一种基于核酸适体来检测目标分子的酶联分析新策略的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于发夹结构的核酸适体来检测目标分子的酶联分析新策略。该方法将核酸适体对目标分子的特异识别和辣根过氧化物酶的高效催化反应有机结合，核酸适体识别目标分子后，发夹结构打开并捕获另一互补短链DNA，用捕获的DNA作为报告元素转换出颜色信号，是一种高灵敏高特异的快速检测方法。本发明适合检测具有核酸适体的各种靶物质，尤其适合小分子靶标。由于本方法以可视化的信号作为输出结果，无需大型仪器为依托，样品也无需复杂的前处理步骤，尤其适合发展现场实时检测，可以被广泛的应用于医学诊断、生物分析、食品安全和环境监测等领域中。
【专利说明】-种基于核酸适体来检测目标分子的酶联分析新策略
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物传感器领域，特别涉及一种用形成发夹结构的包含核酸适体序列 的核酸序列识别目标分子，用互补核酸作为报告元素来定量和检测目标分子的酶联分析新 策略。
【背景技术】
[0002] 酶联免疫吸附分析（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA)是基于抗原和 抗体的免疫反应和酶的高效催化反应而建立的一种生物分析技术，自1971年，被Perlmann 和Weemen分别独立地创立以来，ELISA凭借其灵敏度高、特异性好、成本低、速度快、仪器设 备简单等优势，得以迅速发展。己被广泛的应用于医学诊断、生物分析、食品安全和环境监 测等领域中。但是由于抗体稳定性差，分析结果重现性低，以及存在交叉反应等缺点大大限 制了ELISA作为标准分析方法的应用。
[0003] 核酸适体（Aptamer)是单链DNA或者RNA，通过指数富集配体的系统进化 (SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialenrichment,SELEX)技术从核酸文 库中筛选得到，能高效和特异的结合各种靶标。核酸适体有化学抗体之称，它的出现，为识 别元素家族增添了新的活力。抗体的制备需在动物体内完成，耗时长而且制备数量有限，而 核酸适体可以通过化学方法大量合成，并可以进行精确的化学修饰；抗体属于蛋白类，容易 变性失活，而核酸适体性质稳定，能长期存放，变性后还可以复性；核酸适体通过折叠成特 定的三维结构和目标物质结合，对于一些毒性较大、免疫原性较低的无法制得抗体的物质， 却可以筛选得到核酸适体。对于抗体来说，不同制备批次间差异很大，导致检测平行性低， 而筛选出来的核酸适体序列已经确定，通过PCR技术大量扩增再次合成时，准确性和重复 性好，几乎不存在批次间的差异。另外核酸适体的价格比抗体便宜很多。这些显而易见的 优点使得核酸适体成为更理想的分子探针，用核酸适体代替抗体发展ELISA有广阔的应用 前景。
[0004] 用核酸适体代替抗体发展ELISA的方法称为酶联核酸适体分析（EnzymeLinked aptamerAssay，ELAA)，己发展的ELAA的检测机制类似于ELISA，包括双抗夹心和竞争 分析。双抗夹心法的夹心结构包括两种：aptamer/target/aptamer和aptamer/target/ antibody，双抗夹心法简单实用，但是它检测的靶标必须满足一个条件，就是能同时结合两 个识别元素。所以这种方法只适合检测蛋白等生物大分子，它们有足够大的尺寸，有足够多 的结合位点，能同时结合两个识别元素，而小分子因为分子尺寸太小，只能结合一个识别元 素，不能用夹心结构检测。竞争分析法适合小分子的检测，它的原理如下：标记了辣根过氧 化物酶的靶标和待测靶标竞争与固相核酸适体结合。待测样品中靶标含量越高，则与固相 核酸适体结合的越多，使得酶标靶标与固相核酸适体结合的机会就越少，这样加入底物后 根据显色深浅判断，显色深者为阴性。竞争分析显色深者为阴性，浅者为阳性，一些操作上 的细节都会导致每次的阴性对照数值存在差异，不利于结果判断。另外，检测中需要酶标记 的目标分子，酶标小分子通常很麻烦，而且酶标之后也可能影响其结合核酸适体的能力，影 响检测结果的准确度。以上两种酶联分析都存在某些缺陷，夹心性酶联分析不能检测小分 子，竞争型分析适合检测小分子，但是该方法存在缺陷。所以发展能检测小分子的新型酶联 策略是必要的。
