包含多价结合淀粉样β蛋白的D-肽的聚合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及新型多价结合淀粉样β蛋白的聚合物质，其由多个互相连接的本身已经具有结合淀粉样β蛋白性质的物质构成，并涉及这些在下文中称为“聚合物”的物质的应用，特别是在药物中的应用。
【专利说明】包含多价结合淀粉样β蛋白的D-肽的聚合物及其应用
[0001] 本发明涉及新型多价结合淀粉样β蛋白的聚合物质，其由多个互相连接的本身 已经具有结合淀粉样β蛋白性质的物质构成，和涉及这些在下文中称为"聚合物"的物质 的应用，特别是在药物中的应用。
[0002] 由于以后几十年人口统计的发展，患年龄相关性疾病的人数将会增加。在此特别 提及所谓的阿尔茨海默病（AD，阿尔茨海默氏痴呆，拉丁语=MorbusAlzheimer)。
[0003] 迄今为止不存在针对AD的病因起作用的活性物质或药物。迄今为止已经使用和 批准的药物能减轻阿尔茨海默氏痴呆中发生的一些症状，但不能减缓疾病的进展或带来恢 复。存在一些已经在动物实验中能成功预防、但不（一定）能成功治疗AD的物质。针对神 经变性疾病的活性物质由DE10 2006 015 140Al获知。
[0004] 阿尔茨海默病的一个特征是淀粉样蛋白β肽（Α-β肽、Αβ或Αβ肽）的细胞外 沉积。这些A-β肽以斑块形式的这种沉积典型地在AD患者死后的脑内被确定。因此各种 形式的Α-β肽（诸如原纤维）负责该疾病的产生和发展。另外，数年来，小的、可自由扩散 的Α-β寡聚物被认为是AD的产生和发展的主要原因。
[0005]Α-β单体，作为Α-β寡聚物的单元，在人体内不断地产生，据推测本身是无毒的。 甚至有可能单体具有正功能。取决于它们的浓度，Α-β单体可偶然地簇集到一起。该浓度 取决于它们在体内产生和降解的速度。如果A-β单体的浓度在体内随着年龄增长而增加， 那么单体到Α-β寡聚物的自发簇集是越发可能的。如此产生的Α-β寡聚物可类似朊病毒 地增多并最终导致阿尔茨海默病。
[0006]AD的预防与治疗或甚至治愈之间的重要区别为以下事实：预防可通过阻止第一 个A-β寡聚物形成就能实现。为此，几个、少许对A-β寡聚物具有低亲和性和选择性的 A-β配体是足够的。
[0007] 由许多单体形成A-β寡聚物为高级反应（eineReaktionhoherOrdnung)并因 此高程度地取决于A-β单体的浓度。由此甚至活性A-β单体浓度的少量降低都将导致第 一个Α-β寡聚物的形成被阻止。可能至今处于开发中的预防性-治疗概念和物质是基于 该机制的。
[0008] 然而在AD的治疗中，是从完全改变的状况出发的。在这种情况下，存在Α-β寡聚 物或很可能甚至较大的聚合物或原纤维，其通过类似朊病毒的机制增多。然而，这种增多是 低级反应并且几乎不再取决于A-β单体浓度。
[0009] 从现有技术已知的物质以不同的方式降低A-β单体和/或寡聚物浓度。因此，例 如，已经在动物实验中用于预防目的的Y-分泌酶调节剂是已知的。
[0010]WO02/081505Α2公开了各种结合A-β肽的D-氨基酸序列。这些D-氨基酸序列 以4μM的解离常数（Kd值）结合淀粉样蛋白β肽。
[0011]WO2011/147797Α2公开了由氨基吡唑和肽组成的杂化化合物，其阻止A-β的寡 聚反应。
[0012] 与A-β肽相互作用的化合物由DE10 2008 037 564AUDE69621 607Τ2 或DE 10 2010 019 336Al已知。多价聚合物与两个结合伴侣的结合描述于WO2008/116293Al 中。
[0013] 就已经在动物实验中显示正性结果的许多物质而言，在人的临床研究中不能证实 该效果。临床II期和III期研究只允许治疗其中AD已经被清楚地诊断的人。在这种情况 下，Α-β单体浓度的少量降低不再足以阻止由已经存在的Α-β寡聚物例如通过类似朊病 毒的机制更多地产生A-β寡聚物。A-β寡聚物的增多或，更好是，它们的破坏或无害处理 对疾病过程的影响则是绝对必要的。
[0014] 迄今为止，阿尔茨海默氏痴呆主要通过神经心理测验进行诊断，通过对认定为痴 呆症状的人进行的实验。然而已知在出现症状的长达20年之前Α-β寡聚物和随后的原纤 维和斑块就在患者脑内产生，且可能已经造成不可逆的损害。然而，迄今为止在症状发作之 前诊断AD还是不可能的。
[0015] 由此对新型化合物（活性物质）存在需求，其高特异性且高亲和性地结合A-β寡 聚物，并因此阻止它们的增多。这些化合物应当不显示任何具有不期望副作用的效果，特别 是不引起免疫反应。此外，毒性Α-β寡聚物和由此还有小的可自由扩散的寡聚物即便在低 浓度下应当被识别、彻底灭除和/或阻止其（类似朊病毒的）增多。
[0016] 此外，还存在对新型化合物的需求，其可用作为探针用于A-β寡聚物的识别和标 记，特别是当这种寡聚物只以低浓度出现时。
