抗牙鲆免疫球蛋白d的单克隆抗体及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗牙鲆免疫球蛋白D的单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株JF-IgD，保藏号为：CCTCCNO：C2014159，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为：2014年9月2日的杂交瘤细胞分泌的。所述单抗经间接酶联免疫反应实验结果显示单抗能与重组牙鲆IgD重链蛋白发生特异性结合，免疫印迹结果显示：本发明的单克隆抗体能特异性识别牙鲆IgD重链δ1-δ4基因编码的重组蛋白以及分子量为120kDa的牙鲆天然IgD重链蛋白。本发明制备了抗牙鲆IgD单克隆抗体，为检测牙鲆IgD蛋白分子以及IgD表面阳性（IgD+）淋巴细胞的提供了重要工具。
CCTCC NO：C2014159
2014.09.02
【专利说明】抗牙鲆免疫球蛋白D的单克隆抗体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种单克隆抗体的制备方法,具体涉及一种抗牙鲆iParalich thysOhVacew1S)免疫球蛋白D (IgD)的单克隆抗体及其制备方法,其属于鱼类分子免疫学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)是脊椎动物B淋巴细胞在受到抗原刺激后活化、增殖、成熟后所分泌的效应性应答分子，在体液免疫防御中发挥重要作用。哺乳动物免疫球蛋白重链根据其恒定区氨基酸组成及抗原性差异，可分为Y，α，ε，μ和δ五种类型，分别相应构成IgG，IgA，IgE，IgM和IgD。相比于哺乳动物，鱼类免疫球蛋白研究起步较晚，且人们在很长一段时间内认为鱼类只存在IgM—种免疫球蛋白，随着分子生物学研究的发展，近年来在鱼体上发现了 IgD、IgT/Z等免疫球蛋白类型。其中，单体结构的IgD被视为最为神秘的免疫球蛋白，它在机体内含量很低，抗体活性很难被检测到，其基因与蛋白结构在不同物种之间变异较大，相比其他几种免疫球蛋白而言，有关它免疫学功能特性研究十分欠缺。
[0003]近年来研究显示IgD可能在鱼类系统免疫监视以及免疫应答调节中起着重要作用，但由于缺乏IgD的有力检测工具，大多研究仅限于基因检测水平的层面，目前关于IgD在蛋白水平上的研究则十分欠缺。牙鲆是我国重要的海水养殖经济鱼类，通过利用抗牙鲆IgD单克隆抗体可以方便快捷地检测牙鲆体内各组织IgD在蛋白水平上的变化和波动，为准确检测牙鲆IgD表面阳性(slgD+)淋巴细胞数量及比例，监测牙鲆细胞免疫应答水平提供了有力工具。同时也有助于全面了解牙鲆免疫系统防御特点，对鱼类疾病免疫防治具有一定的理论和指导意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种抗牙鲆IgD的单克隆抗体及其制备方法，为实现IgD蛋白分子以及IgD表面阳性(slgD+)淋巴细胞的免疫学检测提供重要工具，为进一步了解IgD在牙鲆体内的免疫功能起到重要作用。
[0005]本发明的任务是由以下技术方案实现的:研制了一种抗牙鲆免疫球蛋白D的单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由名称为:杂交瘤细胞株JF-1gD，保藏号为=CCTCC NO:C2014159，保藏单位为:中国典型培养物保藏中心，地址:湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为:2014年9月2日的杂交瘤细胞分泌的。
[0006]与所述的单克隆抗体发生特异性结合的抗原决定簇位于牙鲆IgD重链δ 1- δ 4基因编码的蛋白肽区域。
