一种快速检测赭曲霉毒素a的胶体金试剂板的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种快速检测粮油、饲料中赭曲霉毒素A的胶体金试剂板，可用于快速检测粮油、饲料中的赭曲霉毒素A。本实用新型试剂板由上下两块塑料卡壳和试纸条组成，试纸条由依次黏贴在背衬上的样品垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫组成。塑料卡壳可固定试纸条，试纸条上的反应膜上标记有检测区和质控区，可将反应结果以肉眼可见的颜色表现出来。该试剂板操作简单快速，整个操作过程仅需十几分钟，且不需要借助其它仪器设备，适用于野外现场检测。同时，该试剂板通过调整提取液及稀释液的用量，可调整试剂板的检测限，用于不同检测要求的样品检测。
【专利说明】一种快速检测赭曲霉毒素 A的胶体金试剂板
【技术领域】
[0001] 本实用新型属于食品安全检测领域，涉及一种胶体金检测试纸板，具体涉及一种 快速检测粮油、饲料中赭曲霉毒素 A (ochratoxins Α,ΟΤΑ)的胶体金试纸板。
【背景技术】
[0002] 赭曲霉毒素（Ochratoxins)是一组结构类似的真菌毒素，有A、B、C、D 4种化合 物，主要危及人和动物肾脏，其中毒性最大、与人类健康关系最密切、产毒量最高、对农作物 的污染最重、分布最广的是赭曲霉毒素 A (Ochratoxin Α,ΟΤΑ)。赭曲霉毒素 A是被国际癌 症研究机构（LARC)确定为II B类致癌物(可能引起人类癌症的物质）的一种真菌毒素，它能 致癌、致畸、致突变、破坏免疫系统，对肝、肾脏造成损害，还可导致神经中毒。OTA主要毒害 动物的肾脏和肝脏，肾脏是第一靶器官，只有剂量很大时才出现肝脏病变，其中猪和禽类的 敏感性最强。在已发现的真菌毒素家族中，根据其重要性及危害性排序，OTA被认为是仅次 于黄曲霉毒素而列第二位。自然界中产生OTA的真菌以曲霉菌属和青霉菌属为主。在湿热 的南方一般以赭曲霉菌为主，侵害水分大于16%的粮食和饲料；而寒冷干燥的北方以青霉 菌为主，有些青霉菌在〇°C左右仍能生长，给粮食贮藏带来极大困难。
[0003] OTA是污染农作物的一种较常见的真菌毒素，对动物和人的健康有很大潜在危 害。随着对OTA毒性研究的深入，人们越来越重视它对人类健康的影响。至今全世界已经 有11个国家制订了食品（1?50 μ g/kg)和动物饲料（100?1000 μ g/kg)中OTA的限 量标准。我国GB 2761-2011 "食品安全国家标准食品中真菌毒素限量"中规定谷物及其 制品，豆类及其制品中赭曲霉毒素 A的限量标准为5 μ g/kg ;GB 13078. 2-2006 "饲料卫生 标准词料中赫曲霉毒素 A和玉米赤霉稀丽的允许量"中规定配合词料，玉米中赫曲霉毒素 A的限量标准为100 μ g/kg。
[0004] 目前粮油、饲料中赭曲霉毒素 A含量的检测方法主要采用薄层色谱法，酶联免疫 吸附法，高效液相色谱法以及液质联用法等检测方法。薄层色谱法作为标准方法虽然被广 泛使用沿用至今，特别是在一些基层使用单位，但其灵敏度较低，操作过程中需要接触更多 的有机溶剂等有毒有害试剂；液相色谱和液质联用法虽然可以精确地进行定性和定量分 析，但是由于其设备昂贵、操作复杂和对样品的纯度有较高的要求，需要专业的操作人员， 导致检测成本高、周期长，无法满足大批量样本快速筛查的需要。酶联免疫吸附法作为快速 方法，虽然具有快速、灵敏、操作简单等特点，但是仍然需要一定的操作要求和环境，不太适 用于户外和现场操作。
[0005] 胶体金免疫层析法是利用抗原抗体的特异反应，以条状纤维层析材料为固相，通 过毛细管作用使样品溶液在层析材料上泳动，以胶体金为显色媒介，将反应所需的原料大 部分整合到试剂板上，在层析过程中完成检测反应的的一种简易快速的免疫学检测技术。 该方法即克服了酶联免疫吸附法的一些不足，又具有快速、操作简单、特异性强、不需要额 外设备等优点。目前被广泛应用于生物技术诸多领域。
【发明内容】
[0006] 本实用新型针对粮油、饲料中的赭曲霉毒素 A含量检测展开研究，提供一种具有 快速、操作简单、特异性强、灵敏度高、不需要额外设备等特点，可用于现场快速检测粮油中 赭曲霉毒素 A含量的胶体金免疫检测试剂板。检测过程不受地点限制，十几分钟即可完成 对样品中赭曲霉毒素 A的定性和半定量测定。
[0007] 本试剂板由上下两块塑料卡壳和试纸条组成，试纸条由依次黏贴在背衬上的样品 垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫组成。其中样品垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫在相 邻的地方有2mm的重叠，以保证层析作用从样品垫到吸水垫的顺利进行，使样品溶液中的 有效成分、反应膜上的检测区及质控区与胶体金结合垫上的胶体金单抗偶联物顺利发生反 应。