[0005] 食品安全及环境分析等领域的毒害物质多为小分子靶标，有迫切的检测需要。发 展更简单合理的新型酶联适体检测策略检测小分子靶标，在食品安全和环境分析领域有广 阔的应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种基于核酸适体的酶联分析新策略，用于快速、灵敏的 检测复杂试样中的小分子靶标，为现场快速检测提供技术平台。
[0007] 本发明所提供的酶联核酸适体分析方法，用形成发夹结构的包含核酸适体序列的 核苷酸序列识别目标分子，目标分子和核酸适体特异相互作用诱导发夹结构打开，通过互 补杂交作用，打开的发夹的一段能捕获另一段带生物素（biotin)标签的DNA序列，通过生 物素和链霉亲和素的特异相互作用，biotin可以结合HRP-Streptavidin(辣根过氧化物酶 标记的链霉亲和素），HRP催化四甲基联苯胺（TMB)底物显色。检测原理如图1所示。
[0008] 具体步骤如下：
[0009] 1、设计一个核酸片段，其特征在于：包含和目标分子特异结合的核酸适体序列并 能形成发夹结构。为方便描述，我们将此核酸片段命名为A1链，具体来讲A1包含三段，分 别是I、II、III，其中I段和III段的碱基互补，因此能形成发夹结构。而II段和III段合 起来为目标分子的核酸适体。A1的一端（3'或者5'端）预先标记着氨基基团，以便偶联到 N-羟基丁二酰亚胺（NHS)包衣的酶标板孔，形成固相核酸适体。另外保证发夹区域的长度 在11-20个碱基对。
[0010] 2、设计一个核酸片段，特征在于：与步骤1中核酸A1的I段反向互补，长度在 10-15个碱基，为了方便描述，我们将此核酸适体命名为B1链。B1链的一端（3'或者5'端） 预先标记着biotin,以便结合HRP-Streptavidin,进而转换出颜色信号。
[0011] 3、固定A1到NHS活化的酶标板孔。反应的缓冲液为磷酸盐缓冲液（pH= 8. 5)，反 应温度为室温，反应时间24h。发生完偶联反应后洗涤酶标板。以便去掉未反应的核酸序 列。接着用3%BSA封闭未反应的NHS基团，37°C反应18h，然后洗涤酶标板。
[0012] 4、将包含目标分子和B1链的样品溶液加入到固定了A1的酶标板口，室温反应 30-50min后，这时会发生重要的反应，A1发夹打开，目标分子和A1中II、III段特异性结 合，同时A1中I段捕获B1链，倒掉反应液，洗涤酶标板口三次。
[0013] 5、将包含HRP-str印tavidin的溶液加入到上步反应完毕的酶标板口，室温反应 30min，B1链事先是标记了biotin基团，biotin特异性结合HRP-streptavidin，倒掉反应 液，洗涤酶标板口三次。接着将TMB-H202底物液加入酶标板口，室温反应20min，HRP催化 TMB-H202底物显蓝色，加酸终止反应变成黄色。
[0014] 6、测黄色产物在450nm处的紫外吸收值，根据净吸收值确定检测的线性关系，即 标准曲线。测实际样品反应后的净吸收值，根据标准曲线确定目标分子含量
[0015] 本发明的主要技术特点：
[0016] 1、本发明采用的是两条带标签的DNA核酸序列，A1带氨基标签，B1带生物素标签。 寡核苷酸的合成和修饰已具备相当成熟的技术，带常规标签的ssDNA通过商业途径可以轻 松获得，而且价格不贵。
[0017] 2、本发明采用的第一条DNA序列A1形成发夹结构，其技术特点是：核酸适体和目 标分子结合的能力>A1形成发夹结构的能力 >两条DNA互补配对形成双链的能力。没有 目标分子时，而有B1链的存在，A1发夹不能打开。当有目标分子时，发夹结构打开，核酸适 体和目标分子结合，同时两条DNA杂交成双链。
[0018] 3、本发明设计的分析检测方法，B1链和目标分子同时加入，在30-50min之内，识 别反应就能完成，现场检测的时间2h足够。
[0019] 本发明的优点：
[0020] 1、本方法将核酸适体的识别技术和过氧化物酶的高效催化能力结合在一起，检测 有高灵敏度和特异性。
[0021] 2、本方法无色者为阴性，颜色深者为阳性，更方便结果的观察。