[0007]—种所述抗牙鲆IgD单克隆抗体的制备方法,包括如下步骤:首先，抽取牙鲆外周血,经percoll不连续密度梯度离心获得牙鲆外周血白细胞,利用Trizol法抽提外周血白细胞的总RNA反转后获得cDNA，经PCR扩增获得牙鲆IgD重链δ 1- δ 4的编码基因，连接pET-28a载体构建重组表达质粒pET-28a-1gD，将其导入感受态大肠杆菌后经诱导表达、亲和层析纯化获得重组牙鲆IgD重链蛋白，以亲和纯化的重组牙鲆IgD重链蛋白作为抗原免疫Balb/c小白鼠，采用细胞融合制备杂交瘤细胞，经过免疫学检测筛选方法，筛选出分泌抗牙鲆IgD单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞JF-1gD，然后采用常规方法培养上述所得到的杂交瘤细胞N株JF-1gD，收集细胞培养上清液，经纯化后得到抗牙鲆IgD单克隆抗体。
[0008]所述的免疫学检测筛选方法是:间接酶联免疫法，转印免疫印迹法和免疫荧光法。其中所述的间接酶联免疫法和转印免疫印迹法综合确定该单抗与牙鲆IgD重链蛋白特异性结合反应真实存在；所述的转印免疫印迹法确定该单抗的抗原决定簇位于牙鲆IgD重链δ 1-δ 4基因编码的蛋白肽区域。
[0009]一种所述抗牙鲆IgD单克隆抗体在制备检测牙鲆IgD在各免疫组织中含量变化的试剂中的应用。
[0010]—种所述抗牙鲆IgD单克隆抗体在制备IgD在牙鲆免疫应答试剂中的应用。
[0011]本发明的单抗经间接酶联免疫反应实验结果显示单抗能与重组牙鲆IgD重链蛋白发生特异性结合，免疫印迹结果显示:本发明的单克隆抗体能特异性识别牙鲆IgD重链δ 1-δ 4基因编码的重组蛋白以及分子量为120 kDa的牙鲆天然IgD重链蛋白。免疫荧光检测结果显示，本发明的单克隆抗体能特异性识别部分白细胞的膜表面分子。流式细胞术分析结果显示，IgD表面阳性(slgD+)淋巴细胞主要为IgM表面阳性(slgM+) B淋巴细胞。
[0012]在倒置显微镜下观察，生长状态良好的该杂交瘤细胞分裂旺盛、外观饱满、浑圆、折光性强、细胞大小均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞有无限分裂增生能力；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，其培养基由桃红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的大量的抗牙鲆IgD单克隆抗体。
[0013]本发明的优点在于:由于本发明制备了抗牙鲆IgD单克隆抗体，为检测牙鲆IgD蛋白分子以及IgD表面阳性(IgD+)淋巴细胞的提供了重要工具。由于本发明重要的制备技术路线是:通过基因重组表达获得重组牙鲆IgD重链蛋白，以重组蛋白作为抗原免疫小鼠，采用细胞融合制备杂交瘤细胞，再经过免疫学检测筛选方法筛选出抗牙鲆IgD单克隆抗体。这样的制备技术路线设计新颖，严密而合理。
[0014]由于使用的间接酶联免疫技术，通过包被亲和纯化的重组牙鲆IgD重链蛋白于酶标板上，使得确认该发明单抗与牙鲆IgD蛋白发生的特异性结合反应真实存在。本发明将免疫印迹法和免疫荧光、流式细胞术结合起来，能够更加直观的显示该发明单抗与牙鲆IgD发生特异性结合反应。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为表达牙鲆IgD重链δ 1- δ 4区编码基因的重组表达质粒pET-28a_IgD构建示意图。
[0016]图2为牙鲆IgD重链δ 1-δ 4区融合蛋白的表达鉴定；其中条带M表示分子量标准蛋白；条带I表示诱导表达前的大肠杆菌电泳图谱；条带2表示诱导表达6h后的大肠杆菌电泳图谱；条带3表示分离纯化的牙鲆IgD重链δ 1- δ 4区融合表达蛋白。
[0017]图3为ELISA方法分析单克隆抗体对牙鲆IgD重链的特异性结合；其中I表示单抗与牙鲆IgD重链δ 1- δ 4区融合蛋白发生结合反应的OD值；2表示单抗与His_tag标签蛋白结合的OD值，即阴性对照；3表示空白对照。
[0018]图4为免疫印迹法分析单抗与牙鲆IgD重链δ 1- δ 4区特异性结合；其中条带M表示分子量标准蛋白；条带I表示诱导表达后的阳性大肠杆菌SDS-PAGE图谱；条带2表示单抗与牙鲆IgD重链δ 1- δ 4区融合蛋白发生结合反应；条带3表示阴性对照。