[0008] 所述胶体金结合垫上包被有抗赭曲霉毒素 A鼠单抗与胶体金的偶联物；反应膜上 从样品垫至吸水垫方向依次包被有OTA-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测区和 质控区。
[0009] 本实用新型试剂板应用竞争抑制免疫层析原理，通过检测区的抗原和金标垫上的 金标抗体反应，以检测区是否显色来反应粮油、饲料中的赭曲霉毒素 A含量是否超标。加入 样本提取液后，金标抗体会随样品提取液朝吸水垫方向涌动扩散，如果样品中含有赭曲霉 毒素 A，则会先和金标抗体反应，当样品中的赭曲霉毒素 A含量超过或达到试剂板检出限， 金标抗体随样品液扩散至检测区时，由于有色的金标抗体与抗原的结合位点被样品溶液中 的赭曲霉毒素 A占据，而无法与检测区上的赭曲霉毒素 A抗原结合，无法固定在检测区上， 试剂板上的检测区不显色，则判定为阳性；如果样品中赭曲霉毒素 A在检测限以下或不含 有，金标抗体随样品液扩散至检测区时，则会固定在检测区上，试剂板上的检测区会呈现和 胶体金颗粒一样的颜色，则判定为阴性。
[0010] 本实用新型试剂板的各组成成分与功能如下：
[0011] 塑料卡壳：固定试纸条并标示功能区，显示加样孔、检测区、质控区。
[0012] 试纸条：背衬为一面涂有不干胶的不吸水材料，常用PVC板，用于固定试纸其他组 分；样品垫起吸收样品溶液，缓冲样品溶液PH值的作用，优选玻璃纤维制成；胶体金结合垫 上有抗赭曲霉毒素 A单抗与胶体金的偶联物，作用为样品液中的抗原与金标抗体反应的场 所，优选聚酯膜或玻璃纤维素膜制成；反应膜用于标记检测区和质控区，将反应结果以肉眼 可见的颜色表现出来，优选硝酸纤维素膜；吸水垫由吸水纸制成，用于吸收多余的溶液使其 不影响最终结果。
[0013] 本实用新型试剂板具有如下有益效果：
[0014] (1)特异性好。本实用新型试剂板对赭曲霉毒素 A交叉反应率为100%，与其它种 类真菌毒素包括黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮等均没有交叉反应。
[0015] (2)灵敏度高，检测限可根据需要调节。本实用新型试剂板的最低检测限为5μ g/ kg，满足国家标准中对食品中赭曲霉毒素 A的限量要求。同时可以根据实际需要，调节样品 前处理方法，调整提取液及稀释液的用量，调整试剂板的检测限，适用于不同检测要求的样 品检测。
[0016] (3)操作简单快速。本实用新型试剂板将实验所需的大部分原料都已整合到试纸 条上，不存在试剂配制、洗涤分离等操作，滴加样品提取液后3-5分钟即可肉眼读取结果。
[0017] (4)不依赖实验设备。本实用新型试剂板除样品前处理过程简单，检测结果肉眼可 直接判读，不需要借助其它仪器设备，适用于野外现场检测。
[0018] (5)成本低，效益好。本实用新型试剂板生产工艺简单，成本低，且检测时，不需要 单独做质控，质控和检测同时进行，降低了检测费用。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为赭曲霉毒素 A胶体金快速检测试剂板结构示意图。其中1为样品垫，2为胶 体金结合垫，3为反应膜，4为检测区，5为质控区，6为背衬，7为吸水垫。
[0020] 图2为赭曲霉毒素 A胶体金快速检测试剂板结果判定示意图。
[0021] 实施方式
[0022] 本实用新型试剂板的制备包括赭曲霉毒素 A免疫原的制备、抗赭曲霉毒素 A单克 隆抗体制备、胶体金溶液制备、胶体金标记抗赭曲霉毒素 A单抗的制备,赭曲霉毒素 A胶体 金快速检测试剂板的组装。
[0023] 1、赭曲霉毒素 A免疫原（OTA-BSA)制备
[0024] I. 1称取IOmg BSA溶解在2ml的20mM pH7. 4的PBS溶液中，完全溶解。
[0025] L 2称取Img赭曲霉毒素 A溶于0· 2ml四氢呋喃中，加入5 mg DCC和4 mg NHS， 室温下反应2小时。
[0026] 1. 3将上述反应溶液滴加入BSA溶液中，室温下反应4小时。
[0027] 1. 4将上述反应溶液装入透析袋中，用20mM pH7. 4 PBS溶液透析，4°C透析三天，期 间每8小时换一次透析液。
[0028] 1. 5取出透析后的溶液，离心，取上清，_20°C保存。
[0029] 2、抗赭曲霉毒素 A单克隆抗体制备
[0030] 2.1小鼠免疫