[0017] 此目的通过本发明的聚合物实现，其包含至少两种结合淀粉样β蛋白寡聚物的 物质（单体）。
[0018] 对本发明而言，术语A-β寡聚物既指A-β聚集物又指A-β寡聚物还指小的、可 自由扩散的Α-β寡聚物。聚合物，对本发明而言，是由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19或20个本身已经结合淀粉样β蛋白的物质（单体）或其多重体形成的物 质。
[0019] 在一实施方案中，聚合物为肽。它们优选地基本上由D-氨基酸构成。
[0020] 对本发明而言，表述"基本上由D-氨基酸构成"指所使用的单体由至少60%，优选 75%、80%，尤其优选85%、90%、95%，特别是96%、97%、98%、99%、100%的0-氨基酸构 成。
[0021] 在本发明的变化形式中，使用以不超过500μΜ，优选250、100、50μΜ，尤其优选 25、10、6μΜ，特别是4、2、1μΜ的解离常数（Kd值）结合Α-β单体和/或Α-β寡聚物和/ 或A-β肽的原纤维的单体。
[0022] 本发明的聚合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多的上述单体。
[0023] 在另一个实施方案中，单体选自下组：
[0024]SEQIDNO: 1，SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQID NO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11，SEQID NO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQID NO:18,SEQIDNO:19,SEQIDNO:20,SEQIDNO:21, SEQIDNO:22,SEQIDNO:23,SEQID NO:24,SEQIDNO:25,SEQIDNO:26,SEQIDNO:27, SEQIDNO:28,SEQIDNO:29,SEQID N0:30,SEQIDN0:31,SEQIDN0:32,SEQIDN0:33,SEQIDN0:34,SEQIDN0:35,SEQID N0:36,SEQIDN0:37,SEQIDN0:38,SEQIDN0:39, SEQIDN0:40,SEQIDN0:41,SEQID NO:42,SEQIDNO:43,SEQIDNO:44,SEQIDNO:45, SEQIDNO:46,SEQIDNO:47,SEQID N0:48,SEQIDN0:49,SEQIDN0:50,SEQIDN0:51,SEQIDN0:52,SEQIDN0:53,SEQIDNO:54,SEQID NO:55, SEQID NO:56,SEQID NO:57,SEQID NO:58, SEQID NO:59,SEQID N0:60,SEQID NO:61,SEQID NO:62,SEQID NO:63,SEQID N0:64. SEQID NO:65,SEQID NO:66,SEQID NO:67, SEQID NO:68,SEQID NO:69,SEQID N0:70, SEQID NO:71,SEQID NO:72,SEQID NO:73, SEQID NO:74,SEQID NO:75,SEQID NO:76, SEQID NO:77,SEQID NO:78和SEQIDNO:79和它们的同源物。
[0025] 在另一个变化形式中，本发明的聚合物与淀粉样蛋白β肽的部分结合。
[0026] 在另一个变化形式中，所述单体具有与上述序列相差最多三个氨基酸的序列。
[0027] 此外，包含上述序列的序列也用作单体。
[0028] 在另一个变化形式中，所述单体具有上述序列的片段或具有与上述序列同源的序 列。
[0029] 对本发明而言，"同源序列"或"同源物"指氨基酸序列与上述单体氨基酸序列之一 具有至少 50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%的同一性。代替术语"同一性"，术语"同源的" 或"同源性"在本说明书中作为同义词使用。两个核酸序列或多肽序列之间的同一性借助基 于Smith,T.F·和Waterman,Μ.S(Adv.Appl.Math. 2 :482-489(1981))的算法的BESTFIT程 序通过比较而计算，其中对氨基酸设定以下参数：缺口形成罚值：8和缺口延长罚值：2 ;对 于核酸设定以下参数：缺口形成罚值：50和缺口延长罚值：3。两个核酸序列或多肽序列之 间的同一性优选通过在各自全序列长度内核酸序列/多肽序列的同一性来定义，如其借助 基于Needleman,S.B.和Wunsch,C.D. (J.Mol.Biol. 48 :443-453)的算法的GAP程序通过比 较而计算，其中对于氨基酸设定以下参数：缺口形成罚值：8和缺口延长罚值：2 ;对于核酸 设定以下参数：缺口形成罚值：50和缺口延长罚值：3。
