一种基于受体配体结合技术筛查吸食吗啡的试剂、制备方法及应用与流程

本发明涉及的是一种新型试纸快速筛查可疑人员是否吸食吗啡的方法，特别涉及一种基于受体配体结合技术筛查吸食吗啡的试剂、制备方法及应用。

背景技术：

吗啡(Morphine，MOP)是鸦片类毒品的重要组成部分，1806年法国化学家泽尔蒂纳首次将其从鸦片中分离出来。其衍生物盐酸吗啡是临床上常用的麻醉剂，有极强的镇痛作用，多用于创伤、手术、烧伤等引起的剧痛，也用于心肌梗死引起的心绞痛，还可作为镇痛、镇咳和止泻剂等，但其最大缺点是易成瘾。这使得长期吸食者无论从身体上还是心理上都会对吗啡产生严重的依赖性，造成严重的毒物癖，从而对自身和社会均造成极大的危害。分子式为C17H19NO3，分子量285，学名： 17-甲基-4，5α-环氧-7，8-二脱氢吗啡喃-3，6α-二醇。

阿片受体属于GPCR蛋白家族成员，体内至少存在8种亚型，在中枢神经系统内至少存在4种亚型:μ、κ、δ、σ。吗啡类药物对不同型的阿片受体，亲和力和内在活性均不完全相同，每一种受体都有不同亚型。吗啡是μ、κ、δ三种受体的激动剂，对三受体亚型的作用强度依次减弱。

传统方法是通过抗原抗体结合技术实现的，抗体生产程序复杂，成本较高，小分子化合物抗体亲和力和对不同亚型选择性也不如受体配体。

技术实现要素：

针对现有技术不足,本发明的目的是提供一种基于受体配体结合技术方法筛查吸食吗啡人员的方法，具有灵敏度更高（10-100倍），生产成本更低（降低成本30%以上）的优势。为此，本发明提供以下技术方案；

一种基于受体配体结合技术筛查吸食吗啡的试剂，该试剂的蛋白序列如序列表SEQ NO.1所示；该试剂是对阿皮受体改造所得，针对原始序列分别对第138位和386位氨基酸做点突变，以增强受体与配体亲和力。通过免疫荧光方法确定138位突变的蛋白活力最好（IC50小于10nM），满足产品研发要求。

SEQ NO.1：

1 mdssaaptna snctdalays scspapspgs wvnlshldgn lsdpcgpnrt dlggrdslcp

61 ptgspsmita itimalysiv cvvglfgnfl vmyvivrytk mktatniyif nlaladalat

121 stlpfqsvny lmgtwpfmti lckivisidy ynmftsiftl ctmsvdryia vchpvkaldf

181 rtprnakiin vcnwilssai glpvmfmatt kyrqgsidct ltfshptwyw enllkicvfi

241 fafimpvlii tvcyglmilr lksvrmlsgs kekdrnlrri trmvlvvvav fivcwtpihi

301 yviikalvti pettfqtvsw hfcialgytn sclnpvlyaf ldenfkrcfr efciptssni

361 eqqnstrirq ntrdhpstan tvdrtnhqle nleaetaplp。

一种基于受体配体结合技术筛查吸食吗啡的试剂盒，所述试剂盒包括采用所述的试剂制备成的阿片受体结合物垫，所述阿片受体结合物垫与硝酸纤维膜和吸样垫装配成反应板，该反应板切成试剂条并装卡。

本发明还包括以下方法：一种基于受体配体结合技术筛查吸食吗啡的试剂的制备方法，包括以下步骤：

1）构建阿片受体表达系统：

1.1）双酶切，将分别将原始序列，138和386突变克隆入PET32表达载体。

1.2）转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。

1.3）将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种，表达菌株如Bl21（DE3）蛋白的诱导表达。

1.3.1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。

1.3.2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。

1.3.3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。

1.3.4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速（140-180rpm），诱导过夜作为包涵体检测样品。

2）表达138位突变阿片受体：

2.1）取保种的表达菌株先摇10ml，37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右，视菌种的活性而异，也可过夜摇菌。

2.2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度，250rpm摇至OD= 1.0左右（约2.5h~3h），然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度）。过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18°左右），转速140rpm左右。

2.2.1）将菌液6000rpm，4min，4度离心收集菌体。加入20mM PBS，洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用4支50ml的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。

2.3）对上一步的产物进行超声波裂解，用6mm变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。

2.4）取超声波裂解后的产物上清。将破碎好的溶液收集到50ml离心管中，10000rpm，15min，4°离心。沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。（此时可以测量一下pH值，pH值最好在7.5左右，平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就会在7.5左右。）