[0031] 将制备好的赭曲霉毒素 A免疫原，按体积比1:1加入佐剂混匀乳化，按蛋白浓度 100 μ g/只腹部皮下多点免疫BALB/c小鼠，首免免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，二免 及以后以免疫元和弗氏不完全佐剂等体积混匀，首免3周后，以同样方法进行二次免疫，二 免后每两2周免疫一次,三免后检测小鼠血清效价,血清效价合格后进行融合,融合前3天 再追加免疫一次。
[0032] 2.2细胞融合
[0033] 按照常规方法，准备好处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0)和提取免疫小 鼠的脾细胞，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞混合，然后在1分钟左右时间内（最佳时间为45 秒）缓慢加入预热的融合剂（PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲 养细胞，培养十96孔培养板，于37°C 5% CO2培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天 的时候进行全换液。
[0034] 2. 3杂交瘤细胞的筛选
[0035] 细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。 采用间接非竞争ELISA方法初选，检测细胞培养上清液，检测为阳性的孔，立即用有限稀释 法进行业克隆化。
[0036] 2. 4杂交瘤细胞的冻存
[0037] 将进行了 2-3次亚克隆后的杂交瘤细胞扩大培养后用含25%血清、10% DMSO的基 础细胞培养液冻存，浓度为IO6-IO7左右/ml。
[0038] 2. 5单克隆抗体腹水制备
[0039] 复苏冻存的杂交瘤细胞，扩大培养。取8-10周龄BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡 0.5ml/只，7-10日后腹腔注射杂交瘤细胞1-2 XlO6 /只，7-10日后抽取小鼠腹水，离心取 上清，测定效价，冻存备用。
[0040] 3、胶体金溶液制备
[0041] 取IOOml去离子水加入2. 5ml 1%氯金酸溶液，煮沸后，迅速加入I. 5ml 2%柠檬酸 三钠溶液，继续煮沸5分钟，冷却后，4°C避光保存。经测定，该胶体金颗粒直径为35nm左右。
[0042] 4、胶体金标记赭曲霉毒素 A单抗的制备
[0043] 移取制备的胶体金溶液100ml，用0· IM碳酸氢钠溶液调整pH值到8. 0,加入Iml 抗赭曲霉毒素 A单抗，搅拌15分钟，缓慢加入Iml 25M的聚乙二醇20000溶液，搅拌15分 钟后，lOOOOr/min离心15分钟。弃去上清液，加入2ml含2%BSA的pH7. 4的磷酸盐缓冲液 复溶后，4°C避光保存。
[0044] 5、胶体金快速检测试剂板的组装
[0045] 用点膜机把适当浓度的OTA-BSA偶联物以及羊抗鼠 IgG分别喷涂在反应膜上，作 为检测区和质控区，37°C干燥箱内干燥5小时。将适当浓度的金标抗体喷涂在经过处理的 胶体金结合垫上，37°C干燥箱内干燥5小时。在PVC背衬板上依次粘贴样品垫，胶体金结合 垫，反应膜和吸水垫。组装完毕后，用切割机切割为3. 5mm宽的试纸条，装入塑料模板中，制 成快速检测试剂板。成品同干燥剂一起密封入铝箔袋中保存。
[0046] 6、赭曲霉毒素 A快速检测试剂板的检测操作办法
[0047] 6. 1样品前处理
[0048] 取Ig粉碎的样品置于IOml离心管中，加入5ml样品提取液，剧烈震荡3分钟，静 置2分钟后，根据下表中检测线取对应量的上清液，再吸取对应量的样品稀释液稀释，混合 均匀后待用
[0049]
【权利要求】
1. 一种快速检测赭曲霉毒素 A的胶体金试剂板，本试剂板由上下两块塑料卡壳和试纸 条组成，试纸条由依次黏贴在背衬上的样品垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫组成，且在 相邻的地方有2_的重叠，试纸条上的背衬为一面涂有不干胶的不吸水材料；样品垫用玻 璃纤维制成；胶体金结合垫用聚酯膜或玻璃纤维素膜制成；反应膜用硝酸纤维素膜制成； 吸水垫用吸水纸制成，胶体金结合垫上喷有赭曲霉毒素 A单克隆抗体和胶体金的结合物， 所用胶体金颗粒的粒径大小约为35nm ;反应膜上从样品垫到吸水垫方向依次喷有OTA-BSA 偶联物和羊抗鼠 IgG，分别作为检测区和质控区。
【文档编号】G01N33/577GK204165982SQ201420428835
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】张波, 雷达, 刘向阳 申请人:北京康源泰博生物科技有限公司