[0030] 对本发明而言，两个氨基酸序列同一，如果它们具有相同的氨基酸序列。
[0031] 在一个变化形式中，同源物理解为上述单体的相应的反向-反转 (retro-inverse)序列。根据本发明，术语"反向-反转序列"指以对映体形式组成的氨基 酸构成的氨基酸序列（反转的：a-C原子的手性是反转的）且其中序列顺序相对于原始氨 基酸序列还是相反的（retro=反向的）。
[0032] 本发明的聚合物由相同单体构成，或包含不同的单体。
[0033] 在一个替代方案中，本发明的聚合物由2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多的上述单 体的每个任意的组合构成。
[0034] 在一实施方案中，本发明的聚合物为由两个D3单体构成的二聚体（SEQID N0:13)。
[0035] 在另一个实施方案中，本发明的聚合物为由两个RD2单体构成的二聚体（SEQID N0:76)。
[0036] 二聚体可通过例如化学合成或肽合成来制备。
[0037] 在本发明的一实施方案中，所述单体彼此共价键连接。在另一个实施方案中，所述 单体彼此非共价键连接。
[0038] 如果在相互之间没有使用接头或接头基团的情况下肽头对头、尾对尾或头对头直 链连接在一起，则对本发明而言存在单体单元的共价键或共价连接。
[0039] 如果单体通过生物素和链霉抗生素、特别是链霉抗生素四聚体彼此连接在一起， 则对本发明而言存在非共价连接。
[0040] 在本发明的一个变化形式中，所述单体可以直链地，特别是如上所述地彼此连接。 在另一个变化形式中，所述单体分支地彼此连接成本发明的聚合物。
[0041] 根据本发明，支化聚合物可以是树状聚合物，其中所述单体彼此共价键连接或非 共价键连接。
[0042] 可选地，所述单体也可与平台分子（Plattform-MolekUl)(诸如，PEG或糖）连接， 从而形成支化聚合物。
[0043] 可选地，这些可选项的组合也是可能的。
[0044] 本发明的聚合物特征在于它以不超过1μm，优选800、600、400、200、100、ΙΟηΜ，尤 其优选 1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100pM、50pM，特别是不超过 20pM的解离 常数结合淀粉样β蛋白寡聚物。在另一个实施方案中，本发明的聚合物特征在于它以不 超过ImM,优选 800、600、400、200、100、1(^]?，尤其优选 1000、900、800、700、600、500、400、 300、200、100、5011]\1，特别优选 1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100?]\1、50?]\1，最优 选不超过20ρΜ，特别是15、10、9、8、7、6、5ρΜ的解离常数结合淀粉样β蛋白寡聚物。
[0045] 本发明的聚合物适用于药物中。
[0046] 在一实施方案中，涉及用于治疗阿尔茨海默病的聚合物。在另一个实施方案中，涉 及可用于治疗帕金森氏病、CJD(克雅氏病）或糖尿病的聚合物。
[0047] 按照本发明由其单方面与A-β寡聚物结合的单体构成的聚合物，相对于单体明 确显示出在针对Α-β寡聚物的选择性和亲和性方面的的协同效果。换而言之：本发明的聚 合物优于单体。对本发明而言，协同效果为显示比单体单独或它们相加高的针对Α-β寡聚 物的选择性和亲和性，特别是就关于结合A-β寡聚物的Kd值而论。
[0048] 接头应理解为通过共价键与单体键合的一个或多个分子，这些接头也可以通过共 价键彼此连接。
[0049] 在本发明的一个替代方案中，由单体预先给定的聚合物的性质，即A-β寡聚物的 结合，不会被接头改变。
[0050] 在另一个替代方案中，接头导致由单体预先给定的聚合物性质发生变化。在一个 这样的实施方案中，本发明的聚合物对A-β寡聚物的选择性和/或亲和性增强和/或解 离常数降低。在另一个实施方案中，对接头进行选择，或者可对接头进行排列，使得它们改 变本发明聚合物的空间效应，通过这样的方式使得这些结合选择性地仅与一定尺寸的A-β 寡聚物结合。
[0051] 接头非限制性的实例是氨基酸序列"nwn"。
[0052] 本发明聚合物这种空间效应的改变，也可通过本发明支化聚合物的构造，通过特 定构造的树状聚合物或借助单体和平台分子的相应聚合物构造或这些可选项的组合来获 得。
[0053] 本发明的另一主题是包含本发明聚合物的组合物，特别是用于治疗阿尔茨海默 病。
[0054]本发明的其它主题是包含本发明聚合物的组合物，特别是用于阻止毒性A-β寡 聚物或用于破坏由其形成的聚合物或原纤维。
[0055] 本发明的"组合物"可以是例如疫苗、药物（例如以片剂的形式）、注射溶液、食物 或食品增补剂，其在基于专业知识制备的制剂中包含本发明的聚合物。