2.5）纯化上清---摸洗脱条件。

2.5.1）镍柱处理。将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。

2.5.2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。（若是流速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml的枪将胶体吹散。）取20μl过柱后的样品，以备跑胶。

2.5.3）分别加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。每个梯度分别的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中，以备跑胶。

2.5.4）加洗脱缓冲液（洗脱缓冲液）将目的蛋白洗脱。上样量为4.5ml（将前面的0.5ml单独接入EP管，再将后面的4ml接入另外两个EP管），留跑胶样品。

2.6）跑胶验证。

2.6.1）跑2块0.75mm的PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）胶，把所有的样品都加上去，两块胶的浓分离比要相同两块胶才会比较一致。

2.6.2）跑胶顺序：负对照、正对照、上清、过柱样品，300V快速压胶5min左右，160V分离样品50min左右。（也可以300V,30min，只是图没有160V好看。）

2.6.3）考马斯亮蓝染色。一般染色2h即可。

2.6.4）脱色。先用脱色剂1脱15min，再用脱色剂2脱过夜。

2.7）纯化上清---收集目的蛋白

2.7.1）将重生的镍柱再次平衡（即加对消洗脱液Equilibration Buffer 3ml）。

2.7.2）重复步骤12中的操作，只是清洗时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。

2.8）再次跑胶验证并保存；这次胶图用160V，保存好。

2.9）透析。

2.9.1）配制2L透析液（配方见附件1），并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。

2.9.2）透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸10min，用MILIQ H₂O充分洗净。

2.9.3）用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢），将洗脱的蛋白样品加入其中，置入提前预冷的500ml透析液（20mM PBS+50 mM NaCl）中。冰浴下轻微磁力搅拌20min后置入4°冰箱1.5h后换液。透析3次即可。

2.10）浓缩。

2.10.1）将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中，用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。

2.10.2）30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除，加入新的固体聚乙二醇。

2.10.3）每隔10min观察一次，一旦出现浑浊立即停止浓缩。

2.10.4）透析袋用完后，洗净，保存于20%乙醇中4°存放。

2.11）超滤法浓缩、透析蛋白。

2.11.1）将4ml对消洗脱得到的蛋白溶液加入超滤管中。

2.12）配平。

2.12.1）7400g，30min，4°离心，结束时4ml变为1ml左右。浓缩4倍。可根据需要选择不同的离心时间，以达到不同的浓缩倍数。可以几次的洗脱液（Elution）一起浓缩。

2.11.2）加入需要的蛋白储存液至4ml，离心。重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋白储存液。蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或适当浓度和pH的三（羟甲基）氨基甲烷（tris-HCl）溶液。如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油（1%-5%即可）助溶。

2.13）收集。将溶液从超滤管中收集到EP管中，标记好储存液的成分，蛋白名称，蛋白浓度（测量后），及制备日期。

3）制备阿片受体胶体金垫。

3.1）受体金标处理：通过还原法制备40 nm-50 nm左右的胶体金溶液，颜色变得鲜红清亮后分别三份进行实验，第一份用0.1 mol/L K2CO3调PH为8.0，第二份调PH为8.5，第三份调PH为9.0。然后在溶液中分别加入1 mg、1.5 mg、2.0 mg阿片受体，缓慢逐滴加入，继续搅拌35分钟后，再加入终浓度为3%的BSA和终浓度为1%的TWEEN20继续搅拌10分钟，然后4 ℃，12000 rpm离心45分钟，小心吸取上清弃去；用胶体金溶液重新定容至100ml，按1ml溶液铺30 cm2的比例均匀铺在玻璃纤维或无纺布上，置于干燥间，37 ℃，湿度25%条件下干燥3小时，制成胶体金垫。

3.2）样品垫的处理：将玻璃纤维或无纺布浸泡于50 ml 0.01 mol/L PH=7.4的磷酸盐缓冲液中（含终浓度3% BSA, 0.05%的TWEEN20）中1小时，37 ℃烘干，真空封装，4℃保存备用。

3.3）吗啡包被：用碳酸盐缓冲液和终浓度为3%的BSA混合液将吗啡溶液稀释到0.5mg/ml、1mg/ml和1.5mg/ml，用点膜机将包被液划到硝酸纤维膜上，37℃干燥4小时，4℃保存备用。