[0022] 3、用核酸适体作为识别元素，核酸适体制备批间差异小、性质长期稳定，导致核酸 适体为依据的酶联分析方法重复性好，检测结果可信度高。
[0023] 4、核酸适体可以通过PCR技术大量合成，并能在任意位置修饰，且价格低廉，导致 该方法检测成本低。
[0024] 5、检测靶标范围广，尤其适合检测小分子，对于毒性和无免疫原性的小分子也可 以筛到核酸适体，应用该方法检测。
[0025] 6、方法操作简单，易于实现自动化检测，可完成大批量的测试任务。
[0026] 7、有比色结果无需大型仪器、无需复杂的样品前处理，操作简单、适合现场即时应 用。
[0027] 8、在医学诊断、生物分析、食品安全和环境监测等领域中有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1为传感原理示意图。
[0029] 图2为该方法检测ATP的实验结果 [0030]图3为该方法检测卡那霉素的实验结果
【具体实施方式】
[0031] 下面结合附图对本发明做进一步的描述
[0032] 实施例1:用建立的方法进行微量ATP的检测
[0033] 本实验所用的DNA序列：A1中斜体序列是ATP的核酸适体，A1形成发夹结构，茎部 有13对碱，中间处有一对碱基不配对，所以茎部不是连续的，这样的结构有利于发夹的打 开。B1和A1的5'端反向互补。
[0034] 表一、实验中用到的DNA序列
[0035]
【权利要求】
1. 一种基于发夹结构的核酸适体来检测目标分子的酶联分析新策略的检测方法，其特 征在于，包括以下步骤： 1) 将检测DNA链A1固定到NHS活化的酶标板孔。洗涤酶标板。接着用BSA封闭未反 应的NHS基团。再次洗涤酶标板。 2) 将包含目标分子和B1链的样品溶液加入到固定了 A1的酶标板口，室温反应 30-50min后，倒掉反应液，洗漆酶标板。 3) 将包含HRP-streptavidin的溶液加入到上步反应完毕的酶标板口，室温反应 30min，倒掉反应液，洗涤酶标板。接着将TMB-H202底物液加入酶标板口，室温反应20min， HRP催化TMB-H202底物显蓝色，加酸终止反应变成黄色。 4) 测黄色产物在450nm处的紫外吸收值，根据净吸收值确定检测的线性关系。实际样 品的吸收值和标准曲线对照确定目标的含量。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中的A1链包含靶标的酸适体序 列但是比核酸适体序列长，长出来的序列和核酸适体的一段能形成发夹结构。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中的A1链一端是氨基基团标记 的，以便通过和NHS活化基团的反应固定到酶标板口。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于B1能和A1中非核酸适体序列互补配对，并 且核酸适体和目标分子结合的能力> A1形成发夹结构的能力 >两条DNA互补配对形成双 链的能力。没有目标分子时，而有B1链的存在，A1发夹不能打开。当有目标分子时，发夹 结构打开，核酸适体和目标分子结合，同时两条DNA杂交成双链。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于B1的一端事先标记了生物素基团，它能结 合 HRP-streptavidin,再催化 TMB_H202 底物显色。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于该技术检测的靶标范围广，特别适合小分 子检测。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于该技术是现场快速检测技术。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该方法可以被广泛的应用于医学诊断、生 物分析、食品安全和环境监测等领域中。
【文档编号】G01N21/31GK104330563SQ201410249619
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年6月9日 优先权日:2014年6月9日
【发明者】赵秋伶, 张振宇 申请人:辽宁工程技术大学