一种检测单胺氧化酶含量的纸基器件及其制备方法与应用与流程

本发明属于试纸快速定量检测技术领域，具体涉及一种检测单胺氧化酶含量的纸基器件及其制备方法与应用。

背景技术

纸基器件是以纸代替传统的石英、玻璃、硅、高聚物等材料，通过在纸张的表面加工出具有一定结构的微流体通道的微型分析器件，结合了微流控技术和纸的优点^]。与传统的微流控芯片相比，纸基器件具有以下优势：（1）纸来源丰富，可进行批量生产；（2）不需要外接泵，纸的主要成分是纤维素，流体在纸上通过毛细作用流动；（3）试样消耗量更低；（4）检测背景低，有利于光度法检测；（5）生物兼容性好，可通过化学修饰改变纸的性质；（6）一次性便携式分析，操作简便，甚至不需要专业的操作人员。纸基器件为临床诊断、环境监控以及食品安全分析中所需的便携式检测和现场实时监测提供了一个广阔的平台。此外，对于医护人员和医疗设备紧缺的欠发达地区，纸基器件是实现低成本即时诊断的有效工具，因其独特的优势，应用在癌症、传染病以及其他生理疾病的检测方面，引起了越来越多研究者的关注。

单胺氧化酶（mao）是人体内天然存在的一种酶，催化单胺类物质氧化脱氨反应的酶。人体内含有两种单胺氧化酶：单胺氧化酶a（mao-a）和单胺氧化酶b（mao-b）。mao-a主要分布在儿茶酚胺能神经元中；单胺氧化酶b主要分布在5-羟色胺能神经元、组胺能神经元和神经胶质细胞中，这两种亚型都均可以使单胺类神经递质失活。而mao-b的过表达均会引起一系列的疾病，例如帕金森疾病、抑郁症、幽门螺旋杆菌或者脑胶质瘤等疾病。

脑胶质瘤内部遗传易感因素与外部环境致病因素相互作用下，在细胞的遗传物质(dna)及表观遗传物质水平，发生了足以致癌的突变（以及突变的组合）；这些突变，驱动细胞持续的进入细胞周期进行有丝分裂、逃避凋亡、躲避细胞的生长接触抑制、躲避免疫抑制等，并使细胞获得与持续增长相适应的能量代谢异常、诱导肿瘤新生血管生长、缺氧与坏死等改变。在其研究过程中，研究者发现mao-a蛋白的过表达与脑胶质瘤疾病息息相关，因此mao-a蛋白作为脑胶质瘤疾病的生理病症，作为前期诊断的重要手段。

帕金森病（pd）是主要发生于中老年的一种以黑质致密部多巴胺能神经元丢失、纹状体多巴胺减少为特征的中枢神经系统退行性变性疾病，其病因和发病机制目前尚不清楚，与黑质多巴胺能神经元的减少导致多巴胺分泌减少、乙酰胆碱相对增多有关，是最常见的锥体外系疾病之一。pd的主要表现出的症状为：静止性震颤、肌张力增高、运动迟缓、姿势反射障碍等。其疾病监测指标中mao-b酶过表达，因此临床上检测mao-b酶含量可初步诊断pd疾病。

shsy5y细胞系、hepg-2细胞系和hela细胞是研究单胺氧化酶的经典细胞系，shsy5y细胞系中只含mao-a蛋白，hepg-2细胞系中只含mao-b蛋白以及hela细胞系中含有mao-a蛋白和mao-b蛋白。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测单胺氧化酶含量的纸基器及其制备方法与应用。

一种检测单胺氧化酶含量的纸基器件，包括层析纸和打印于层析纸上的微流控检测区域，所述微流控检测区域通过喷蜡打印机打印而成，所述微流控检测区域上含有单胺氧化酶的抗体，所述单胺氧化酶为单胺氧化酶a或氧化酶b；单胺氧化酶是一类含fad催化氧化单胺脱氨反应的酶，主要用于催化氧化内源性和外源性单胺类物质的代谢，调节和维持细胞内生物胺平衡。体内主要有两种同源性单胺氧化酶，单胺氧化酶a和单胺氧化酶b。

