本发明涉及抗体检测领域，具体为一种IgM抗体检测用吸附剂及其制备方法。
背景技术：
IgM抗体是体液免疫中最早出现的特异性抗体，当病原体感染人体时，IgM抗体的检测对传染病的早期诊断具有重要意义。目前市场上应用最广的方法包括捕获法和间接法，已应用于Elisa、胶体金、化学发光等检测平台。捕获法测定IgM时，部分临床样本中含有浓度不等的抗自身变性IgG的类风湿因子，其中存在IgM型抗体，会与抗人IgM抗体反应，造成假阳。而间接法测定IgM，影响则更加明显，因为针对某些指标的特异性IgM抗体常和特异性的IgG同时存在，但IgG与抗原的亲和力更强，造成阴性样本升高，干扰IgM的测定。故临床上对血清样本进行IgM检测时，捕获法或间接法都不同程度的受到IgG的干扰，造成结果的背景高，结果不准确。
现有技术中常采用蛋白A吸附、RF吸附剂处理样本去除IgG等因素的影响，降低检测结果的背景。但蛋白A液体状态下不稳定，易失活，而RF吸附剂多为进口，价格较贵，会提高检测成本。因此，在临床检测中，需要制备一种特异性好、性能稳定、价格便宜的吸附剂。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中IgM检测时，捕获法或间接法都不同程度的受到IgG的干扰，造成结果的背景高，结果不准确的缺陷，提供一种IgM抗体检测用吸附剂及其制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种IgM抗体检测用吸附剂，以10mM PB、150mM NaCl的pH7.2～7.4的磷酸盐缓冲液为基础，添加终浓度为6wt％的聚乙二醇6000、1mg/mL抗人IgG抗体、10mg/mL的BSA和1wt‰proclin 300。
该吸附剂的制备方法，包括以下步骤：
1)、10mM PB、150mM NaCl的磷酸盐缓冲液，调节pH在7.2～7.4之间；
2)、向缓冲液中加入聚乙二醇6000，使其质量浓度为6％，室温搅拌至完全溶解后，调整pH7.2～7.4；
3)、再加入抗人IgG抗体、BSA和proclin 300，使其终浓度分别为1mg/mL、10mg/mL和1wt‰。
进一步的，在配制前对抗人IgG抗体做透析处理：配制pH7.2～7.4的10mM PB、150mM NaCl的磷酸盐缓冲液，采用截留分子量10KD的透析袋处理抗人IgG，4℃下透析24h，中间换液3次。
活性采用人IgG包被测定，抗体效价不低于1:300000。添加抗人IgG的作用是抗人IgG可与临床样本中IgG形成免疫复合物，因不同中抗体的活性有差异，使这种复合物在聚合物存在下析出完全。BSA的存在可保持缓冲液中抗体的活性，一般认为蛋白浓度越高，蛋白越趋向于稳定。
PEG终浓度浓度约在3％可使免疫复合物析出。原因可能是PEG4000可与生物大分子发生共沉淀作用，因聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀，而且其与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，可在重力作用下形成沉淀析出。
本发明组成试剂简单，主要功能性成分包括抗人IgG和PEG6000，这两种试剂目前在市面上很成熟，价格便宜；本发明反应温和，吸附剂缓冲体系pH偏中性、离子强度适合，对于抗原抗体的免疫反应影响不大，适合多数试剂盒；本发明具有较好的灵敏度和特异性，对特异性的IgG和RF因子都具有较好的吸附作用，针对大多数IgM检测试剂，特别是间接法测定IgM有良好的应用范围，显著降低影响检测IgM抗体结果的样本背景，提高检测准确性。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1弓形虫IgM(TOX IgM)抗体检测试剂(磁微粒化学发光法)
样本来源：临床筛选弓形虫IgM抗体阳性5例、阴性5例，弓形虫IgG购自厂家2，RF购自厂家3。
不同类型和不同浓度PEG比较的比较：
吸附剂A(PEG2000)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、6％的聚乙二醇2000(PEG2000)。
吸附剂B(PEG4000)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、6％的聚乙二醇4000(PEG4000)。
吸附剂C(PEG6000)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、6％的聚乙二醇6000(PEG6000)。
吸附剂D(PEG20000)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、6％的聚乙二醇20000(PEG20000)。
将TOX IgG及RF因子分别添加到阴性样本中，各不同种类的PEG分别与同一批次试剂反应，对TOX IgM进行检测。
检测步骤：
(1)将样本1:100稀释后，取30ul稀释后的样本与30ul吸附剂混合，混匀后，37℃反应5min。
(2)加入30ul TOX-FITC，混匀，37℃反应15min。
(3)加入30ul偶联有FITC抗体的磁珠，混匀，37℃反应5min。
