一种基于受体配体结合技术筛查吸食吗啡的试剂、制备方法及应用与流程

文档序号:12784874阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种基于受体配体结合技术筛查吸食吗啡的试剂,其特征在于:该试剂的蛋白序列如序列表SEQ NO.1所示;该试剂是对阿皮受体改造所得,针对原始序列分别对第138位和386位氨基酸做点突变。

2.一种基于受体配体结合技术筛查吸食吗啡的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括采用权利要求1所述的试剂制备成的阿片受体结合物垫,所述阿片受体结合物垫与硝酸纤维膜和吸样垫装配成反应板,该反应板切成试剂条并装卡。

3.一种基于受体配体结合技术筛查吸食吗啡的试剂的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:

1)构建阿片受体表达系统;

2)表达138位突变阿片受体;

3)制备阿片受体胶体金垫。

4.根据权利要求3所述的一种基于受体配体结合技术筛查吸食吗啡的试剂的制备方法,其特征在于:构建阿片受体表达系统的步骤包括:

1.1)双酶切,将分别将原始序列,138和386突变克隆入PET32表达载体;

1.2)转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒;

1.3)将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种,表达菌株如Bl21蛋白的诱导表达。

5.根据权利要求4所述的一种基于受体配体结合技术筛查吸食吗啡的试剂的制备方法,其特征在于:所述步骤 1.3)具体包括:

1.3.1)将表达菌株在LB培养基中摇匀,加入IPTG,诱导过夜;

1.3.2)0SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达;

1.3.3)将有表达的菌株保种,记录IPTG浓度范围;

1.3.4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导表达菌,诱导过夜作为包涵体检测样品。

6.根据权利要求3所述的一种基于受体配体结合技术筛查吸食吗啡的试剂的制备方法,其特征在于:表达138位突变阿片受体的步骤包括:

2.1)取保种的表达菌株摇菌;

2.2)将上一步中的产物加入培养基中过夜摇菌;

2.3)对上一步的产物进行超声波裂解;

2.4)取超声波裂解后的产物上清;

2.5)纯化上清---摸洗脱条件;

2.6)跑胶验证;

2.7)纯化上清---收集目的蛋白;

2.8)再次跑胶验证并保存;

2.9)透析;

2.10)浓缩;

2.11)超滤法浓缩、透析蛋白;

2.12)配平;

2.13)收集:将溶液从超滤管中收集到EP管中,标记好储存液的成分,蛋白名称,蛋白浓度(测量后),制备日期。

7.根据权利要求3所述的一种基于受体配体结合技术筛查吸食吗啡的试剂的制备方法,其特征在于:制备阿片受体胶体金垫的步骤包括:

3.1)受体金标处理:通过还原法制备胶体金溶液,分为三份进行实验,在溶液中分别逐滴加入不同质量的阿片受体,搅拌再加入BSA和TWEEN20继续搅拌,然后离心,去上清;用胶体金溶液重新定容,按一定比例均匀铺在玻璃纤维或无纺布上,干燥,制成胶体金垫;

3.2)样品垫的处理:将玻璃纤维或无纺布浸泡于磷酸盐缓冲液中中烘干,真空封装,保存备用;

3.3)吗啡包被:用碳酸盐缓冲液和BSA混合液将吗啡溶液分别稀释,用点膜机将包被液划到硝酸纤维膜上,干燥,4℃保存备用;

3.4)切割装配:将上样垫、胶体金标记的阿片受体结合物垫、吗啡的硝酸纤维膜、吸样垫装配成反应板,用切条机切成试剂条,进行装卡后,装入铝箔袋制成成品。

8.根据权利要求6所述的一种基于受体配体结合技术筛查吸食吗啡的试剂的制备方法,其特征在于:纯化上清---摸洗脱条件的具体步骤是:

(2.5.1)镍柱处理:将镍柱吸入空层析管中,待其中的液体流完后加入平衡缓冲液;

(2.5.2)将上清加到已经平衡过的NI柱上,并将过柱的样品重复上样3次,取20μl过柱后的样品,以备跑胶;

(2.5.3)分别加不同梯度的咪唑梯度来洗脱杂蛋白,每次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中,以备跑胶;

(2.5.4)加洗脱缓冲液 将目的蛋白洗脱,留跑胶样品。

9.根据权利要求6所述的一种基于受体配体结合技术筛查吸食吗啡的试剂的制备方法,其特征在于:跑胶验证的具体步骤是:

(2.6.1) 把所有的样品都分别加到上2块PAGE胶上;

(2.6.2)跑胶顺序:负对照、正对照、上清、过柱样品,压胶并分离样品;

(2.6.3)考马斯亮蓝染色;

一般染色2h即可;

(2.6.4)脱色。

10.一种基于受体配体结合技术筛查吸食吗啡的试剂的应用,其特征在于:将权利要求1-9中任一项所述的试剂用于检测人体尿液或唾液,从而确定被检测人是否吸食吗啡。

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