一种基于二氧化硅包覆金纳米三角的表面增强拉曼真菌毒素检测方法与流程

本发明涉及到食品安全、材料化学等技术领域，具体涉及到一种基于二氧化硅包覆金纳米三角的表面增强拉曼真菌毒素检测方法。

背景技术：

真菌毒素(mycotoxin)是真菌生长产生的次级代谢产物，花生等谷物食品由于其储存方式不当、加工过程中(包括干燥、加工、储藏过程)特别容易受黄曲霉毒素的污染，具有潜在的致肝癌、胃癌、肾癌的可能性。目前常规的用于真菌毒素检测的方法，主要有生物鉴定法，但此方法只能用于定性检测，专一性不强，灵敏度低；化学分析法(薄层层析法)，其精密度差，难以在实际中应用；仪器法(气相色谱法、液相色谱法、气质联用法、液质联用法)，其前处理复杂，仪器昂贵；免疫分析法(酶联免疫吸附法，免疫荧光技术，放射免疫测定法等)，其存在一定的假阳性。所以急需建立一种灵敏度高，稳定性强，操作简单的检测方法。

表面增强拉曼散射是拉曼散射的延伸和发展，具有表面增强拉曼效应的基底材料(金、银、铜和一些过渡金属)与被测物质接触时其产生的电磁场会增强被测物质的拉曼信号，从而达到检测的目的。因此，表面增强拉曼效应的强弱与基底材料的结构、形状、尺寸以及与被测物的结合方式有很大的关系。表面增强拉曼光谱技术已经应用于农药、抗生素、细菌等痕量物质的检测，但在真菌毒素检测方面的研究相对较少，且基底材料的种类单一，检测灵敏度低，信号稳定性差，检测限需要进一步的提高。

单金属增强基底与金属、二氧化硅、四氧化三铁、石墨烯等复合在一起可以组成具有特定化学特性和拉曼特性的核壳形增强基底，相对于单金属增强基底其拉曼增强效应更显著。金纳米三角与其它形貌的金纳米材料相比，由于其具有尖锐的边角，因此具有更好的等离子增强效应，拉曼增强效果相对于金纳米颗粒更显著；银具有很好的等离子增强效应，作为金纳米三角的外壳，能显著提高纳米三角的拉曼增强效果。dtnb作为一种没有荧光干扰和具有大散射截面的分子，作为拉曼信号分子标记于金银纳米三角壳层中间，能显著提高拉曼信号的稳定性。适配体的特异性和磁性材料的分离聚集作用可以拉近增强基底和待测物距离，进一步提高拉曼信号的强度和稳定性。因此，本专利制备了真菌毒素适配体修饰的金纳米三角为内核的dtnb标记的金@dtnb@银核壳纳米三角和壳聚糖四氧化三铁(cs-fe3o4)磁性材料，构建了三明治结构的检测体系，大大提高了拉曼信号的强度和稳定性，成功应用于真菌毒素的超灵敏定量检测。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于二氧化硅包覆金纳米三角的表面增强拉曼真菌毒素检测方法，该方法对真菌毒素的检测稳定性好，灵敏度高。适用于食品安全、材料化学等技术领域。

本发明的技术方案包括：

金纳米三角为内核的真菌毒素适配体修饰的金@dtnb@二氧化硅核壳纳米三角的制备,真菌毒素适配体修饰的壳聚糖四氧化三铁(cs-fe3o4)磁性材料的制备,真菌毒素表面增强拉曼光谱检测体系的构建以及标准曲线的建立；步骤为：

步骤1)金@dtnb@二氧化硅核壳纳米三角的制备：采用三步种子生长法制得金纳米三角，将10ml上述制备的金纳米三角溶液在6000rpm、20min条件下离心两次，用去离子水清洗，除去过量的ctac溶液，沉淀重新分散到10ml去离子水中，向上述溶液中加入20ul，0.01mol/l的5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)乙醇溶液，室温下磁力搅拌2h；离心去除未连接的5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)，重新分散到相同体积的去离子水中；将200μl,1mm的aptms逐滴加入混合溶液中，反应15min后，将质量分数为1ml0.54％的硅酸钠加入溶液中，在90℃水浴环境下磁力搅拌30min，得到增强基底待用；

步骤2)真菌毒素核酸适配体链修饰的金@dtnb@二氧化硅核壳纳米三角的制备：将上述步骤1)制备的金@dtnb@二氧化硅核壳纳米三角冷却后加入100μl、1mm的aptms，搅拌15min，离心分离后沉淀用乙醇和乙腈分别清洗三次，随后与溶解在乙腈溶剂中的0.6ml，0.2m三聚氯氰连续搅拌反应4h；此后，将产物进行离心，弃上层液体，获得的沉淀用乙腈、超纯水、硼酸盐缓冲液(bbs)分别清洗3次，沉淀重新分散在5ml，ph＝8.4的bbs溶液中，将10μl，100um的核酸适配体链的bbs溶液加入其中，室温下孵育12h；