作为改进的是，所述检测区域形状为内径为8mm的圆形，边缘为亲疏水通道。

上述一种检测单胺氧化酶含量的纸基器件的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，选取表面清洁干净的层析纸，备用；

步骤2，在层析纸表面用蜡打印微流控检测区域，并将打印后的层析纸放置烘烤使得蜡渗透到背部，形成亲疏水的微流控通道；

步骤3，将经步骤2处理后的层析纸置于等离子清洗机中清洗后；

步骤4，在微流控检测区域滴加单胺氧化酶的抗体，所述单胺氧化酶为单胺氧化酶a或单胺氧化酶b，并用pbst清洗；

步骤5，在微流控检测区域中滴加牛血清蛋白，并用pbst清洗，即得检测所用抗体对应的单胺氧化酶含量的纸基器件。

作为改进的是，步骤2中烘烤温度为120℃，烘烤时间1min。

作为改进的是，步骤3中等离子清洗机的工作参数为工作电源13.56mhz，氧气功率为100w，处理时间4min。

作为改进的是，步骤4中单胺氧化酶的抗体的体积为3μl，浓度是1μg/ml，pbst的浓度是1mol/l，清洗4次，每次10ml。

作为改进的是，步骤5中的牛血清蛋白浓度是50mg/ml，体积为6μl，pbst的浓度是1mol/l，清洗4次，每次10ml。

上述检测单胺氧化酶含量的纸基器件在制备脑胶质瘤或帕金森疾病早期诊断产品中的应用，即当滴加的抗体为单胺氧化酶a的抗体时，纸基器件可用于制备脑胶质瘤早期诊断产品中的应用；当滴加的抗体为单胺氧化酶b的抗体时，纸基器件可用于制备帕金森疾病早期诊断产品中的应用

有益效果

与现有技术相比，本发明的一种检测单胺氧化酶含量的纸基器件，结构简单快捷，通过喷蜡打印的方式形成亲疏水微流控通道，且每个检测区域间界限清晰，同一张纸基上可设计多个检测区域，同时实现高通量检测；其应用于中单胺氧化酶的检测更快，更准。

附图说明

图1为本发明检测单胺氧化酶a含量的纸基器件；

图2为单胺氧化酶a含量的标准曲线；

图3为单胺氧化酶b含量的标准曲线；

图4为单胺氧化酶a的干扰图；

图5为单胺氧化酶b的干扰图；

图6为检测单胺氧化酶a纸基器件在细胞样本的应用图；

图7为检测单胺氧化酶b纸基器件在细胞样本的应用图；

图8为蛋白质印迹图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细介绍。

实施例1

如图1所示，一种检测单胺氧化酶含量的纸基器件，包括层析纸和打印于层析纸上的微流控检测区域，所述微流控检测区域通过喷蜡打印机打印而成，所述微流控检测区域上含有单胺氧化酶的抗体，所述微流控检测区域为内径为8mm的圆形，边缘为亲疏水通道。

实施例2

利用实施例1中所述的一种检测单胺氧化酶含量的纸基器件的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，选取表面清洁干净的层析纸；

