基于金纳米棒氧化过程光谱变化的抗氧化性评价方法与流程

本发明属于化学检测技术领域，尤其是涉及是一种基于金纳米棒GNRs氧化过程光谱变化的抗氧化性评价方法。

背景技术：

人体内有许多活性氧物种参与机体细胞的生理及病理过程，当体内的活性氧过量时，将压制体内的抗氧化防御系统，从而产生一系列如细胞损伤、蛋白质损伤、DNA变更、酶失活和脂质过氧化反应等负面作用。越来越多的证据表明饮食中的抗氧化物质可以保护重要的生物分子避免损伤，减缓氧化应激带来的危害，减少与衰老有关的慢性疾病的发生。临床试验和流行病学研究表明水果和蔬菜的摄入量与一些疾病(炎症、心血管、癌症、衰老有关的疾病)的发生呈反比，食物中的抗氧化剂(多酚类化合物、维生素E、C和胡萝卜素)在预防与氧化应激相关的疾病时很有效。因此，简单、可靠、快速检测筛选饮食中潜在的抗氧化剂变的尤为重要。

目前食品检测分析一般采用化学分析法(CA)、薄层层析法(TLC)、气象色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)，但需要繁琐、耗时的前处理，样品耗损较大。较之于灵敏度较低的CA和TLC方法，GC、HPLC的灵敏度相对较高，但操作技术要求高、仪器设备昂贵，并不适合现场快速测定和普及，而以金纳米材料为免疫标记物的检测技术正弥补了这些技术的缺点，迎合现代检测的要求，在现代食品分析检测中的运用也越来越多。相对于传统评价方法，这些基于纳米材料的方法因具有检测迅速、操作简便、仪器设备简单等特点引起了广泛关注。

目前为止，尚未有使用金纳米棒评价抗氧化性的技术。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种操作简便且检测灵敏度高的基于金纳米棒氧化过程光谱变化的抗氧化性评价的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：基于金纳米棒GNRs氧化过程光谱变化的抗氧化性评价方法，包括以下步骤：

(1)GNRs的制备：取CTAB溶液，在搅拌的同时往其中加入HAuCl₄溶液，混合均匀后，边搅拌边快速加入新配制的NaBH₄溶液，搅拌后静置，得金种子备用；

取CTAB溶液，加入AgNO₃溶液，混合后，加入HAuCl₄溶液，搅拌使其混匀，再加入没 食子酸溶液，待深棕黄色的溶液变为浅黄色后，加入所述备用的金种子，静置反应，制得的GNRs经离心后分散在超纯水中，备用；

(2)GNRs的氧化过程：取所述步骤(1)中离心后的GNRs溶液，依次加入超纯水、CTAB溶液、盐酸混匀，最后加入H₂O₂溶液，静置反应，采用紫外-可见分光光度计分析GNRs的吸收光谱随时间的变化；

(3)抗坏血酸对GNRs氧化反应的抑制作用：取所述步骤(1)中离心后的GNRs溶液，向GNRs溶液中加入AA溶液，使得反应初始时溶液中AA的浓度分别为不同的若干组，再加入超纯水使其总体积为相同，然后依次加入CTAB溶液、盐酸混匀，最后加入H₂O₂溶液，静置反应，根据GNRs的吸收光谱随时间的变化，计算氧化抑制率；

(4)抗氧化物质的抗氧化能力的测定：取所述步骤(1)中离心后的GNRs溶液，向其中加入抗氧化物质的提取液，再加入超纯水使其总体积与所述步骤(3)中各组的总体积相同，然后依次加入CTAB溶液、盐酸混匀，最后加入H₂O₂溶液开始反应，根据GNRs的吸收光谱随时间的变化，计算氧化抑制率；

其中，在所述步骤(3)中，AA对GNRs氧化过程的抑制程度用氧化抑制率来考察，其中氧化抑制率的计算公式如下公式：

其中△λ₀是无抗氧化物质存在时H₂O₂溶液与GNRs反应一段时间后GNRs的纵向吸收峰位置的变化值，△λ是有抗氧化物质存在时H₂O₂溶液与GNRs反应一段时间后GNRs的纵向吸收峰位置的变化值；