步骤3)壳聚糖四氧化三铁(cs-fe3o4)磁性材料的制备：0.82g三氯化铁强烈搅拌下溶于40ml乙二醇中，强烈搅拌直至溶液变澄清，3.6g无水醋酸钠和0.5g壳聚糖，在连续搅拌条件下加入上述溶液，搅拌持续30min，反应结束后溶液转移到50ml聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，发应釜放在200℃恒温箱里反应12h，反应结束，冷却到室温，磁分离，乙醇清洗三次，60℃恒温箱干燥5h，产物密封放在4℃冰箱备用；

步骤4)真菌毒素核酸适配体链修饰的壳聚糖四氧化三铁(cs-fe3o4)磁性材料的制备：1mg上述步骤3)合成的壳聚糖四氧化三铁磁性材料超声分散在0.5ml，5％的戊二醛溶液中，0.5ml，5um的氨基修饰的真菌毒素适配体链的pbs溶液加入上述混合溶液，室温孵育4h，反应结束后加入牛血清蛋白(bsa)溶液封闭磁性材料上未连接的活性位点，上述溶液用2ml水和2ml，tris-hcl缓冲溶液清洗，最终分散在1ml,tris-hcl缓冲溶液中，备用；

步骤5)表面增强拉曼检测体系的构建：在上述合成的真菌毒素适配体修饰的壳聚糖四氧化三铁磁性材料100μl中加入100μl不同浓度的真菌毒素(0.0,0.001,0.01,0.1,1.0,10.0,100,1000ng/ml)，室温下孵育2h，反应结束后，加入上述合成的真菌毒素适配体链修饰的金@dtnb@银核壳纳米三角溶液200μl，充分混合后室温下孵育6h，磁分离去除上清液，沉淀重新分散到100μl、tris-hcl缓冲溶液中。用拉曼光谱仪在780nm激光激发下采集不同浓度真菌毒素组装体系的拉曼信号，从而建立组装体拉曼信号强度和对应真菌毒素浓度间的标准曲线。

与现有的技术相比，本发明的优点在于：

1.本发明通过标记dtnb信号分子于金@银核壳纳米棒壳层中间，增强拉曼信号稳定性，利用金银纳米棒的强拉曼增强效果，以及适配体的特异性识别作用，磁性材料的分离富集作用，构建了一种真菌毒素定量检测的超灵敏检测方法，同时为其它真菌毒素的检测提供了一种检测体系的参考。

2.本发明所制备的金纳米三角，采用三步金种子生长法制得边长为100±10nm，通过在种子溶液和生长溶液中快速加入碘化钠来增加金纳米三角的产率。

3.本发明所制备的金纳米三角，将不同体积的金种子溶液1(200μl，400μl，600μl，800μl，1200μl)加入到金种子溶液2中(10ml)，最终制得不同尺寸的金纳米三角，对制得的金纳米三角溶液进行紫外和透射电镜表征。

4.本发明所制备的金@dtnb@二氧化硅核壳纳米三角，将二氧化硅包覆在金纳米三角外，使增强剂更容易与适配体连接，同时，可以有效的防止dtnb信号分子受外界环境的干扰，信号更加稳定。

5.本发明所制备的金@dtnb@二氧化硅核壳纳米三角，dtnb标记分子标记金纳米三角的最佳标记浓度为2mm，超声1h能够增加标记分子的连接。

6.本发明制备的的壳聚糖修饰的四氧化三铁磁性材料，其具有超顺磁性和很好的水溶性，保证了磁性材料对真菌毒素的分离和富集。

附图说明

图1为加入不同体积金种子溶液1所对应的金纳米三角紫外表征图；

图2为不同浓度黄曲霉度b1检测的表面增强拉曼光谱图；

图3为不同浓度黄曲霉毒素b1检测的散点图(a)和标准曲线图(b)。

具体实施方式

实施实例1

为了进一步验证本发明所制备检测方法对食品中真菌毒素检测的灵敏性，本发明实例，以黄曲霉毒素b1为例，具体操作步骤如下：

步骤1)金纳米三角的制备：采用三步金种子诱导法合成金纳米三角，具体的：

金种子溶液1：

25μl、0.05m的haucl4溶液加入到4.7ml、0.1m的ctac溶液中，强烈搅拌条件下加入300μl新鲜制备的0.01m的nabh4溶液中，将其放在室温下3h除去过量的nabh4；

金种子溶液2：

1.6ml、0.1m的ctac溶液用8ml的超纯水稀释，加入40μl、0.05m的haucl4溶液，快速加入0.01m、15μl的碘化钠溶液；

生长溶液：1ml、0.05m的haucl4溶液加入到80ml，0.05m的ctac溶液中，快速加入0.01m，600μl的碘化钠溶液；

种子溶液生长：将金种子溶液1用0.1m的ctac溶液稀释10倍，40μl，0.1m的aa和800μl，0.1m的抗坏血酸分别加入到金种子溶液2和生长溶液中，将不同体积上述稀释的金种子溶液1加入到金种子溶液2，快速摇匀，将6.4ml快速加入到生长溶液中，手动搅拌几秒，室温放置1h；