步骤2，在层析纸表面用蜡打印微流控检测区域，并将打印后的层析纸放置烘烤使得蜡渗透到背部，形成亲疏水的微流控通道；

步骤3，将经步骤2处理后的层析纸置于等离子清洗机中清洗后；

步骤4，在微流控检测区域滴加单胺氧化酶a的抗体，并用pbst清洗；

步骤5，在微流控检测区域中滴加牛血清蛋白，并用pbst清洗，即得检测单胺氧化酶a含量的纸基器件。

当单胺氧化酶a的抗体更改为单胺氧化酶b的抗体时，即得检测单胺氧化酶b含量的纸基器件。

实施例3

选取实施例2中检测单胺氧化酶a含量的纸基器件时，制定测定单胺氧化酶a含量的标准曲线，步骤如下：

（1）向纸基器件的不同微流控检测区域滴加10ml的pbst，活化5分钟；

（2）将滴有pbst的微流控检测区域滴加一系列不同浓度梯度的生物单胺氧化酶a含量的样品，孵化30分钟后，每个微流控检测区域用pbst清洗4次，每次10μl；

（3）向微流控检测区域内滴加3μl的标记hrp的抗体mao-a，孵化4分钟后，用pbst清洗4次，每次10μl；

（4）配制过氧化物辣根酶底物过氧化物和鲁米诺，并在微流控检测区域内滴加10μl的曝光液底物，并立即放入化学检测器检测化学发光；

（5）将图片通过imagej方式转化数值，制定标准曲线，如图2所示。

实施例4

选取实施例2中检测单胺氧化酶b含量的纸基器件时，制定测定单胺氧化酶b含量的标准曲线，步骤如下：

（1）向实施例2制备的纸基器件的不同微流控检测区域滴加10ml的pbst，活化5分钟；

（2）将实施例2制备的纸基器件的滴有pbst的微流控检测区域滴加一系列不同浓度梯度的生物单胺氧化酶b含量样品，孵化30分钟后，每个微流控检测区域用pbst清洗4次，每次10μl；

（3）向微流控检测区域内滴加3μl的标记hrp的抗体mao-b（与捕获抗体种属不同），孵化4分钟后，用pbst清洗4次，每次10μl；

（4）配制过氧化物辣根酶底物过氧化物和鲁米诺，并在微流控检测区域内滴加10μl的曝光液底物，并立即放入化学检测器检测化学发光；

（5）将图片通过imagej方式转化数值，制定标准曲线，如图3所示。

实施例5

检测单胺氧化酶抗体对同源性mao-a和mao-b在纸基上相互干扰性

用实施例2制备的纸基器件检测mao-a和mao-b以及外加抑制剂对其在纸基器件上的抗干扰性，步骤为：

（1）向实施例2制备的纸基器件的不同微流控检测区域滴加10ml的pbst，活化5分钟；

（2）分别配制等浓度的mao-a标准品（标记样品a），mao-b的标准品（标记样品b），mao-a标准品中加入mao-a的抑制剂氯吉兰（cl）（标记样品a-cl），mao-a标准品中加入mao-b的抑制剂巴吉林（pa）（标记样品a-pa），mao-b标准品中加入mao-a的抑制剂氯吉兰（cl）（标记样品b-cl），mao-b标准品中加入mao-b的抑制剂巴吉林（pa）（标记样品b-pa），以及一定浓度的pbs（标记样品blank），分别将样品a，b，a-cl，a-pa，b-cl，b-pa，blank滴3μl在微流控检测区域孵化30分钟，之后每个微流控检测区域用pbst清洗4次，每次10μl；

（3）向微流控检测区域内滴加3μl的标记hrp的抗体mao-a，孵化4分钟后，用pbst清洗4次，每次10μl；

（4）配制过氧化物辣根酶底物过氧化物和鲁米诺，并在微流控检测区域内滴加10μl的曝光液底物，并立即放入化学检测器检测化学发光；

（5）将图片通过imagej方式转化数值，制定标准曲线，如图4所示。

通过检测mao-a和mao-b的标准品以及其抑制剂的样品对mao-a捕获抗体的免疫结果可知，该器件的抗体不能识别同源性mao-b的样品而只对mao-a的样品有免疫效果，因此，可降低该器件在使用过程中出现的假阳性，提高其准确性。

实施例6

检测单胺氧化酶抗体对同源性mao-a和mao-b在纸基上相互干扰性

用实施例3制备的纸基器件检测mao-a和mao-b以及外加抑制剂对其在纸基器件上的抗干扰性，步骤为：

（1）向实施例3制备的纸基器件的不同微流控检测区域滴加10ml的pbst，活化5分钟；

（2）分别配制等浓度的mao-a标准品（标记样品a），mao-b的标准品（标记样品b），mao-a标准品中加入mao-a的抑制剂氯吉兰（cl）（标记样品a-cl），mao-a标准品中加入mao-b的抑制剂巴吉林（pa）（标记样品a-pa），mao-b标准品中加入mao-a的抑制剂氯吉兰（cl）（标记样品b-cl），mao-b标准品中加入mao-b的抑制剂巴吉林（pa）（标记样品b-pa），以及一定浓度的pbs（标记样品blank），分别将样品a，b，a-cl，a-pa，b-cl，b-pa，blank滴3μl在微流控检测区域孵化30分钟，之后每个微流控检测区域用pbst清洗4次，每次10μl；