[0056] 本发明的聚合物能解除A-β寡聚物或其形成的聚合物、以及原纤维的毒性，通过 与它们结合并因此将它们转化为无毒化合物而实现。能抑制原纤维形成的物质也不一定能 破坏先前形成的原纤维，因为先前形成的A-β原纤维非常稳定且只能很难地和非常缓慢 地破坏。
[0057] 因此，本发明的主题还有一种解除A-β寡聚物、由其形成的聚合物或原纤维的毒 性的方法。
[0058] 由于它们不仅结合小的、可自由扩散的A-β寡聚物，也结合较大的A-β寡聚物直 至原纤维的性质，在AD的各个阶段可使用本发明的聚合物。基于本发明的教导可制备还能 选择性结合各种形式的A-β寡聚物的聚合物。
[0059] 此外，本发明的主题还有一种制备本发明的聚合物的方法。优选的方法为，例如， 肽合成法（肽）、蛋白质的重组制备、和用于任何所谓低分子量化合物的公认的有机合成 法。
[0060] 本发明还涉及聚合物作为探针用于淀粉样β蛋白寡聚物的鉴定、定性和/或定量 测定的用途。本发明的主题还有探针，其包含本发明的聚合物，用于淀粉样β蛋白寡聚物 的鉴定、定性和/或定量测定。
[0061] 此种探针极为重要，因为它们可以进行阿尔茨海默氏痴呆的早期诊断。这意味着 疾病可甚至在极早期的阶段进行处理。
[0062] 此种分子探针包含本发明的聚合物，可例如通过静脉内注射给患者。探针的其它 组分可以是：着色剂、荧光染料、放射性同位素（例如PET)、钆（MRI)和/或用于探针在成 像中使用的组分。在穿过血脑屏障之后，探针可与Α-β寡聚物和/或斑块结合。这样标记 的A-β寡聚物和/或斑块可借助成像技术诸如，SPECT、PET、CT、MRT、质子-MR谱等显现。 [0063] 本发明的另一主题为聚合物用于阻止毒性淀粉样β蛋白寡聚物增多的用途。
[0064] 此外，本发明的聚合物还用于使无毒聚合物-淀粉样β蛋白寡聚物复合物成像。
[0065] 本发明的另一主题是一种包含本发明聚合物的试剂盒。在这种试剂盒中，本发明 的聚合物可在容器中，任选地与缓冲液一起/在缓冲液中或在溶液中包装。试剂盒的所有 组分可包装在同一容器中或彼此分开。此外，试剂盒可包含其使用的说明。这种试剂盒可， 例如，根据本发明包含具有塞子和/或隔膜的注射瓶中。此外，其中也可包含例如一次性注 射器。
[0066] 可根据本发明使用的序列如下所示：
[0067]RD2：ptlhthnrrrrr(SEQIDNO：1)
[0068]D3D3 ：rprtrlhthrnrrprtrlhthrnr(SEQIDNO:13)
[0069]D3nwnD3 ：rprtrlhthrnrnwnrprtrlhthrnr(SEQIDNO:14)
[0070]双重-D3-游离的-N末端：（rprtrlhthrn;r)2-PEG3(SEQIDNO: 15)
[0071]双重-D3-游离的-C末端：PEG5- (rprtrlhthrnr) 2(SEQIDNO: 16)
[0072]kqhhveygsdhrfead(SEQIDNO:2)
[0073]shyrhisp(SEQIDNO:3)
[0074]giswqqshhlva(SEQIDNO:4)
[0075] prtrlhth(SEQ ID NO :5)
[0076] qshyrhispaqv(SEQ ID NO:6)
[0077] qshyrhispdqv(SEQ ID NO:7)
[0078] qshyrhispar (SEQ ID NO :8)
[0079] kshyrhispakv(SEQ ID NO:9)
[0080] rprtrlhthrnr(SEQ ID NO:10)
[0081] rprtrlhthrte(SEQ ID NO:11)
[0082] kprtrlhthrnr(SEQ ID NO:12)
[0083] daefrhdsgye (SEQ ID NO: 17)
[0084] hhghspnvsqvr(SEQ ID NO:18)
[0085] gsfstqvgslhr(SEQ ID NO:19)
[0086] htgtqsyvprl (SEQ ID NO :20)
[0087] tlayaraymvap (SEQ ID NO: 21)
[0088] tlayaraymvap (SEQ ID NO:22)
[0089] atpqndlktfph(SEQ ID NO:23)
[0090] tqpetdllrvqf (SEQ ID NO:24)
[0091] citwpptglty(SEQ ID NO:25)
[0092] tfletgpiyadg(SEQ ID NO:26)
[0093] lvppthrhwpvt (SEQ ID NO :27)
[0094] appgnwrnylmp(SEQ ID NO:28)
[0095] dnysnyvpgtkp (SEQ ID NO :29)
[0096] svsvgmkpsprp(SEQ ID NO:30)