金纳米三角的纯化：40ml上述合成的金三角溶液加入6ml、25wt％的ctac溶液，室温下反12h，去除上清液，沉淀重新分散在10ml、0.1m的ctac溶液中，得到纯化后的金纳米三角溶液，如图1为加入不同体积金种子溶液1所对应的金纳米三角紫外表征图；

步骤2)金@dtnb@二氧化硅核壳纳米三角的制备：采用三步种子生长法制得金纳米三角，将10ml上述步骤1)制备的金纳米三角溶液在6000rpm、20min条件下离心两次，用去离子水清洗，除去过量的ctac溶液，沉淀重新分散到10ml去离子水中，然后向上述溶液中加入20ul、0.01mol/l的dtnb乙醇溶液，室温下磁力搅拌2h；离心去除未连接的dtnb，重新分散到相同体积的去离子水中；将200μl、1mm的aptms逐滴加入混合溶液中，反应15min后，将1ml0.54％(w/w)的硅酸钠加入溶液中，在90℃水浴环境下磁力搅拌30min，得到增强基底待用。

步骤3)afb1核酸适配体链修饰的金@dtnb@二氧化硅核壳纳米三角的制备：将上述步骤2)制备的金@dtnb@二氧化硅核壳纳米三角冷却后加入100μl、1mm的aptms，搅拌15min，离心分离后沉淀用乙醇和乙腈分别清洗三次，随后与溶解在乙腈溶剂中的0.6ml、0.2m三聚氯氰连续搅拌反应4h；此后，将产物进行离心，弃上层液体，获得的沉淀用乙腈、超纯水、硼酸盐缓冲液(bbs)分别清洗3次，沉淀重新分散在5ml，ph＝8.4的bbs溶液中，将10μl，100um的afb1核酸适配体链的bbs溶液加入其中，室温下孵育12h。

氨基修饰的afb1适配体链：5’-nh2-gttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggccc-3’；

步骤4)壳聚糖四氧化三铁(cs-fe3o4)磁性材料的制备：0.82g三氯化铁强烈搅拌下溶于40ml乙二醇中，强烈搅拌直至溶液变澄清，3.6g无水醋酸钠和0.5g壳聚糖，在连续搅拌条件下加入上述溶液，搅拌持续30min，反应结束后溶液转移到50ml聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，发应釜放在200℃恒温箱里反应12h，反应结束，冷却到室温，磁分离，乙醇清洗三次，60℃恒温箱干燥5h，产物密封放在4℃冰箱备用。

步骤5)afb1核酸适配体链修饰的壳聚糖四氧化三铁(cs-fe3o4)磁性材料的制备：1mg上述步骤4)合成的cs-fe3o4磁性材料超声分散在0.5ml、5％的戊二醛溶液中，0.5ml、5um的氨基修饰的afb1适配体链的pbs溶液加入上述混合溶液，室温孵育4h，反应结束后加入加入牛血清蛋白(bsa)溶液封闭磁性材料上未连接的活性位点，上述溶液用2ml水和2ml,tris-hcl缓冲溶液清洗，最终分散在1ml,tris-hcl缓冲溶液中，备用。

氨基修饰的afb1适配体链：5’-gttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggccc-nh2-3’；

步骤6)表面增强拉曼检测体系的构建：在上述步骤5)合成的afb1适配体修饰的cs-fe3o4磁性材料100μl中加入100μl不同浓度的afb1(0.0，0.001，0.01，0.1，1.0，10.0，100，1000ng/ml)，室温下孵育2h，反应结束后，加入上述合成的afb1适配体链修饰的金@dtnb@银核壳纳米三角溶液200μl，充分混合后室温下孵育6h，磁分离去除上清液，沉淀重新分散到100μl，tris-hcl缓冲溶液中。用拉曼光谱仪在780nm激光激发下采集不同浓度真菌毒素组装体系的拉曼信号，从而建立组装体拉曼信号强度和对应afb1浓度间的标准曲线，如图2为不同浓度黄曲霉度b1检测的表面增强拉曼光谱图；如图3为不同浓度黄曲霉毒素b1检测的散点图(a)和标准曲线图(b)。

综上，本发明制备的一种基于二氧化硅包覆金纳米三角的表面增强拉曼真菌毒素检测方法，合成了具有良好生物相容性和稳定拉曼信号的二氧化硅包覆金纳米三角的表面拉曼增强剂，同时，合成了超顺磁性壳聚糖四氧化三铁(cs-fe3o4)磁性材料，在增强剂和磁性材料上修饰真菌毒素适配体链，当检测体系中有真菌毒素存在时，增强剂和磁性材料会通过适配体的特异性识别作用结合在一起，随着真菌毒素浓度的改变，磁性分离后，检测体系的拉曼信号强度改变，实现食品中真菌毒素的定量检测的目的；该方法适用于食品安全、材料化学等技术领域。

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

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