全内反射检测基因芯片杂交结果的方法与流程

本发明涉及核酸分析技术领域，其是一种核酸的测定方法，并采用了一种用于核酸分析的产品，本发明尤其涉及一种全内反射检测基因芯片杂交结果的方法。本发明还特别涉及一种体外诊断检测仪器，属于体外诊断检测仪器中的高通量检测分析仪器，同时涉及分子诊断检测仪器中的分子生物信息分析处理系统。

背景技术：

生物芯片技术已经广泛应用于临床疾病诊断、健康管理、药物研究开发、动植物检疫、食品检测、环境监测、科学研究、法医学检测等众多领域，有广阔的应用前景，市场需求量非常大。

基因芯片是生物芯片中的一类，是通过在芯片的基片上定植一系列的序列已知探针而制备，可用于特定标记核酸的杂交检测，能通过识别检测与信息处理来报告检测对象中核酸信息。

当前基因芯片杂交结果的检测方法主要有两大类，一个是利用激光共聚焦扫描仪逐一扫描确定每个探针位置的杂交状态，另一个是利用ccd（电荷耦合器件，chargecoupleddevice）相机或cmos（互补金属氧化物半导体，complementarymetal-oxide-semiconductor）相机一次性成像然后对图像进行解析并获取基因芯片杂交结果。无论哪种荧光成像，都是使用带通滤光片将激发光折射到探针上的标记荧光物质并激发荧光物质发出标记荧光，标记荧光再通过带通滤光片进入检测器完成荧光成像，由于激发光与标记荧光同时存在于探针上，必然会有激发光对荧光成像结果的背景干扰。在荧光成像时，过高的背景干扰会形成假阴性或假阳性；假阴性会造成疾病的延误治疗，还会造成无法挽回的生命损失。有效降低基因芯片检测时的背景干扰，提高基因芯片的检测结果准确率，对基于基因芯片的疾病筛查意义重大。

技术实现要素：

本公开的目的在于至少部分地克服现有技术的缺陷，提供一种新的全内反射检测基因芯片杂交结果的方法。

本公开的目的还在于提供一种全内反射检测基因芯片杂交结果的方法，克服激发光对荧光成像结果的背景干扰造成假阴性或假阳性的问题。

为达到上述目的或目的之一，本公开提供了如下技术方案：

一种全内反射检测基因芯片杂交结果的方法，所述方法包括：构造基因芯片检测仪，所述基因芯片检测仪中设置有石英玻璃板，所述石英玻璃板将基因芯片检测仪的暗箱分为光源暗箱与成像暗箱；在石英玻璃板上添加与石英玻璃的折射率相同的等折射率溶液；将基因芯片的石英玻璃基片放置在等折射率溶液上，等折射率溶液将基因芯片的石英玻璃基片和石英玻璃板粘合在一起，使得基因芯片的石英玻璃基片、等折射率溶液和石英玻璃板成为折射率连续一致的光学介质；调整面平行光光源发生器的位置和角度，使得发出的面平行光能够照射到基因芯片的石英玻璃基片上形成全内反射，光源激发光被全反射形成光源反射光的同时还会在基因芯片的石英玻璃基片的表面形成全内反射的隐失波；全内反射的隐失波激发基因芯片的石英玻璃基片上的探针上已经完成杂交和荧光标记的荧光物质而发出标记荧光；标记荧光被高分辨率相机捕获，形成荧光成像图，经过数据分析和整理，最终获得基因芯片杂交的检测结果。

根据本发明的一个优选实施例，所述面平行光在石英玻璃基片的表面100nm范围内形成全内反射的隐失波。

根据本发明的一个优选实施例，所述面平行光照射到石英玻璃基片上的光源激发光能够覆盖石英玻璃基片。

根据本发明的一个优选实施例，阻断光反射材料铺设在暗箱的内表面上，使得暗箱的内表面上的阻断光反射材料阻止照射到暗箱的内表面上的光被反射。

根据本发明的一个优选实施例，所述面平行光是由面平行光光源发生器发出，所述面平行光光源发生器包括激光光源和激光光束扩束器。

根据本发明的一个优选实施例，所述调节面平行光光源发生器的位置和角度，是通过调节与面平行光光源发生器相连的伺服电机在激光光源支架上的位置和面平行光光源发生器在伺服电机上的转动角度实现的。

根据本发明的一个优选实施例，所述方法检测的杂交结果不需要扫描。

根据本发明的一个优选实施例，所述方法形成的光源激发光、光源反射光、隐失波不会被高分辨率相机捕获，只有标记荧光被高分辨率相机捕获，通过高分辨率相机捕获的图像进行解析从而获得基因芯片的杂交结果，检测过程中消除了荧光成像的背景干扰，提高了杂交信号的信噪比。所述的高分辨率相机是相对于普通分辨率相机（相当于民用相机）而言，主要差别在于分辨率（resolution），所谓分辨率是指相机每次采集图像的像素点数（pixels），随着年代的不同像素区分指标也有所不同的，2018年以后最主流的高分辨率相机是1800万到2400万像素。