3.4）切割装配：

将上样垫、胶体金标记的阿片受体结合物垫、吗啡的硝酸纤维膜、吸样垫装配成反应板，用切条机切成4mm试剂条，进行装卡后，装入铝箔袋制成成品。

检测方法和结果判断：取50ul-100ul左右待测尿液或唾液在上样垫上，反应大约1分钟左右，根据颜色反应用肉眼直接观测结果，T线和C线同时显色说明样品中不含吗啡，如果只有C线显色说明样品中含有吗啡，如果C线没出现说明产品检测无效。

参数确定：根据最后检测结果显示，试剂纸最近标记PH约为9.0；阿片受体胶体金标记抗体最佳量1.5 mg/100 ml胶体金溶液，吗啡的最佳标记量为1 mg/ml，最佳的胶体金工作液为PH为9.0的含0.01%的氯金酸和1%柠檬酸钠水溶液，并加入了3% BSA和1% TWEEN20，检定最佳时间为30秒。

人体只要吸食过吗啡，吗啡就会通过胃肠道或者血液循环进入人体，而吗啡的化学物质就会残留在人体内一段时间，并且吗啡的原化学物质或者其代谢产物就会在吗啡吸食人员的唾液中或者尿液中呈现。根据这个特点，吸毒人员测定系列可以通过检测人员的唾液或者尿液准确的检测出是否在一定时间内曾经吸食过某种类型的吗啡。例如：人体一旦吸食过吗啡，在之后的24小时内，此人的尿液中将会持续呈现吗啡残留，只要本项目的吸毒人员测定系列中吗啡检测呈阳性，即可判定此人在24小时内有吸食吗啡的行为。

同时，医疗卫生防疫部门、以及其他体检筛查，例如兵役人员的检测以及出入境人员检查，也可以应用本项目的吗啡吸食人员的测定系列。

采用本发明技术方案，本发明的有益效果为:本发明运用受体配体结合，选择性好，生产成本较低。有利于公安部门、禁毒机构对可疑人群的筛查中，及时鉴别吸毒人员，从而为公安部门、禁毒机构的禁毒行动争取到重要的时间。

因为操作和检测无需任何专业人士的参与，并且具有快速、便于携带的特点，本系列产品亦可应用于在戒毒机构的治疗监控，以及无毒社区的建设过程中。

附图说明

图1为本发明克隆鉴定核算电泳图。

图2为本发明不同突变蛋白结合活力比较。

图3为本发明快速蛋白液相色谱（FPLC）蛋白纯化紫外吸收图。

具体实施方式

如图所示，一种基于受体配体结合技术筛查吸食吗啡的试剂盒，所述试剂盒包括采用所述的试剂制备成的阿片受体结合物垫，所述阿片受体结合物垫与硝酸纤维膜和吸样垫装配成反应板，该反应板切成试剂条并装卡。

1）构建阿片受体表达系统：

1.1）双酶切，将分别将原始序列，138和386突变克隆入PET32表达载体。

1.2）转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。

1.3）将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种，表达菌株如Bl21（DE3）蛋白的诱导表达。

1.3.1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG（异丙基硫代半乳糖苷)，浓度梯度从25μM到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。

1.3.2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。

1.3.3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。

1.3.4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速（140-180rpm），诱导过夜作为包涵体检测样品。

2）表达138位突变阿片受体：

2.1））取保种的表达菌株先摇10ml，37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右，视菌种的活性而异，也可过夜摇菌。

2.2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度，250rpm摇至OD= 1.0左右（约2.5h~3h），然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度）。过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18°左右），转速140rpm左右。

2.2.1）将菌液6000rpm，4min，4度离心收集菌体。加入20mM PBS，洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用4支50ml的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。

2.3）对上一步的产物进行超声波裂解，用6mm变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。

2.4）取超声波裂解后的产物上清。将破碎好的溶液收集到50ml离心管中，10000rpm，15min，4°离心。沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。（此时可以测量一下pH值，pH值最好在7.5左右，平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就会在7.5左右。）

2.5）纯化上清---摸洗脱条件。

2.5.1）镍柱处理。将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。

2.5.2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。（若是流速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml的枪将胶体吹散。）取20μl过柱后的样品，以备跑胶。

2.5.3）分别加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。每个梯度分别的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中，以备跑胶。

2.5.4）加洗脱缓冲液（洗脱缓冲液）将目的蛋白洗脱。上样量为4.5ml（将前面的0.5ml单独接入EP管，再将后面的4ml接入另外两个EP管），留跑胶样品。

2.6）跑胶验证。

2.6.1）跑2块0.75mm的PAGE胶，把所有的样品都加上去，两块胶的浓分离比要相同两块胶才会比较一致。

2.6.2）跑胶顺序：负对照、正对照、上清、过柱样品，300V快速压胶5min左右，160V分离样品50min左右。（也可以300V,30min，只是图没有160V好看。）