通过氧化抑制率与抗氧化物浓度之间的关系，找出氧化抑制率为50％时所对应的抗氧化物质的浓度，即IC₅₀，用来衡量抗氧化能力；

在所述步骤(4)中，通过抗氧化物质的氧化抑制率与浓度之间的关系，得出抗氧化物质的IC₅₀值，其氧化抑制率的计算采用所述公式(1)。

金纳米棒GNRs是一种棒状的金纳米颗粒，拥有平行于长轴方向(纵向)和垂直于长轴方向(径向)两个表面等离激元共振吸收峰；其中，径向表面等离子体共振模处于500nm至530nm，调谐范围小，强度弱，而纵向表面等离激元共振吸收峰随长径比变化可在520～1600nm范围内连续可调，强度远高于径向模式。当GNRs在氧化剂H₂O₂的作用下发生氧化时，棒逐渐变短，其纵向吸收峰逐渐蓝移(向短波移动)，而加入抗氧化剂可以抑制该氧化反应，抗氧化能力越强，GNRs被氧化的速率越小，其纵向吸收峰的变化越小，通过紫外-可见分光光度计可对GNRs纵向吸收峰蓝移的过程进行监控，从而实现对抗氧化能力的评价。

本发明的技术方案，通过氧化抑制率与抗氧化物AA浓度之间的关系，找出氧化抑制率为50％时所对应的抗氧化物质AA的浓度，即IC₅₀，用来衡量其他抗氧化物质的抗氧化能力，操作简便且检测灵敏度高，本发明在紫外-可见分光光度计的操作下即可完成，操作简便，不需要复杂的仪器设备。

进一步的改进在于，在所述步骤(1)中，取5.0mL 0.2mol/LCTAB溶液于烧杯中，搅拌的同时加入5.0mL 5×10^-4mol/L HAuCl₄溶液，混合均匀后，边搅拌边快速加入新配制的0℃的0.01mol/L NaBH₄溶液0.6mL，搅拌2min后置于25℃环境下2h后，得金种子备用；

取2.5mL 0.2mol/L CTAB溶液于烧杯中，加入125μL 4×10^-3mol/L AgNO₃溶液，混合后，加入2.5mL l×10^-3mol/L HAuCl₄溶液，搅拌使其混匀，再加入120μL 0.10mol/L没食子酸溶液，待深棕黄色的溶液变为浅黄色后，加入25μL金种子，27℃静置反应，制得的GNRs经离心后分散在超纯水中，备用；

在所述步骤(2)中，取离心后的GNRs溶液300μL，依次加入600μL超纯水、900μL 0.2mol/L的CTAB溶液、10μL 3mol/L的盐酸混匀，最后加入800μL 1.26mol/L的H₂O₂溶液，25℃静置反应，采用紫外-可见分光光度计分析GNRs的吸收光谱随时间的变化；

在所述步骤(3)中，向300μLGNRs溶液中加入0.2mg/mL AA溶液，使得反应初始时溶液中AA的浓度分别为0.0015mg/mL、0.0062mg/mL、0.0108mg/mL、0.0154mg/mL，再加入超纯水使其总体积为900μL，然后依次加入900μL 0.2mol/L的CTAB溶液、10μL 3mol/L的盐酸混匀，最后加入800μL 1.26mol/L的H₂O₂溶液，25℃静置反应，根据GNRs的吸收光谱随时间的变化，计算氧化抑制率；

在所述步骤(4)中，取GNRs溶液300μL，向其中加入抗氧化物质的提取液100μL，再加入超纯水使其总体积为900μL，然后依次加入900μL 0.2mol/L的CTAB溶液、10μL 3mol/L的盐酸混匀，最后加入800μL 1.26mol/L的H₂O₂溶液开始反应，根据GNRs的吸收光谱随时间的变化，计算氧化抑制率；

其中，在所述步骤(3)中，其中△λ₀是无抗氧化物质存在时H₂O₂溶液与GNRs反应45min后GNRs的纵向吸收峰位置的变化值，△λ是有抗氧化物质存在时H₂O₂溶液与GNRs反应45min后GNRs的纵向吸收峰位置的变化值。

