到细胞培养箱中，37°C、5% CO2培养，连续观察7天，每天记录细胞生长状态。计算病毒滴度，第7天结果见表1。
[0043]表1 IBDV滴度的测定的结果
【权利要求】
1.两种单链抗体，包括由重链可变区、轻链可变区以及它们之间的连接区组成； 所述IBDV-VP2 scFv29抗体重链可变区为如下（a)或（b) ： Ca)由序列表中序列I自N末端第1-129位氨基酸残基组成的蛋白质；（b)将（a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质； 所述IBDV-VP2 scFv29抗体轻链可变区为如下（c)或（d) :(c)由序列表中序列I自N末端第145-250位氨基酸残基组成的蛋白质；（d)将（c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质； 所述IBDV-VP2 scFv30抗体重链可变区为如下（a’）或（b’）：（a’）由序列表中序列I自N末端第1-135位氨基酸残基组成的蛋白质；（b’）将（a’）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质； 所述IBDV-VP2 scFv30抗体轻链可变区为如下（c’）或（d’）：（c’）由序列表中序列I自N末端第151-255位氨基酸残基组成的蛋白质；（d’）将（c’）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的两种单链抗体，其特征在于： 所述IBDV-VP2 scFv29单链抗体为如下（e)或（f ): (e)由序列表中序列I所示的蛋白质；（f)将（e)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质； 所述IBDV-VP2 scFv30单链抗体为如下（e’）或（f’）：（e’ )由序列表中序列3所示的蛋白质；（f ’）将（e’）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
3.编码权利要求1或2所述单链抗体的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于： 所述IBDV-VP2 scFv29单链抗体基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下（I)或(2)或（3) : (I)序列表的序列2自5’末端第1-387位核苷酸所示的DNA分子；（2)在严格条件下与（I)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（3)与（I)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子； 所述IBDV-VP2 scFv29单链抗体基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下（4)或（5)或（6): (4)序列表的序列2自5’末端第433-753位核苷酸所示的DNA分子；（5)在严格条件下与（4)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6)与（4)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子； 所述IBDV-VP2 scFv30单链抗体基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下（I’）或（2’）或（3’）：（ I’）序列表的序列4自5’末端第1-405位核苷酸所示的DNA分子；（2’）在严格条件下与（I’）限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（3’）与0-)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；所述IBDV-VP2 scFv30单链抗体基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下（4)或（5)或（6): (4)序列表的序列2自5’末端第451-768位核苷酸所不的DNA分子；（5)在严格条件下与（4)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6)与（4)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于：所述IBDV-VP2 scFv29单链抗体基因为如下（7)或（8)或（9)或（10): (7)序列表的序列2自5’末端第1-753位核苷酸所示的DNA分子；（8)序列表的序列2所示的DNA分子；(9)在严格条件下与（7)或（8)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10)与（7)或（8)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子； 所述IBDV-VP2 scFv30单链抗体基因为如下（7’）或（8’）或（9’）或（10’）：（7’）序列表的序列4自5’末端第1-768位核苷酸所不的DNA分子；（8’）序列表的序列2所不的DNA分子；（9’）在严格条件下与（7’）或（8’）限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10’）与（7)或（8’）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
6.含有权利要求3至5中任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
7.基于权利要求1或2所述单链抗体的其它形式的抗体。
8.权利要求1所述单链抗体、权利要求2所述单链抗体或权利要求7所述抗体在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下（I )、（11)或(ΠΙ)或(IV):( I )检测传染性法氏囊病病毒；（II)辅助鉴定传染性法氏囊病病毒；（III)预防和/或治疗传染性法氏囊病病毒引起的疾病；（IV)预防和/或治疗传染性法氏囊病。
9.含有权利要求1所述单链抗体、权利要求2所述单链抗体或权利要求7所述抗体的产品；所述产品的功能为如下（I )、（II)或(III)或(IV) : (I )检测传染性法氏囊病病毒；(II)辅助鉴定传染性法氏囊病病毒；(III)预防和/或治疗传染性法氏囊病病毒引起的疾病；(IV)预防和/或治疗传染性法氏 囊病。
10.权利要求1所述单链抗体、权利要求2所述单链抗体或权利要求7所述抗体在辅助鉴定传染性法氏囊病病毒中的应用。
【文档编号】G01N33/569GK103483449SQ201310362878
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年8月20日 优先权日:2013年8月20日
【发明者】尹杰超, 周兵, 李天鹤, 李德山, 张瑛杰, 张立夏 申请人:东北农业大学