2.6.3）考马斯亮蓝染色。一般染色2h即可。

2.6.4）脱色。先用脱色剂1脱15min，再用脱色剂2脱过夜。

2.7）纯化上清---收集目的蛋白

2.7.1）将重生的镍柱再次平衡（即加Equilibration Buffer 3ml）。

2.7.2）重复步骤12中的操作，只是清洗时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。

2.8）再次跑胶验证并保存；这次胶图用160V，保存好。

2.9）透析。

2.9.1）配制2L透析液（配方见附件1），并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。

2.9.2）透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸10min，用MILIQ H₂O充分洗净。

2.9.3）用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢），将洗脱的蛋白样品加入其中，置入提前预冷的500ml透析液（20mM PBS+50 mM NaCl）中。冰浴下轻微磁力搅拌20min后置入4°冰箱1.5h后换液。透析3次即可。

2.10）浓缩。

2.10.1）将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中，用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。

2.10.2）30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除，加入新的固体聚乙二醇。

2.10.3）每隔10min观察一次，一旦出现浑浊立即停止浓缩。

2.10.4）透析袋用完后，洗净，保存于20%乙醇中4°存放。

2.11）超滤法浓缩、透析蛋白。

2.11.1）将4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超滤管中。

2.12）配平。

2.12.1）7400g，30min，4°离心，结束时4ml变为1ml左右。浓缩4倍。可根据需要选择不同的离心时间，以达到不同的浓缩倍数。可以几次的洗脱夜（Elution）一起浓缩。

2.11.2）加入需要的蛋白储存液至4ml，离心。重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋白储存液。蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或适当浓度和pH的三（羟甲基）氨基甲烷（tris-HCl）溶液。如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油（1%-5%即可）助溶。

2.13）收集。将溶液从超滤管中收集到EP管中，标记好储存液的成分，蛋白名称，蛋白浓度（测量后），及制备日期。

3）制备阿片受体胶体金垫。

3.1）受体金标处理：通过还原法制备40 nm-50 nm左右的胶体金溶液，颜色变得鲜红清亮后分别三份进行实验，第一份用0.1 mol/L K2CO3调PH为8.0，第二份调PH为8.5，第三份调PH为9.0。然后在溶液中分别加入1 mg、1.5 mg、2.0 mg阿片受体，缓慢逐滴加入，继续搅拌35分钟后，再加入终浓度为3%的BSA和终浓度为1%的TWEEN20继续搅拌10分钟，然后4 ℃，12000 rpm离心45分钟，小心吸取上清弃去；用胶体金溶液重新定容至100ml，按1ml溶液铺30 cm2的比例均匀铺在玻璃纤维或无纺布上，置于干燥间，37 ℃，湿度25%条件下干燥3小时，制成胶体金垫。

3.2）样品垫的处理：将玻璃纤维或无纺布浸泡于50 ml 0.01 mol/L PH=7.4的磷酸盐缓冲液中（含终浓度3% BSA, 0.05%的TWEEN20）中1小时，37 ℃烘干，真空封装，4℃保存备用。

3.3）吗啡包被：用碳酸盐缓冲液和终浓度为3%的BSA混合液将吗啡溶液稀释到0.5mg/ml、1mg/ml和1.5mg/ml，用点膜机将包被液划到硝酸纤维膜上，37℃干燥4小时，4℃保存备用。

3.4）切割装配：

将上样垫、胶体金标记的阿片受体结合物垫、吗啡的硝酸纤维膜、吸样垫装配成反应板，用切条机切成4mm试剂条，进行装卡后，装入铝箔袋制成成品。

检测方法和结果判断：取50ul-100ul左右待测尿液或唾液在上样垫上，反应大约1分钟左右，根据颜色反应用肉眼直接观测结果，T线和C线同时显色说明样品中不含吗啡，如果只有C线显色说明样品中含有吗啡，如果C线没出现说明产品检测无效。

参数确定：根据最后检测结果显示，试剂纸最近标记PH约为9.0；阿片受体胶体金标记抗体最佳量1.5 mg/100 ml胶体金溶液，吗啡的最佳标记量为1 mg/ml，最佳的胶体金工作液为PH为9.0的含0.01%的氯金酸和1%柠檬酸钠水溶液，并加入了3% BSA和1% TWEEN20，检定最佳时间为30秒。