[0097] slpnpfsvssfg(SEQ ID N0:31)
[0098] yvhnpyhlpnpp(SEQ ID NO:32)
[0099] crrlhtyigpvt(SEQ ID NO:33)
[0100] gatmkkmddhtv (SEQ ID NO :34)
[0101] lgktqklsdahs (SEQ ID NO: 35)
[0102] ddqarpymaygp (SEQ ID NO :36)
[0103] gdtwvnmvsmvh(SEQ ID NO:37)
[0104] gytwvnmvsmvh (SEQ ID NO :38)
[0105] wtntvarlatpy (SEQ ID NO:39)
[0106] qtqalyhsrqvh (SEQ ID NO:40)
[0107] nsqtqtlhlfph(SEQ ID N0:41)
[0108] hntsanilhssh (SEQ ID NO:42)
[0109] shinptsfwpap (SEQ ID NO :43)
[0110] tfsnplymwprp (SEQ ID N0:44)
[0111] gpspfnpqptpv (SEQ ID NO:45)
[0112] fsdhksptpppr(SEQ ID NO:46)
[0113] stsvyppppsaw(SEQ ID NO:47)
[0114] yglptqansmql (SEQ ID NO :48)
[0115] hnrtdntyirpt (SEQ ID NO :49)
[0116] lqqplgnnrpns (SEQ ID NO :50)
[0117] kpedsaaypqnr(SEQ ID NO:51)
[0118] rpedsvitktqnt (SEQ ID NO: 52)
[0119] raadsgctptkh (SEQ ID NO :53)
[0120] rprtrlhthrnt (SEQ ID NO: 54)
[0121] rprtrlhthtnv (SEQ ID NO :55)
[0122] rprtrlhthtnr (SEQ ID NO :56)
[0123] rprtrlhthrkq (SEQ ID NO :57)
[0124] rprtrlhtIrnr (SEQ ID NO :58)
[0125] rrrsplhthrnr (SEQ ID NO:59)
[0126] lrsprqrripri (SEQ ID NO :60)
[0127] rkrqlrmttprp (SEQ ID NO: 61)
[0128] shyrhispaqk(SEQ ID NO:62)
[0129]双重-D3-游离的-N末端：（rprtrlhthrnr)2-(SEQ ID N0:63)
[0130]双重-D3-游离的-C末端：（rprtrlhthrnr)2 (SEQ ID N0:64)
[0131] DB 3 ：rpitrlrthqnr (SEQ ID N0：65),
[0132] D3 ：rprtrlhthrnr (SEQ ID NO:66)
[0133] RD I ：pnhhrrrrrrtl (SEQ ID NO ：67)
[0134] RD 3 ：rrptlrhthnrr (SEQ ID NO ：68)
[0135] D3-delta~hth：rprtrlrnr(SEQ ID N0:69)
[0136] NT-D3：rprtrl(SEQ ID NO：70)
[0137] DB I ：rpitrlhtnrnr (SEQ ID N0：71),
[0138] DB 2:rpittlqthqnr(SEQ ID N0：72),
[0139] DB 4 ：rprtrlrthqnr (SEQ ID N0：73()
[0140] DB 5 ：rpitrlqtheqr (SEQ ID NO. 74)
[0141] D3-delta~hth D3-delta~hth：rprtrlrnrrprtrlrnr(SEQ ID N0:75)
[0142] RD 2-RD 2：ptlhthnrrrrrptlhthnrrrrr(SEQ ID NO：76)
[0143] DO 3：sgwhynwqywwk(SEQ ID N0:77)
[0144] rprtrsgwhynwqywwkrnr(SEQ ID NO:78)
[0145] ptIsgwhynwqywwkrrrrr(SEQ ID NO:79)
[0146] 结合A-β的抗体如下所示：
[0147] 抗体，其
[0148] a)与淀粉样蛋白β肽或淀粉样蛋白β肽部分片段的反向-反转序列结合和/或
[0149] b)与淀粉样蛋白β肽的多聚化结构域结合，也与淀粉样蛋白β肽结合，和/或
[0150] c)与上述根据本发明的序列之一结合，选自以下组：