[0019]图5为免疫印迹法分析单抗与牙鲆外周血白细胞的特异性结合反应；其中条带M表示分子量标准蛋白；条带I表示牙鲆外周血白细胞的SDS-PAGE图谱；条带2表示单抗与牙鲆外周血白细胞120kDa蛋白发生结合反应；条带3表示阴性对照。
[0020]图6为间接免疫荧光法分析单抗与牙鲆外周血白细胞表面的特异性结合反应；其中A表示在100倍物镜下观察的单抗与血细胞表面发生特异性结合反应，荧光信号呈点状分散排布出表不阴性对照。
[0021]图7为流式细胞术分析单抗与牙鲆外周血白细胞的特异性结合反应；其中A表示外周血的荧光散点图表示牙鲆IgD+细胞比例的直方图。
[0022]图8为利用本发明单抗检测牙鲆三个不同组织中IgD表面阳性淋巴细胞的数量比例。
【具体实施方式】
[0023]下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明。
[0024]实施例1:构建表达牙鲆IgD重链δ 1- δ 4区质粒与蛋白表达
Cl)以抗凝剂(每50ml单细胞悬液RPM1-1640中加入6.7mg肝素钠和0.5g BSA) I:1的比例抽取牙鲆外周血细胞，利用percoll不连续密度梯度离心分离获取牙鲆外周血白细胞，以Trizol法抽提白细胞的总RNA。
[0025](2)根据引物设计原则及公布的一种牙鲆IgD重链编码基因全长序列(GeneBank:AB052658 )，利用引物设计软件Primer5.0，结合pET28 (a)质粒的多克隆位点的特点，选择Nhel与历fli/III的酶切位点处作为目的基因的插入位置，设计牙鲆IgD重链δ 1- δ 4区表达引物:
h游引物:5’ -CTAGCTAGCCCAAAAAGTCGGGTTGTCTCTCC-3，(SEQ ID N0.1)划线部分为
Nhel酶切位点；
下游引物:5’ -CCCAAGCTTTTATGAGCAGAGGCTGATATTCTTGG-3，(SEQ ID N0.2)划线部分为Hind\\\酶切位点。
[0026](3)以提取的总RNA为模板，先逆转录合成cDNA第一链，然后进行常规PCR扩增，反应条件:94 °C变性5 min ； 94 °C变性，30 s，56 °C退火60 s，72 °C延伸90 s，进行30个循环，最后72 °C延伸10 min, PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，利用DNA片段回收试剂盒对目的基因进行纯化回收。
[0027](4 )将质粒pET28 (a)和纯化回收的PCR扩增产物分别用限制性内切酶Nhe I和Λ?/7?/ΙΙΙ进行双酶切，连接后构建质粒pET28a-1gD (图1)。用重组质粒转化大肠杆菌BL21，然后把大肠杆菌BL21涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37 1:培养过夜，挑去菌落后经特异性引物PCR扩增检测确认有目的基因插入后，阳性菌落经扩大培养提取质粒进行双酶切鉴定，经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，可见经MeI和历WIII双酶切后，成为两个片段，分别为5369bp的pET28a和1203bp的牙鲆IgD重链δ 1-δ 4区基因片段(SEQ ID N0.3)，与理论值相符。经DNA序列测定结果正确。
[0028](5)将阳性克隆菌和含pET28a空载体的菌株放入含卡那霉素的LB液体培养基中37°C过夜振荡培养，次日按1:100稀释培养过夜的菌液，继续培养至菌液0D_=0.Γ0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β -D-th1galactoside, IPTG)至终浓度为lmmol/L，未加IPTG诱导的菌液作为对照，继续培养6h后，离心收集菌体进行SDS-PAGE分析。
[0029]结果表明,诱导后的菌液蛋白在相对分子质量ifr=45 kDa处有明显的条带,而未诱导的菌液蛋白无相应条带(图2)。且牙鲆IgD重链δ 1-δ 4区蛋白理论分子量以及标签蛋白分子量之和与SDS-PAGE凝胶显示的目的蛋白分子量一致。