人体只要吸食过吗啡，吗啡就会通过胃肠道或者血液循环进入人体，而吗啡的化学物质就会残留在人体内一段时间，并且吗啡的原化学物质或者其代谢产物就会在吗啡吸食人员的唾液中或者尿液中呈现。根据这个特点，吸毒人员测定系列可以通过检测人员的唾液或者尿液准确的检测出是否在一定时间内曾经吸食过某种类型的吗啡。例如：人体一旦吸食过吗啡，在之后的24小时内，此人的尿液中将会持续呈现吗啡残留，只要本项目的吸毒人员测定系列中吗啡检测呈阳性，即可判定此人在24小时内有吸食吗啡的行为。

同时，医疗卫生防疫部门、以及其他体检筛查，例如兵役人员的检测以及出入境人员检查，也可以应用本项目的吗啡吸食人员的测定系列。

SEQUENCE LISTING

<110> 绍兴康知生物科技有限公司

<120> 一种基于受体配体结合技术筛查吸食吗啡的试剂、制备方法及应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 400

<212> PRT

<213> Human adenovirus type 1

<400> 1

Met Asp Ser Ser Ala Ala Pro Thr Asn Ala Ser Asn Cys Thr Asp Ala

1 5 10 15

Leu Ala Tyr Ser Ser Cys Ser Pro Ala Pro Ser Pro Gly Ser Trp Val

20 25 30

Asn Leu Ser His Leu Asp Gly Asn Leu Ser Asp Pro Cys Gly Pro Asn

35 40 45

Arg Thr Asp Leu Gly Gly Arg Asp Ser Leu Cys Pro Pro Thr Gly Ser

50 55 60

Pro Ser Met Ile Thr Ala Ile Thr Ile Met Ala Leu Tyr Ser Ile Val

65 70 75 80

Cys Val Val Gly Leu Phe Gly Asn Phe Leu Val Met Tyr Val Ile Val

85 90 95

Arg Tyr Thr Lys Met Lys Thr Ala Thr Asn Ile Tyr Ile Phe Asn Leu

100 105 110

Ala Leu Ala Asp Ala Leu Ala Thr Ser Thr Leu Pro Phe Gln Ser Val

115 120 125

Asn Tyr Leu Met Gly Thr Trp Pro Phe Met Thr Ile Leu Cys Lys Ile

130 135 140

Val Ile Ser Ile Asp Tyr Tyr Asn Met Phe Thr Ser Ile Phe Thr Leu

145 150 155 160

Cys Thr Met Ser Val Asp Arg Tyr Ile Ala Val Cys His Pro Val Lys

165 170 175

Ala Leu Asp Phe Arg Thr Pro Arg Asn Ala Lys Ile Ile Asn Val Cys

180 185 190

Asn Trp Ile Leu Ser Ser Ala Ile Gly Leu Pro Val Met Phe Met Ala

195 200 205

Thr Thr Lys Tyr Arg Gln Gly Ser Ile Asp Cys Thr Leu Thr Phe Ser

210 215 220

His Pro Thr Trp Tyr Trp Glu Asn Leu Leu Lys Ile Cys Val Phe Ile

225 230 235 240

Phe Ala Phe Ile Met Pro Val Leu Ile Ile Thr Val Cys Tyr Gly Leu

245 250 255

Met Ile Leu Arg Leu Lys Ser Val Arg Met Leu Ser Gly Ser Lys Glu

260 265 270

Lys Asp Arg Asn Leu Arg Arg Ile Thr Arg Met Val Leu Val Val Val

275 280 285

Ala Val Phe Ile Val Cys Trp Thr Pro Ile His Ile Tyr Val Ile Ile

290 295 300

Lys Ala Leu Val Thr Ile Pro Glu Thr Thr Phe Gln Thr Val Ser Trp

305 310 315 320

His Phe Cys Ile Ala Leu Gly Tyr Thr Asn Ser Cys Leu Asn Pro Val

325 330 335

Leu Tyr Ala Phe Leu Asp Glu Asn Phe Lys Arg Cys Phe Arg Glu Phe

340 345 350

Cys Ile Pro Thr Ser Ser Asn Ile Glu Gln Gln Asn Ser Thr Arg Ile

355 360 365

Arg Gln Asn Thr Arg Asp His Pro Ser Thr Ala Asn Thr Val Asp Arg

370 375 380

Thr Asn His Gln Leu Glu Asn Leu Glu Ala Glu Thr Ala Pro Leu Pro

385 390 395 400