[0151] SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3，SEQ ID N0:4，SEQ ID N0:5，SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:7，SEQ ID N0:8，SEQ ID N0:9，SEQ ID N0:10，SEQ ID N0:11，SEQ ID NO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQID NO:18,SEQIDNO:19,SEQIDNO:20,SEQIDNO:21, SEQIDNO:22, SEQIDNO:23,SEQID NO:24,SEQIDNO:25,SEQIDNO:26,SEQIDNO:27, SEQIDNO:28, SEQIDNO:29,SEQID N0:30,SEQIDN0:31,SEQIDN0:32,SEQIDN0:33,SEQIDN0:34, SEQIDN0:35, SEQID N0:36,SEQIDN0:37,SEQIDN0:38,SEQIDN0:39,SEQIDN0:40, SEQIDN0:41,SEQID NO:42,SEQIDNO:43,SEQIDNO:44,SEQIDNO:45, SEQIDNO:46, SEQIDNO:47,SEQID N0:48,SEQIDN0:49,SEQIDN0:50,SEQIDN0:51,SEQIDN0:52, SEQIDN0:53,SEQID NO:54,SEQIDNO:55,SEQIDNO:56,SEQIDNO:57, SEQIDNO:58, SEQIDNO:59,SEQID N0:60,SEQIDN0:61,SEQIDN0:62,SEQIDN0:63, SEQIDN0:64. SEQIDN0:65,SEQID N0:66,SEQIDN0:67,SEQIDN0:68,SEQIDN0:69, SEQIDN0:70, SEQIDN0:71,SEQID NO:72,SEQIDNO:73,SEQIDNO:74,SEQIDNO:75, SEQIDNO:76, SEQIDNO:77,SEQID NO:78和SEQIDNO:79或其同源序列。 实施例：
[0152] 实施例I:
[0153] 制备以下4个D3二聚体：
[0154]D3D3 ：rprtrlhthrnrrprtrlhthrnr(SEQIDNO:13)
[0155]D3nwnD3 ：rprtrlhthrnrnwnrprtrlhthrnr(SEQIDNO:14)
[0156]双重-D3-游离的-N末端：（rprtrlhthrnr)2_PEG3(SEQIDNO: 15)
[0157]双重-D3-游离的-C末端：PEG5- (rprtrlhthrnr) 2(SEQIDNO: 16)
[0158] 此外，制备由D3和Dl(序列qshyrhispaqv,SEQIDNO:6)或D3和Vl构成的二聚 体（通过化学合成或肽合成），其中Vl为Dl的变异体，其中在N末端的第一个氨基酸缺失 (序列shyrhispaqk，SEQIDNO:62)
[0159] D3D1
[0160]D3V1
[0161]V1D3
[0162]实施例2:
[0163] 硫黄素T试验
[0164] 在本领域技术人员已知的常规的硫黄素-T-(ThT)试验中对比实施例1中制备的 D3二聚体以及D3单体。ThT是一种当与规则的原纤维结合时显示较高荧光的染料并因此 用作为原纤化的计量。D3二聚体降低Α-β原纤化比D3单体有效得多。
[0165] 附图1显示用于分析在D3或D3多聚体的存在下A-β1-42聚集行为的ThT试验的 结果。通过用HFIP预温育过夜和随后利用真空离心（在HFIP中222μMAβ)蒸发来制备 A-β沉淀物。将A-β沉淀物再悬浮于250μLPBSpH7. 4 (包含10μmThT和10μmD3 或D3多聚体）中并分成等分试样用于一式四份的测定。ThT突光在突光分光计中于λex 440nm和λem= 490nm测量。
[0166]实施例3:
[0167] 在本领域技术人员已知的常规的ThT试验ChTThT试验中对比实施例1中制备的 D3D1二聚体以及Dl和D3单体。
[0168] D3D1二聚体降低Α-β原纤化比D3单体有效得多。
[0169] 附图2显示用于分析在D3和Dl的存在下或在D3D1多聚体的存在下A-β1-42的 聚集行为的ThT试验的结果。将A-β在HFIP中预温育过夜（在HFIP中222μMA-β)。随 即制备等份的13. 5μg，并蒸发HFIP过夜。将A-β沉淀物再悬浮于270uLPBSpH7.4 (包含 10μmThT)中，并随即加入相应浓度的D3或D3D1多聚体（5μM，10μM，50μM或100μΜ)， 然后将混合物分成等分试样用于一式五份的测定。ThT荧光在荧光分光计中于Aex 440nm 和λem= 490nm测量。
[0170] 实施例4：