(4)用10mM PBS清洗3次，拍干。
(5)加入60ul AP标记的抗人IgM，37℃反应15min。
(6)用10mM PBS清洗3次，拍干。
(7)加入底物，读数。
(8)结果与临界值对比，得出比值，S/Co≥1为阳性，S/Co＜1为阴性。
结果如表1所示。
表1不同不同类型和不同浓度PEG对结果的影响
实验结果表明，采用PEG6000，浓度在6％，对样本中特异性IgG和RF因子吸附效果最理想，结果准确性最理想。
2.不同pH值吸附剂比较：
吸附剂A(pH5.0)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、6％的聚乙二醇6000(PEG6000)、2mg/mL抗人IgG抗体。
吸附剂B(pH6.0)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、6％的聚乙二醇6000(PEG6000)、2mg/mL抗人IgG抗体。
吸附剂C(pH7.2-7.4)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、6％的聚乙二醇6000(PEG6000)、2mg/mL抗人IgG抗体。
吸附剂D(pH8.5)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、6％的聚乙二醇6000(PEG6000)、2mg/mL抗人IgG抗体。
以上各不同pH的吸附剂分别与同一批次试剂反应，测试方法同上，对TOX IgM临床样本进行检测。结果如表2所示。
表2不同pH值吸附剂对结果的影响
结果表明，pH在中性区间7.2-7.4间，结果符合率100％。考虑到抗原抗体反应最适合就是在pH7.2-7.4间，所以配制吸附剂的最适pH在7.2-7.4间。
3不同抗人IgG浓度对结果的影响：
吸附剂A(pH7.2-7.4)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、6％的聚乙二醇6000(PEG6000)、0.25mg/mL抗人IgG抗体。
吸附剂B(pH7.2-7.4)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、6％的聚乙二醇6000(PEG6000)、0.5mg/mL抗人IgG抗体。
吸附剂C(pH7.2-7.4)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、6％的聚乙二醇6000(PEG6000)、1mg/mL抗人IgG抗体。
吸附剂D(pH7.2-7.4：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、6％的聚乙二醇6000(PEG6000)、2mg/mL抗人IgG抗体。
以上各不同pH的吸附剂分别与同一批次试剂反应，对TOX IgM临床样本进行检测。结果如表3所示。
表3不同抗人IgG浓度对结果的影响
结果表明，吸附剂：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、6％的PEG6000中添加2mg/mL以上浓度的抗人IgG时，结果符合要求。但考虑到试剂成本，优先选择吸附剂中添加1mg/mL的抗人IgG抗体，达到临床要求。
现有吸附剂条件：吸附剂C(pH7.2-7.4)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、6％的聚乙二醇6000、1mg/mL抗人IgG抗体，但考虑到长期稳定性，需要在吸附剂中添加10mg/mL的BSA，混匀后放置于2-8℃长期保存。
应用于试剂中的防腐剂通常包括各种抗生素、叠氮钠、硫柳汞等，但不同防腐剂对不同应用平台的酶的活性影响不一，需要找到一种光谱的防腐剂，一直微生物生长，proclin300是新一代广谱抗菌剂，能在较低的使用浓度下抑制细菌、真菌和酵母菌的生长，同时对酶的活性影响小。
实施例2-巨细胞病毒IgM(CMV IgM)抗体检测试剂(磁微粒化学发光法)
样本来源：临床筛选CMV IgM抗体阳性5例、阴性5例，巨细胞IgG购自厂家2，RF购自厂家3。
检测步骤：
(1)将样本1:100稀释后，取30ul稀释后的样本与30ul吸附剂混合，混匀后，37℃反应5min。
(2)加入30ul CMV-FITC，混匀，37℃反应15min。
(3)加入30ul偶联有FITC抗体的磁珠，混匀，37℃反应5min。
(4)用10mM PBS清洗3次，拍干。
(5)加入60ul AP标记的抗人IgM，37℃反应15min。
(6)用10mM PBS清洗3次，拍干。
(7)加入底物，读数。
(8)结果与临界值对比，得出比值，S/Co≥1为阳性，S/Co＜1为阴性。
结果如表4所示。
表4巨细胞病毒IgM抗体检测试剂
鉴于本发明实施例众多，不适合逐一列举说明，但各实施例所需验证内容和最终结论均接近，故此处不对各个实施例的验证内容逐一说明，仅以弓形虫IgM和巨细胞病毒IgM检测试剂为代表进行说明。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。