（3）向微流控检测区域内滴加3μl的标记hrp的抗体mao-b，孵化4分钟后，用pbst清洗4次，每次10μl；

（4）配制过氧化物辣根酶底物过氧化物和鲁米诺，并在微流控检测区域内滴加10μl的曝光液底物，并立即放入化学检测器检测化学发光；

（5）将图片通过imagej方式转化数值，制定标准曲线，如图5所示。

通过检测mao-a和mao-b的标准品以及其抑制剂的样品对mao-b抗体的免疫结果可知，该器件的抗体不能识别同源性mao-a的样品而只对mao-b的样品有免疫效果，因此，可降低该器件在使用过程中出现的假阳性，提高其准确性。

实施例7

选取实施例2中检测单胺氧化酶a含量的纸基器件时，检测细胞系样品中单胺氧化酶a含量，步骤为：

（1）选取shsy5y细胞系裂解液（样品标记为s）以及在裂解液样本中加抑制剂cl（标记样本为s-cl），加抑制剂pa（标记样本为s-pa）、hepg-2细胞系裂解液（样品标记为h）以及加抑制剂cl（标记样本为h-cl），加抑制剂pa（标记样本为h-pa）、hela细胞系裂解液（样品标记为he）以及在裂解液加抑制剂cl（标记样本为he-cl），加抑制剂pa（标记样本为he-pa）、以及一定浓度的pbs（标记样品blank）；

（2）将实施例2制备的纸基器件的不同微流控检测区域滴加10ml的pbst，活化5分钟；

（3）取样品s，s-cl，s-pa，hh-cl，h-pa，he，he-cl，he-pa，blank分别滴3μl在检测区孵化30分钟，之后每个微流控检测区域用pbst清洗4次，每次10μl；

（4）向微流控检测区域内滴加3μl的标记hrp的抗体mao-a，孵化4分钟后，用pbst清洗4次，每次10μl；

（5）配制过氧化物辣根酶底物过氧化物和鲁米诺，并在微流控检测区域内滴加10μl的曝光液底物，并立即放入化学检测器检测化学发光；

（6）将图片通过imagej方式转化数值，制定标准曲线，如图6所示。

从图6的细胞样本结果可知，用该发明的器件定性检测细胞样本中是否过表达mao-a与蛋白质印迹图谱结果（图8）一致。因此，该器件可检测mao-a，可作为早期诊断胶质瘤病人的工具。

实施例8

选取实施例2中检测单胺氧化酶b含量的纸基器件时，检测细胞系样品中单胺氧化酶b含量，步骤为：

（1）选取shsy5y细胞系裂解液（样品标记为s）以及在裂解液样本中加抑制剂cl（标记样本为s-cl），加抑制剂pa（标记样本为s-pa）、hepg-2细胞系裂解液（样品标记为h）以及加抑制剂cl（标记样本为h-cl），加抑制剂pa（标记样本为h-pa）、hela细胞系裂解液（样品标记为he）以及在裂解液加抑制剂cl（标记样本为he-cl），加抑制剂pa（标记样本为he-pa）、以及一定浓度的pbs（标记样品blank）；

（2）将纸基器件的不同微流控检测区域滴加10ml的pbst，活化5分钟；

（3）取样品s，s-cl，s-pa，hh-cl，h-pa，he，he-cl，he-pa，blank分别滴3μl在检测区孵化30分钟，之后每个微流控检测区域用pbst清洗4次，每次10μl；

（4）向微流控检测区域内滴加3μl的标记hrp的抗体mao-b（与捕获抗体种属不同），孵化4分钟后，用pbst清洗4次，每次10μl；

（5）配制过氧化物辣根酶底物过氧化物和鲁米诺，并在微流控检测区域内滴加10μl的曝光液底物，并立即放入化学检测器检测化学发光；

（6）将图片通过imagej方式转化数值，制定标准曲线，如图7所示。

从图7的细胞样本结果可知，用该发明的纸基器件定性检测细胞样本中是否过表达mao-b与蛋白质印迹图谱结果（图8）一致。因此，该器件可检测mao-b，可作为早期诊断帕金森疾病的工具之一。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。