[0171] 将实施例1中制备的D3二聚体和D3单体与Aβ1-42混合并经受密度梯度离心。 在此方法中，通过碘克沙醇梯度（5-50%)的沉降分析研究溶液中A-β的粒径分布和A-β 肽混合物的粒径分布。混合物包含80μMA-β和20 (D3)或10 (D3D3)μM肽。离心之后， 通过自表面的连续的移液操作获得各140μ1的15级分并利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)继之以银染色进行分析。结果（附图3)显示所述肽显著地降低Α-β寡聚物含 量（级分4-10)，在该研究的时间点D3D3比D3降低的程度高得多。产生了大的聚集物，其 可在级分12-15中检测到。进一步的研究显示D3-A-i3寡聚物沉淀并转变为大的无定形和 无毒聚集物（Funke等，ACSChem.Neurosci. 2010)。
[0172] 实施例5：
[0173] 本发明的物质能抑制原纤维的形成和能破坏预先形成的原纤维。在硫黄素T(ThT) 解原纤化（disfibrilation)试验中，与相应的抑制剂单体（D3SEQIDN0:66，RD2SEQID N0:1，D3(A)delta-hthSEQIDN0:69)比较，研究了抑制剂二聚体（D3D3SEQIDN0:13， RD2RD2SEQIDN0:76，D3(A)delta-hthD3(A)delta-hthSEQIDN0:75)的效力。
[0174] 在此研究了，在特定的温育期之后降低预成型的ThT-阳性原纤维的程度。硫黄素 T(ThT)，在与淀粉样蛋白ThT-阳性的原纤维相互作用时，显著地改变其光谱性质。测得的 ThT突光的降低（λem:450nm,λex:490nm)反映β-折叠结构的降低，β-折叠结构是Αβ 原纤维的特征。
[0175] 为了制备预成型的Α-β原纤维，将33μπι的合成Αβ(1-42)在IOmM磷酸钠pH7. 4 和8.5%01^0中于371：温育6天。经此产生的六3原纤维与0.14 8/^1的各物质（0303、 RD2RD2、D3A-hthD3A-hth、D3、RD2、D3Ahth)和ΙΟμπιThT混合得到 20μΜ。将 50μL的 各反应混合物填充具有384孔的黑色微量滴定板孔（Nunc，Langenselbold)中。在17. 5h 内监测ThT荧光。在此，每次测量之前振摇微量滴定板30s。所有样品进行一式五份的测 量。
[0176] 在评价中，测定中值、标准差和显著性（单体的和二聚体的效应子之间）。将效应 子的ThT荧光标准化至在不存在抑制剂物质下的Aβ原纤维的ThT荧光。
[0177] 所有试验的抑制剂物质显示ThT荧光降低（附图4)。这证实了它们都能将预成 型的Α-β原纤维转化为非原纤维样的Α-β种类。在本文上下文中，与单体肽D3、RD2和 D3A-Ahth比较，二聚体物质D3D3、RD2RD2和D3A-hthD3A-hth显示出明显更显著的效 果。显著性通过Mann-Whitney检验来确定并通过星号显不在图中：*，p〈0. 05;**，p〈0. 01。
[0178] 实施例6：
[0179] 为了获得D3和D3D3对比的定量亲和性的数据，按照实施例6中的描述制备 Αβ-1-42原纤维。与之对比，90%的Αβ-1-42和10%的氨基末端生物素化的Αβ-1-42的 混合物用于原纤化实验。为了从可能的大量的其它Αβ构象异构体（例如单体和无定形的 寡聚物）中分离这些原纤维，使原纤维制备经受实施例4中描述的密度梯度离心操作。只 有级分11和12中获得的原纤维随后用作表面等离子共振分析中的配体。在此，将它们固 定于链霉抗生素-涂覆的芯片上（SensorChipSA)。之后，通过"单循环动力学"分析测定 分析物D3和D3D3的亲和性。所用的分析物浓度、所得到的传感器的克数（Sensorgrams) (粗线）、所得到的拟合曲线（细虚线）和所得到的解离常数包含于附图5和6中。
[0180] 结果显示D3单体与两个略有不同结合位点以I. 1μm和0. 12μπι的解离常数结 合。D3二聚体，也与两个不同的结合位点结合，其中一个的解离常数为0. 17μm，与D3单体 相似，但另一个的解离常数为8. 8pM，低几个数量级。这表明多价物质（本发明中的D3D3) 与它们靶标的结合比相应的单价物质（在此D3)强几乎10000倍。
【权利要求】
1. 聚合物，其包含至少两种结合淀粉样0蛋白寡聚物的物质（单体）。
2. 根据权利要求1的聚合物，其特征在于，所述单体为基本上由结合淀粉样0蛋白的 D-氨基酸或者抗体或抗体片段构成的肽。
3. 前述权利要求任一项的聚合物，其特征在于，构成聚合物的各单体以不超过 500iiM、优选不超过100iiM、优选不超过10iiM、尤其优选6iiM、特别是不超过4iiM的解离 常数（KD值）结合淀粉样蛋白0肽的单体和/或寡聚物和/或原纤维。
4. 前述权利要求任一项的聚合物，其特征在于，包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多单 体。