[0030](6)采用上述方法，进行大量诱导。收集菌液，将菌体细胞用缓冲液B (50 mMTris-HCl, I mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% NP-40, pH 8.0)重悬后，反复冻融 5 次后置于冰浴条件下进行超声破碎 8 min (Sonics & Materials ;振幅 39% ;pulse on,4 s.；pulseoff, I s.),1500 g离心30 min收集包涵体沉淀；以Ni离子螯合的亲和层析柱(HisTrap HPI ml, GE)对重组蛋白进行纯化，纯化获得的目的蛋白经SDS-PAGE检测纯化情况，剩余的用PBS 缓冲液(NaCl 137 mmol/L, KCl 2.7 mmol/L, Na2HP04 10 mmol/L, KH2P04 2 mmol/L,pH 7.2)重悬，-80 °C保存备用。
[0031 ] 结果显示，经亲和层析纯化后的目的重组蛋白条带单一，分子量为45 kDa左右，无其他明显蛋白条带(图2)。
[0032]实施例2:小鼠抗牙鲆IgD重链δ 1- δ 4区单克隆抗体的制备一、免疫
用纯化的重组牙鲆IgD重链蛋白作为抗原。每次的免疫剂量为0.1ml，免疫共分4次进行，前2次免疫间隔为2周，后3次免疫间隔为I周，前两次为腹腔注射，后两次为尾静脉注射:
(1)基础免疫:纯化的重组蛋白与福氏完全佐剂等量(V/V)混匀作为抗原；
(2)加强免疫:纯化的重组蛋白与福氏不完全佐剂等量(V/V)混匀作为抗原；
(3)二次加强免疫:纯化的重组牙鲆IgD重链蛋白作为抗原；
(4)融合前三天的扩增免疫:纯化的重组牙鲆IgD重链蛋白作为抗原。
[0033]二、细胞融合
(1)脱颈椎处死免疫小鼠，无菌取出脾脏和胸腺后，分别过100目网筛，用RPM1-1640溶液吹打形成单细胞悬液；
(2)分别将脾细胞悬液和胸腺细胞悬液100rpm离心3min，弃去上清液，脾细胞沉淀用RPM1-1640溶液重悬，胸腺细胞沉淀用含有1%HAT的RPM1-1640 (含10%胎牛血清)选择性细胞培养液重悬。
[0034](3)取3 X 17个处于对数生长期的P3-X63-Ag8Ul骨髓瘤细胞，100rpm离心3min，去上清液后，用RPM1-1640溶液重悬；
(4)将脾细胞悬液与瘤细胞悬液混合均匀后，100rpm离心3min，完全吸去上清液，轻弹离心管底，使两种细胞沉淀充分混匀成糊状；用吸管吸取预温到37°C的聚乙二醇溶液lml，滴加到离心管内，在Imin内加完；然后在37°C水浴静置5min ；
(5)继续滴加已经预温到37°C的RPM1-1640溶液15ml，使PEG稀释而失去作用；
(6)补加RPM1-1640溶液至40ml,经100rpm离心3min,弃去上清液； (7)将沉淀的细胞用3ml37°C的RPM1-1640(含10%胎牛血清)细胞培养液重悬，冻存
2ml ；
(8)将剩下的Iml细胞悬液加入⑵制成的胸腺细胞悬液，混合均匀后滴加到96孔培养板中；
(9)将培养板放入37°C，C02浓度为4.5%的培养箱中培养，倒置显微镜观察细胞生长情况，大约两周后，取杂交瘤细胞培养上清液检测。
[0035]三、筛选和克隆
(I)筛选:融合后，待杂交瘤细胞群长到96孔培养板的孔底面积1/3时开始检测，采用间接酶联免疫技术筛选阳性杂交瘤细胞。
[0036]①包被抗原:将纯化的重组牙鲆IgD重链蛋白用碳酸盐包被液(pH 9.6) 1:10稀释，加入96孔酶标板中(50μ1/孔)，4°C包被过夜；
②吸出包被液，用含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤，每次5min，洗三次；
③每孔加入200μ13%的牛血清白蛋白(PBS配)，37°C封闭Ih ;
④同②法洗漆二次；
⑤将杂交瘤细胞培养上清作为第一抗体按每孔50μ1加入至酶标板，37°C温箱孵育
Ih ；
⑥同②法洗漆二次；
