专利名称：一种快速检测大肠杆菌的一体化薄膜生物传感器的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种微生物检测技术领域，具体的说是一种快速检测大肠杆菌的一体化薄膜生物传感器。
背景技术：
生物传感器是一种将生物信号转变成电信号的仪器，通常由生物识别体系和信号传送体系构成。Clark教授于1956年发表了一篇关于氧电极的文章，为生物传感器的发展奠定了重要的基础。生物传感器具有特异性生物分子识别能力，与一种敏感转换器结合，以高的选择性和灵敏度检测被分析物，成为快速、灵敏检测水体、大气等环境中物质的重要方法。根据生物传感器中所用分子识别元件上的敏感物质不同，可以将生物传感器分为酶传感器、微生物传感器、组织传感器、细胞器传感器、免疫传感器和DNA生物传感器等。细菌的有氧呼吸过程和发酵过程与环境中氧气含量息息相关，可以通过监测细菌的生长繁殖进而进行生物体系氧化还原监测，环境污染监测。而众所周知微生物与人类的生活密切相关，因此它们对于人类的生活有着十分重要的影响。例如，许多细菌能够释放出毒素使人畜致病，但是同时也有许多细菌能够被我们人类所以利用，这通常称为益生菌。目前，一般检测细菌的方法通常是通过测定细菌的生理、形态特征或通过测定细菌的基因组成来鉴定细菌。这些方法操作起来复杂看，且需要花费很长的时间，它们已经远远不能满足当前对微生物检测的要求。在这种情况下，许多研究人员努力地探索新的方法，以便对细菌进行快速地检测。1993年Charach等人在科学上首次报导了利用带有细胞表面受休的聚双炔薄膜在与对应的配体分子结合时，薄膜的颜色可以由蓝变红这种现象对流感病毒进行了直接的比色检测。这种亲合变色现象引起了人们的广泛兴趣。国内有不少单位对此进行了研究，但是这些研究都集中于利用聚双炔的光学性质对细菌进行检测，而利用电化学的方法检测细菌的报道还很少。大肠杆菌是人和 动物肠道中最著名的一种细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%。是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。大肠杆菌能合成维生素B和K，正常栖居条件下不致病；若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在水和食品中检出，可认为是被粪便污染的指标。大肠菌群数常作为饮水、食物或药物的卫生学标准。本实用新型针对大肠杆菌采用电化学检测方法出发，开发了一种具有检测设备简单、体积小、反应灵敏、检测速度快的生物传感器。
发明内容本实用新型的目的是提供一种快速检测大肠杆菌的一体化薄膜生物传感器，从而填补目前市场中对于电化学检测菌类仪器设备的空白。本实用新型解决其上述的技术问题所采用以下的技术方案:一种快速检测大肠杆菌的一体化薄膜生物传感器，其主要构造有:树脂片、合金膜、支撑结构检测层、培养基层、碳糊、注浆孔、铜探针、连接导线、智能循环伏安扫描一体机、玻璃试管，所述的树脂片镀制有一层合金膜，支撑结构检测层上沉积有一层培养基层，玻璃试管内可灌入碳糊，其玻璃试管一口处开有注浆孔，玻璃试管两端口各设有铜探针，铜探针通过连接导线与智能循环伏安扫描一体机相连通，智能循环伏安扫描一体机输入端口还与合金膜相连通。上述的合金膜其厚度在2 4mm。上述的培养基层其厚度在8 15mm。上述的玻璃试管与培养基层接触面处开有毛细孔。本实用新型微生物传感器与普通利用聚双炔的光学性质对细菌进行检测方法相比具有以下优点:解决了对细菌检测操作复杂，且需要花费时间长的问题，提供了一种容易制备且测试操作简单方便、灵敏度高、特异性强、响应时间短、可定量检测细菌浓度的生物传感器，实现了对细菌的直接检测。本实用新型可快速地对细菌进行检测，在医疗诊断、食品工业和环境保护领域均具有十分重要的意义。
图1为本实用新型一种快速检测大肠杆菌的一体化薄膜生物传感器整体结构示意图。图中1-树脂片，2-合金膜，3-支撑结构检测层，4-培养基层，5-碳糊，6_注浆孔，7-铜探针，8-连接导线，9-智能循环伏安扫描一体机，10-玻璃试管。
具体实施方式
以下结合附图1对本实用新型的具体实施方式