5. 前述权利要求任一项的聚合物，其中所述单体选自： SEQ IDNO:l,SEQ IDNO:2, SEQ IDNO:3, SEQ IDN0:4, SEQ IDNO:5, SEQ IDNO:6, SEQ IDNO:7, SEQ IDNO:8, SEQ IDNO:9, SEQ IDN0:10, SEQ IDNO:ll,SEQ IDNO:12, SEQ ID NO:13, SEQ IDNO:14, SEQ IDNO:15, SEQ IDNO:16, SEQ IDNO:17, SEQ IDNO:18, SEQ ID NO:19, SEQ IDNO:20, SEQ IDNO:21, SEQ IDNO:22, SEQ IDNO:23, SEQ IDNO:24, SEQ ID NO:25, SEQ IDNO:26, SEQ IDNO:27, SEQ IDNO:28, SEQ IDNO:29, SEQ IDNO:30, SEQ ID NO:31, SEQ IDNO:32, SEQ IDNO:33, SEQ IDNO:34, SEQ IDNO:35, SEQ IDNO:36, SEQ ID N0:37, SEQ IDN0:38, SEQ IDN0:39, SEQ IDN0:40, SEQ IDN0:41,SEQ IDN0:42, SEQ ID NO:43, SEQ IDNO:44, SEQ IDNO:45, SEQ IDNO:46, SEQ IDNO:47, SEQ IDNO:48, SEQ ID N0:49, SEQ IDN0:50, SEQ IDN0:51,SEQ IDN0:52, SEQ IDN0:53, SEQ IDN0:54, SEQ ID NO:55, SEQ IDNO:56, SEQ IDNO:57, SEQ IDNO:58, SEQ IDNO:59, SEQ IDNO:60, SEQ ID N0:61,SEQ IDN0:62, SEQ IDN0:63, SEQ IDN0:64. SEQ IDN0:65, SEQ IDN0:66, SEQ ID N0:67, SEQ IDN0:68, SEQ IDN0:69, SEQ IDN0:70, SEQ IDN0:71,SEQ IDN0:72, SEQ ID N0:73,SEQ IDNO:74, SEQ IDNO:75, SEQ IDNO:76, SEQ IDNO:77, SEQ IDNO:78和SEQ ID NO: 79 或2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多的上述单体的任意组合。
6. 前述权利要求任一项的聚合物，其特征在于，是两个D3-单体的二聚体。
7. 前述权利要求任一项的聚合物，其特征在于，所述单体彼此共价键连接或非共价键 连接。
8. 前述权利要求任一项的聚合物，其特征在于，所述单体不通过接头彼此直接连接，或 通过接头基团彼此连接。
9. 前述权利要求任一项的聚合物，其特征在于，所述单体直线或分支地彼此连接。
10. 前述权利要求任一项的聚合物，其特征在于，为树状聚合物，或者所述单体与平台 分子连接或以这些选项的组合连接。
11. 前述权利要求任一项的聚合物，其特征在于，包含相同或不相同的单体。
12. 聚合物，其特征在于，以不超过lym，优选800、600、400、200、100、10nM，尤其优 选 1000、900、800、700、600、500、400、300、200、10(^]\1，特别优选不超过5(^]\1，最优选不超过 20pM的解离常数结合淀粉样0蛋白寡聚物。
13. 前述权利要求任一项的聚合物，其用于药物中的应用。
14. 前述权利要求任一项的聚合物，其用于治疗阿尔茨海默病。
15. 试剂盒，其包含权利要求1-14任一项的聚合物。
16. 探针，其包含权利要求1-14任一项的聚合物。
17. 组合物，其包含权利要求1-14任一项的聚合物，优选用于治疗阿尔茨海默病。
18. 制备权利要求1-16任一项的聚合物的方法，其特征在于，采用肽合成法或低分子 量化合物的有机合成法，或者所述聚合物通过蛋白质的重组生产来制备。
19. 权利要求1-17任一项的聚合物作为探针用于淀粉样0蛋白寡聚物的鉴定、定性和 /或定量测定的用途。
20. 权利要求1-18任一项的聚合物的用途，其用于阻止淀粉样0蛋白寡聚物。
21. 权利要求1-19任一项的聚合物的用途，其用于形成无毒的聚合物-淀粉样0蛋白 寡聚物复合物。
【文档编号】G01N33/68GK104380111SQ201380018314
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年4月5日 优先权日:2012年4月5日
【发明者】D·威尔伯尔德, S·A·丰克, O·布雷纳, L·纳吉尔-斯特杰, D·巴特尼克 申请人:于利希研究中心有限公司