⑦碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig(1:4000稀释)作为第二抗体按每孔50μ1加入至酶标板，37°C温箱孵育Ih;
⑧同②法洗涤三次；然后每孔加入ΙΟΟμΙ4-硝基酚磷酸盐(ρΝΡΡ)应用液，暗处反应5 — 20min,每孔加入50μ1 2Μ的NaOH,稳定3 — 5min即可用405nm工作波长测定OD值。
[0037]以包被含pET28a空载体的菌落表达的标签蛋白作为阴性对照，测波长为405nm时各孔光吸收值，计算各实验孔与阴性对照光吸收值之比(P/N)，当P/N > 2.1时该孔为阳性。
[0038](2)克隆:采用有限稀释法对检测出的阳性杂交瘤细胞进行克隆，步骤如下:
①脱颈椎处死小鼠，无菌取出胸腺，在100目网筛上研磨，用RPM1-1640溶液吹打形成单细胞悬液；
②把胸腺细胞悬液100rpm离心3min，弃去上清液，胸腺细胞沉淀用1mlRPM1-1640 (含10%胎牛血清)细胞培养液重悬；
③把要克隆的阳性细胞孔中的细胞用血球记数板记数，然后用培养液以10倍梯度稀释，取出100个杂交瘤细胞，放入胸腺细胞悬液中；
④细胞悬液用滴管吹打均匀，滴加到96孔培养板中，每孔ΙΟΟμΙ，平均每个孔含有一个杂交瘤细胞；
⑤放入CO2培养箱中培养；
⑥两周后通过间接酶联免疫技术检测各孔杂交瘤细胞培养上清，把所得阳性克隆孔的杂交瘤细胞按上述方法再克隆一次，以保证形成单克隆。
[0039]四、冻存
取生长旺盛，形态良好的杂交瘤细胞，制成细胞悬液，200g离心5min，去上清，加冻存液(9份RPM1-1640培养基+ I份二甲亚砜)，使最终细胞密度为5X 16个/ml，将Iml细胞悬液装于2ml冻存管中，拧紧螺盖，然后将冻存管装入盛有棉花的小盒内，放于-80°C超低温冰箱内过夜(8-12小时)后，再浸入液氮内长期保存。本发明获得的生长旺盛，形态良好的杂交瘤细胞，其名称为:杂交瘤细胞株JF-1gD，保藏号为:CCTCC N0:C2014159，保藏日期为:2014年9月2日。
[0040]实施例3:本发明单抗的间接酶联免疫法鉴定:
(1)包被抗原:将纯化的重组牙鲆IgD重链δ1- δ 4区蛋白用碳酸盐包被液(pH 9.6)1:10稀释，加入96孔酶标板中(50μ1/孔)，4°C包被过夜；
(2)吸出包被液，用PBST洗涤，每次5min，洗三次；
(3)每孔加入200μ13%的牛血清白蛋白(PBS配)37°C封闭Ih ;
(4)同(2)法洗涤三次；
(5)将上述筛选和克隆出的杂交瘤细胞培养上清作为第一抗体按每孔50μ1加入至酶标板，37°C温箱孵育Ih;
(6)同(2)法洗涤三次；
(7)碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig(1:4000稀释)作为第二抗体按每孔50μ1加入至酶标板，37°C温箱孵育Ih ；
(8)同⑵法洗涤三次；然后每孔加入ΙΟΟμΙρΝΡΡ应用液，暗处反应5-20min，每孔加入50μ1 2Μ的NaOH，稳定3_5min即可用405nm工作波长测定OD值。
[0041 ] 用包被含pET28a空载体菌落表达的标签蛋白作为阴性对照，包被PBS作为空白对照，测波长为405nm时各孔光吸收值，计算阳性孔与对照孔吸收值之比(P/N)，当P/N彡2.1时为阳性。
[0042]结果:阳性孔吸光值为0.473 ;阴性对照为0.132，空白对照为0.876。此结果证实本发明单抗能与牙鲆IgD重链δ 1- δ 4区蛋白发生特异性结合反应(图3)。
[0043]实施例4:本发明单抗的转印免疫印迹法鉴定 (O十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳:
①将收集的阳性大肠杆菌和牙鲆外周血白细胞分别加入等比例含十二烷基磺酸钠的样品缓冲液，在沸水中煮3-5min ；
②将①处理过的样品加入上样孔中，每孔内加样品10μ1，在恒流条件下，起始时用低电流(30-40mA)，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，加大电流(50-70mA)，电泳至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳，取出凝胶；