附图说明

下面结合附图和本发明的实施方式进一步详细说明：

图1是GNRs中加入H₂O₂后每隔3分钟测得的紫外吸收光谱图；

图2是GNRs被H₂O₂氧化前(左)和氧化后(右)的透射电镜图；

图3是AA的浓度对氧化抑制率的影响示意图；

图4是GNRs氧化过程的光谱随竹叶青提取液浓度的变化图；

图5是竹叶青提取液的浓度对氧化抑制率的影响示意图；

图6是不同浓度的玫瑰存在时，H₂O₂与金纳米棒反应45min后测得的紫外-可见光谱图；

图7是不同浓度的玫瑰和氧化抑制率之间的关系图；

图8是不同浓度的薰衣草存在时，H₂O₂与金纳米棒反应45min后测得的紫外-可见光谱图；

图9是不同浓度的薰衣草和氧化抑制率之间的关系图；

图10是不同浓度的山楂存在时，H₂O₂与金纳米棒反应45min后测得的紫外-可见光谱图；

图11是不同浓度的山楂和氧化抑制率之间的关系图；

图12是不同浓度的荷叶存在时，H₂O₂与金纳米棒反应45min后测得的紫外-可见光谱图；

图13是不同浓度的荷叶和氧化抑制率之间的关系图。

具体实施方式

实施例1：

(1)GNRs的制备

取5.0mL 0.2mol/LCTAB溶液于烧杯中，搅拌的同时加入5.0mL 5×10^-4mol/L HAuCl₄溶液，混合均匀后，边搅拌边快速加入新配制的0℃的0.01mol/L NaBH₄溶液0.6mL，搅拌2min后置于25℃环境下2h后备用；

取2.5mL 0.2mol/L CTAB溶液于烧杯中，加入125μL 4×10^-3mol/L AgNO₃溶液，混合后，加入2.5mL l×10^-3mol/L HAuCl₄溶液，搅拌使其混匀，再加入120μL 0.10mol/L没食子酸溶液，待深棕黄色的溶液变为浅黄色后，加入25μL金种子，27℃静置反应，制得的GNRs经离心后分散在超纯水中用于后续实验；

(2)GNRs的氧化过程

取离心后的GNRs溶液300μL，依次加入600μL超纯水、900μL 0.2mol/L的CTAB溶液、10μL 3mol/L的盐酸混匀，最后加入800μL 1.26mol/L的H₂O₂溶液，25℃静置反应，采用分光光度计检测GNRs的吸收光谱随时间的变化，如图1、2所示；

(3)抗坏血酸对GNRs氧化反应的抑制作用

取离心后的GNRs溶液300μL，向GNRs溶液中加入0.2mg/mL AA溶液，分成4组，使得反应初始时溶液中AA的浓度分别为0.0015mg/mL、0.0062mg/mL、0.0108mg/mL、0.0154mg/mL，每组均再加入超纯水使其总体积为900μL，然后依次加入900μL 0.2mol/L的CTAB溶液、10μL 3mol/L的盐酸混匀，最后加入800μL 1.26mol/L的H₂O₂溶液，25℃静置反应，根据GNRs的吸收光谱随时间的变化，计算氧化抑制率；

其中，在所述步骤(3)中，AA对GNRs氧化过程的抑制程度用氧化抑制率来考察，其中氧化抑制率的计算公式如下公式：

其中△λ₀是无抗氧化物质存在时H₂O₂溶液与GNRs反应45min后GNRs的纵向吸收峰位置的变化值，△λ是有抗氧化物质存在时H₂O₂溶液与GNRs反应45min后GNRs的纵向吸收峰位置的变化值；

通过氧化抑制率与抗氧化物浓度之间的关系，找出氧化抑制率为50％时所对应的AA的浓度，0.0088mg/mL，即IC₅₀，用来衡量抗氧化能力；

(4)竹叶青抗氧化能力的测定

以竹叶青提取液替代上述步骤(3)试验中的AA来研究竹叶青抗氧化能力，取离心后的GNRs溶液300μL，向其中加入竹叶青提取液100μL，再加入超纯水使其总体积为900μL，然后依次加入900μL 0.2mol/L的CTAB溶液、10μL 3mol/L的盐酸混匀，最后加入800μL 1.26mol/L的H₂O₂溶液开始反应，根据GNRs的吸收光谱随时间的变化，计算氧化抑制率，如图4、5所示，找出氧化抑制率为50％时所对应的竹叶青的浓度，0.0338mg/mL，即IC₅₀；其中，图4是GNRs氧化过程的光谱随竹叶青提取液浓度的变化，图中的0表示制备出的用于检测的GNRs(氧化反应前的原料)，1-5表示GNRs在氧化反应中添加的竹叶青提取液，浓度依次是：0mg/mL，0.0202mg/mL，0.0263mg/mL，0.0324mg/mL，0.0404mg/mL。