做一个详细的说明。实施例:一种快速检测大肠杆菌的一体化薄膜生物传感器，其主要构造有:树脂片1、合金膜2、支撑结构检测层3、培养基层4、碳糊5、注浆孔6、铜探针7、连接导线8、智能循环伏安扫描一体机9、玻璃试管10,所述的树脂片I镀制有一层合金膜2,支撑结构检测层3上沉积有一层培养基层4,玻璃试管10内可灌入碳糊5,其玻璃试管10 —口处开有注浆孔6，玻璃试管10两端口各设有铜探针7，铜探针7通过连接导线8与智能循环伏安扫描一体机9相连通,智能循环伏安扫描一体机9输入端口还与合金膜2相连通。所述的合金膜2其厚度在2 4mm。其合金膜2采用35%的钼金和65%的白银所组成。所述的培养基层4其厚度在8 15mm。其培养基层4是甘露糖或唾液酸。所述的玻璃试管10与培养基层4接触面处开有毛细孔。下面针对整个大肠杆菌试验培养、检测过程作一个实例的讲解:[0020]一、大肠杆菌的培养:将牛肉膏蛋白胨培养基、伊红、美兰及配置培养基所用的水在121°C的条件下灭菌约5小时之后，依次取出冷却至室温，然后将大肠杆菌(E.coli)接种到盛有牛肉蛋白胨培养基的试管内。将接种后的试管放置于摇床内，并调节培养箱温度至37.5°C ,培养24h。取出灭菌后的蛋白胨、水、伊红、美蓝、培养基冷却至室温，在无菌操作平台上将它们分别装入平板中，最后将装好的平板放在避光的地方以待用。二、将培养好的大肠杆菌稀释后混入碳糊中:把大肠杆菌原溶液稀释到10— 5、10— 6、10— 7，截留液稀释到10— 5、10— 6、10— 7、10— 8，然后把上面稀释的溶液以及留出液保存好待用。不同浓度下的稀释后的溶液和截留液各取
0.lmL，分别放入已培养好的不同培养基上摊平。需要注意的是在整个实验过程中，所有操作都需要在无菌室和酒精灯火焰旁边操作。把已经涂好的培养基一同放在培养箱中，调整培养箱的温度对其进行培养。培养时间达到24h后，可以对培养基上的菌落数进行计数。将石墨粉与环氧树脂按比例混合后通过注浆孔6注入一些于玻璃试管10内，将培养好的大肠杆菌与少量培养基、碳粉和甲基硅油混合成碳糊5，将获得的碳糊5填充满玻璃试管10的小腔中，制成大肠杆菌修饰的碳糊工作电极。三、设备实验开始及其数据结论:大肠杆菌属于兼性厌氧型细菌，在适当磷酸盐缓冲溶液中(PBS，pH 7.0)有氧条件下进行有氧呼吸，无氧条件下可以进行无氧呼吸或发酵。将制备的包含细菌的碳糊5通过铜探针7电极开始工作，因智能循环伏安扫描一体机9与合金膜2、铜探针7电极相连通，因此当工作电极启动时，其智能循环伏安扫描一体机9通过循环伏安法可测得大肠杆菌的存在，及相关 的数量或浓度。
权利要求1.一种快速检测大肠杆菌的一体化薄膜生物传感器，其主要构造有:树脂片(I)、合金膜(2)、支撑结构检测层(3)、培养基层(4)、碳糊(5)、注浆孔(6)、铜探针(7)、连接导线(8)、智能循环伏安扫描一体机(9)、玻璃试管(10)，其特征在于:树脂片(I)镀制有一层合金膜(2)，支撑结构检测层(3)上沉积有一层培养基层(4)，玻璃试管(10)内可灌入碳糊(5),其玻璃试管(10) — 口处开有注浆孔(6)，玻璃试管(10)两端口各设有铜探针(7)，铜探针(7)通过连接导线(8)与智能循环伏安扫描一体机(9)相连通，智能循环伏安扫描一体机(9 )输入端口还与合金膜(2 )相连通。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测大肠杆菌的一体化薄膜生物传感器，其特征在于所述的合金膜(2)其厚度在2 4_。
3.根据权利要求1所述的一 种快速检测大肠杆菌的一体化薄膜生物传感器，其特征在于所述的培养基层(4)其厚度在8 15mm。
4.根据权利要求1所述的一种快速检测大肠杆菌的一体化薄膜生物传感器，其特征在于所述的玻璃试管(10)与培养基层(4)接触面处开有毛细孔。
专利摘要本实用新型涉及一种微生物检测技术领域，具体的说是一种检测大肠杆菌的生物传感器。一种快速检测大肠杆菌的一体化薄膜生物传感器，所述的树脂片镀制有一层合金膜，支撑结构检测层上沉积有一层培养基层，玻璃试管内可灌入碳糊，其玻璃试管一口处开有注浆孔，玻璃试管两端口各设有铜探针，铜探针通过连接导线与智能循环伏安扫描一体机相连通，智能循环伏安扫描一体机输入端口还与合金膜相连通。本实用新型解决了对细菌检测操作复杂，且需要花费时间长的问题，提供了一种容易制备且测试操作简单方便、灵敏度高、特异性强、响应时间短、可定量检测细菌浓度的生物传感器，实现了对细菌的直接检测。
文档编号G01N27/48GK203117162SQ20132016142
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月2日 优先权日2013年4月2日
发明者徐云鹏, 燕春晖 申请人:徐云鹏