③剪取一块与电泳凝胶相同大小的硝酸纤维素膜(孔径0.22Mm)以电转移缓冲液(电转移缓冲液:25mmol/L Tris-Base, 192mmol/L甘氨酸,20%甲醇,pH 8.3)润湿,放在电泳后的凝胶上。在硝酸纤维素膜上剪掉一个角，以标志样品顺序的起始端。用润湿的滤纸支持，将第二块润湿的滤纸贴在凝胶片的另一面；按上述放置顺序，使胶块与硝酸纤维素膜及滤纸形成一套夹心的〃三明治〃；
④将"凝胶三明治"置入盛有电转移缓冲液的电泳槽内，将硝酸纤维素膜面向阳极；电泳恒流200mA，通电5小时；
⑤转移完毕，取出硝酸纤维素膜。
[0044](2)免疫印迹:
①将硝酸纤维素膜用PBS洗10分钟，然后置3%的牛血清白蛋白溶液(PBS配)中封闭Ih, 370C ； ②用PBST洗3次，每次5分钟；
③将硝酸纤维素膜置于杂交瘤细胞培养上清中，37°C缓慢摇动I小时；以骨髓瘤细胞培养上清孵育硝酸纤维素膜作为阴性对照；
④同②法洗漆二次；
⑤将硝酸纤维素膜加入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig抗体(I: 4000稀释)中，37°C缓慢摇动I小时；
⑥同②法洗漆二次；
⑦把硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶发色液(NBT-BCIP发色液)中发色，直到颜色清晰为止;
⑧用去离子水洗涤，以终止反应。将硝酸纤维素膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。
[0045]结果:本发明单抗与重组牙鲆IgD重链δ 1- δ 4区分子量为45kDa蛋白发生特异性反应(图4),与牙鲆外周血白细胞120kDa蛋白发生特异性反应(图5),显示紫褐色条带，而阴性对照无条带显示。
[0046]实施例5:本发明单抗的间接免疫荧光方法鉴定
(I)将percoll不连续密度梯度离心获得的牙鲆外周血白细胞以0.0lM PBS重悬白细胞，将浓度调整到I X 17个/ml。
[0047](2)把血细胞悬液滴在干净的载玻片上，每滴10μ1，在室温下湿盒中沉降I小时后取出放入丙酮中固定20分钟，取出风干。
[0048](3)以杂交瘤上清(杂交瘤培养液)为第一抗体，加在载玻片的血细胞样品上，37°C湿盒中孵育45分钟。
[0049](4 )取出载玻片，用0.0IM PBS洗三次，每次5分钟。
[0050](5)以异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠抗体为第二抗体，加在血细胞样品上，37°C湿盒中孵育45分钟。
[0051](6)取出载玻片，同④浸洗，甘油封片。
[0052]( 7 )荧光显微镜下观察。
[0053]结果:本发明单抗与牙鲆部分白细胞表面发生特异性结合，呈现荧光阳性信号，在100倍油镜下可以看到绿色荧光信号在细胞膜表面呈散点状分布，这与IgD蛋白分布于B淋巴细胞表面的事实相吻合，而阴性对照则没有观察到荧光信号(图6)。
[0054]实施例6:本发明单抗的流式细胞术检测分析
(O选取暂养一周后的健康牙鲆，体长15 cm，于尾静脉抽取牙鲆外周血白细胞，利用percoll不连续密度梯度离心分离获取牙鲆外周血白细胞。将提取的牙鲆外周血白细胞用无菌PBS缓冲液稀释成细胞密度为I X 16 cells/ml的细胞悬液。
[0055](2)取细胞悬液500 μ 1，实验组加入500 μ I鼠抗重组牙鲆IgD重链δ 1- δ 4区蛋白的单克隆抗体，对照组加入500 μ I小鼠Ig，37°C孵育lh。
[0056](3)于680g，4°C条件下离心收集细胞，并用无菌PBS重悬洗涤细胞，洗涤三次，每次5分钟。
[0057](4)用lml FITC标记的羊抗鼠Ig单抗重悬(3)中洗涤离心后的细胞沉淀，37°C孵育Iho
[0058](5)于680g，4°C条件下离心收集细胞，并用无菌PBS重悬洗涤细胞，洗涤三次，每次5分钟。