实施例2：与实施例1不同的是，在步骤(4)中，测定的是玫瑰的抗氧化能力，计算出氧化抑制率，如图6、7所示，找出氧化抑制率为50％时所对应的玫瑰的浓度，0.0540mg/mL，即IC₅₀；其中，图6是不同浓度的玫瑰存在时，H₂O₂与金纳米棒反应45min后测得的紫外-可见光谱图，图中的0表示制备出的用于检测的GNRs(氧化反应前的原料)，1-5表示GNRs在氧化反应中添加的玫瑰提取液浓度依次是：0mg/mL，0.0149mg/mL，0.0297mg/mL，0.0520mg/mL，0.0743mg/mL。

实施例3：与实施例1不同的是，在步骤(4)中，测定的是薰衣草的抗氧化能力，计算出氧化抑制率，如图8、9所示，找出氧化抑制率为50％时所对应的薰衣草的浓度，0.0907mg/mL，即IC₅₀；其中，图8是不同浓度的薰衣草存在时，H₂O₂与金纳米棒反应45min后测得的紫外-可见光谱图，图中的0表示制备出的用于检测的GNRs(氧化反应前的原料)，1-5表示GNRs在氧化反应中添加的的薰衣草提取液浓度依次是：0mg/mL，0.0154mg/mL，0.0384mg/mL，0.0691mg/mL，0.0998mg/mL。

实施例4：与实施例1不同的是，在步骤(4)中，测定的是山楂的抗氧化能力，计算出 氧化抑制率，如图10、11所示，找出氧化抑制率为50％时所对应的山楂的浓度，0.2383mg/mL，即IC₅₀；其中，图10是不同浓度的山楂存在时，H₂O₂与金纳米棒反应45min后测得的紫外-可见光谱图，图中的0表示制备出的用于检测的GNRs(氧化反应前的原料)，1-5表示GNRs在氧化反应中添加的山楂提取液浓度依次是：0mg/mL，0.1183mg/mL，0.1736mg/mL，0.2367mg/mL，0.2628mg/mL。

实施例5：与实施例1不同的是，在步骤(4)中，测定的是荷叶的抗氧化能力，计算出氧化抑制率，如图12、13所示，找出氧化抑制率为50％时所对应的荷叶的浓度，0.2533mg/mL，即IC₅₀；其中，图12是不同浓度的荷叶存在时，H₂O₂与金纳米棒反应45min后测得的紫外-可见光谱图，图中的0表示制备出的用于检测的GNRs(氧化反应前的原料)，1-5表示GNRs在氧化反应中添加的荷叶提取液浓度依次是：0mg/mL，0.1282mg/mL，0.2015mg/mL，0.2748mg/mL，0.3664mg/mL。

通过氧化抑制率与浓度之间的关系，得出竹叶青、玫瑰、薰衣草、山楂和荷叶的IC₅₀值，为验证该方法的可靠性，采用了传统的DPPH法对上述实施例1-5中的5种花茶的抗氧化性进行了评价，如下表1。

表1花茶的抗氧化能力比较

从表1中对照结果看，两种方法得到的上述5种抗氧化物质的抗氧化能力的顺序与GNRs法是一致的，只是AA当量的数值不同，这种差异可能是由于其中所含抗氧化物质的种类、溶解性差异以及花茶中所含其他物质的协同作用等共同影响所造成的，但这也反应出GNRs法在评价花茶抗氧化能力方面的是可行的。

上面结合测试数据对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方 式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化；如针对竹叶青、玫瑰、薰衣草、山楂和荷叶之外的其他抗氧化物质的抗氧化能力进行评价，知晓其抗氧化能力的强弱。