[0059](6)离心洗涤完成后，用500 μ I无菌PBS重悬细胞，用于流式细胞仪分析。
[0060]结果:阴性对照样品流式分析的直方图呈现单峰，未有阳性反应细胞群，而与本发明单抗孵育的牙鲆白细胞流式分析直方图呈现双峰，说明本发明单抗可与牙鲆部分白细胞发生特异性结合，阳性细胞比率为27.8% (图7)。
[0061]实施例7:本发明单抗在检测牙鲆各免疫组织中IgD+细胞数量比例中的应用
(I)选取暂养一周后的健康牙鲆，体长15 cm，于尾静脉抽取牙鲆外周血白细胞，同时取牙鲆的脾脏和肾脏组织，利用percoll不连续密度梯度离心分离获取牙鲆外周血、脾脏及肾脏的白细胞。将提取的牙鲆各组织白细胞用无菌PBS缓冲液稀释成细胞密度为IXlO6cells/ml的细胞悬液。
[0062](2)取从每个组织样品分别准备两份500 μ I白细胞悬液，一份为检测样品，一份为对照样品，往检测样品中加入500 μ I鼠抗重组牙鲆IgD重链δ 1- δ 4区蛋白的单克隆抗体，同组织对照组加入500 μ I小鼠Ig，37°C孵育lh。
[0063](3)于680g，4°C条件下离心收集细胞，并用无菌PBS重悬洗涤细胞，洗涤三次，每次5分钟。
[0064](4)用lml FITC标记的羊抗鼠Ig单抗重悬(3)中洗涤离心后的细胞沉淀，37°C孵育Iho
[0065](5)于680g，4°C条件下离心收集细胞，并用无菌PBS重悬洗涤细胞，洗涤三次，每次5分钟。
[0066](6)离心洗涤完成后，用500 μ I无菌PBS重悬细胞，用于流式细胞仪分析。
[0067]结果:各组织阴性对照样品流式分析的直方图呈现单峰，未有阳性反应细胞群，而与本发明单抗孵育的牙鲆各组织白细胞流式分析直方图呈现双峰，说明本发明单抗可与牙鲆部分白细胞发生特异性结合，检测结果显示牙鲆外周血白细胞中IgD+细胞数量比例为27.8%，脾脏组织白细胞中的IgD+细胞数量比例为19.3%，肾脏组织白细胞中的IgD+细胞数量比例为11.2% (图8)。
[0068]本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种抗牙鲆免疫球蛋白D的单克隆抗体，其特征在于:所述的单克隆抗体是由名称为:杂交瘤细胞株JF-1gD，保藏号为:CCTCC NO:C2014159，保藏单位为:中国典型培养物保藏中心，地址:湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为:2014年9月2日的杂交瘤细胞分泌的。
2.一种如权利要求1所述抗鲆免疫球蛋白D的单克隆抗体的制备方法，其特征在于它包括如下步骤:首先，抽取牙鲆外周血，经percoll不连续密度梯度离心获得牙鲆外周血白细胞，利用Trizol法抽提外周血白细胞的总RNA反转后获得cDNA，经PCR扩增获得牙鲆IgD重链δ 1- δ 4的编码基因，连接pET-28a载体构建重组表达质粒pET-28a_IgD，将其导入感受态大肠杆菌后经诱导表达、亲和层析纯化获得重组牙鲆IgD重链蛋白，以亲和纯化的重组牙鲆IgD重链蛋白作为抗原免疫Balb/c小白鼠,采用细胞融合制备杂交瘤细胞,经过免疫学检测筛选方法，筛选出分泌抗牙鲆IgD单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞JF-1gD，然后采用常规方法培养上述所得到的杂交瘤细胞N株JF-1gD，收集细胞培养上清液，经纯化后得到抗牙鲆IgD单克隆抗体。
3.—种如权利要求1所述抗牙鲆免疫球蛋白D的单克隆抗体在制备检测牙鲆IgD蛋白含量变化的检测试剂中的应用。
4.一种如权利要求1所述抗牙鲆免疫球蛋白D的单克隆抗体在制备牙鲆IgD免疫应答试剂中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK104311668SQ201410606279
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月1日 优先权日:2014年11月1日
【发明者】唐小千, 战文斌, 绳秀珍, 邢婧 申请人:中国海洋大学