根据本发明的一个优选实施例，所述高分辨率相机为电荷耦合器件相机或者互补金属氧化物半导体相机。

根据本发明的一个优选实施例，标记荧光经过带通滤光片的选择性滤光后被高分辨率相机捕获。

根据本发明的一个优选实施例，所述带通滤光片选择和标记荧光相适应。

根据本发明的一个优选实施例，所述等折射率溶液为乙二醇溶液。

根据本发明的一个优选实施例，所述成像暗箱位于所述光源暗箱的上方，且成像暗箱的沿水平的第一方向的尺寸小于光源暗箱的沿所述水平的第一方向的尺寸。

根据本发明的一个优选实施例，所述带通滤光片根据探针发出的标记荧光的波长进行选择。

本发明提供一种全内反射检测基因芯片杂交结果的方法，将全内反射成像原理应用于基因芯片杂交结果检测中，通过光路设计使面平行光的光源激发光在检测仪中形成全内反射。通过等折射率溶液将石英玻璃基片和石英玻璃板粘合在一起，保证检测仪的石英玻璃板、等折射率溶液与石英玻璃基片折射率一致，等同于一块石英玻璃，使全内反射的隐失波在石英玻璃基片表面传播，激发了标记荧光，光源激发光、光源反射光、隐失波不会被高分辨率相机捕获，阻断光反射材料又阻止了照射到暗箱内表面的光再次被反射，最终只有标记荧光透过带通滤光片的选择被高分辨率相机捕获，这样多重设计，克服了光源激发光和光源反射光等光源信号对荧光成像结果的背景干扰，减少了假阴性或假阳性的问题的产生，检测结果更准确。

本发明最核心的技术是利用了等折射率溶液，通过等折射率溶液把基因芯片的石英玻璃基片粘合在石英玻璃板上。此处，不仅利用了等折射率溶液“等折射率”这一本质特点，还利用了等折射率溶液具有一定的“粘合作用”特点，从而保证石英玻璃板、等折射率溶液和基因芯片的石英玻璃基片粘合在一起，等同于一块石英玻璃，折射率一致，保证面平行光光源发生器发出的光源激发光全内反射形成全内反射的隐失波，全内反射的隐失波只沿基因芯片的石英玻璃基片表面传播，使基因芯片的石英玻璃基片100nm范围内薄层中的基因芯片上已经完成杂交和荧光标记的探针上的标记荧光物质受到激发而发出标记荧光，并通过检测仪的相机成像，面平行光激发光本身、全内反射的隐失波均不能进入相机成像，从而解决了对荧光成像的背景干扰问题。

根据本发明的构造的检测仪，通过石英玻璃板把暗箱分为光源暗箱与成像暗箱，光源暗箱内的光源激发光和光源反射光均不进入到成像暗箱，该仪器进一步解决了荧光成像受激发光背景干扰的问题。所述检测仪通过被安置在激光光源支架上的伺服电机调整面平行光光源发生器的位置与角度，保证面平行光光源发生器发出的光源激发光在石英玻璃板上形成全内反射，光源反射光也不进入到成像暗箱中，又一步解决了对荧光成像的背景干扰问题。此外，将阻断光反射材料设置在暗箱的内表面上，保证暗箱内表面上所有的光不会再次反射，再次阻断暗箱内的光反射污染带来的背景干扰。

根据本发明的构造的检测仪，通过设计可选择替换的带通滤光片，使用过程中选择与探针发出的标记荧光相适应的带通，又进一步阻止了带通滤光片选择范围之外的背景荧光的干扰。

本发明的有益效果是通过利用面光源全内反射检测基因芯片杂交结果的方法，最大程度上避免了荧光成像过程中的背景干扰，提高了基因芯片杂交结果的信噪比和基因芯片杂交结果的检测灵敏度，使用效果好。

附图说明

图1为根据本发明的实施例的全内反射检测基因芯片杂交结果的方法；

图2为根据本发明的实施例的全内反射检测基因芯片杂交结果的方法所构造的检测仪的结构示意图；

图中：1、暗箱；2、石英玻璃板；3、光源暗箱；4、激光光源支架；5、伺服电机；6、面平行光光源发生器；7、光源激发光；8、光源反射光；9、等折射率溶液；10、石英玻璃基片；11、全内反射的隐失波；12、探针；13、标记荧光；14、带通滤光片；15、高分辨率相机；16、成像暗箱；17、阻断光反射材料。

具体实施方式

下面结合附图详细描述本公开的示例性的实施例，其中相同或相似的标号表示相同或相似的元件。另外，在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本披露实施例的全面理解。然而明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。在其他情况下，公知的结构和装置以图示的方式体现以简化附图。

本发明提供了一种全内反射检测基因芯片杂交结果的方法，以及本方法所构造的全内反射式基因芯片检测仪。

如图1-2所示，全内反射检测基因芯片杂交结果的方法包括：构造基因芯片检测仪，所述基因芯片检测仪中设置有石英玻璃板2，所述石英玻璃板2将基因芯片检测仪的暗箱1分为光源暗箱3与成像暗箱16；在石英玻璃板2上添加与石英玻璃的折射率相同的等折射率溶液9；将基因芯片的石英玻璃基片10放置在等折射率溶液9上，等折射率溶液9将基因芯片的石英玻璃基片10和石英玻璃板2粘合在一起，使得基因芯片的石英玻璃基片10、等折射率溶液9和石英玻璃板2成为折射率连续一致的光学介质；调整面平行光光源发生器6的位置和角度，使得发出的面平行光能够照射到基因芯片的石英玻璃基片10上形成全内反射，全内反射的隐失波11被全反射形成光源反射光8的同时还会在基因芯片的石英玻璃基片10的表面形成全内反射的隐失波11；光源激发光7激发探针12上已经完成杂交和荧光标记的荧光物质而发出标记荧光13；标记荧光13被高分辨率相机15捕获，形成荧光成像图，经过数据分析和整理，最终获得基因芯片杂交的检测结果。

检测方法通过光路设计使面平行光光源的光源激发光在检测仪中形成面光源全内反射，具体地，通过等折射率溶液把基因芯片的石英玻璃基片粘合在石英玻璃板上，面平行光光源发射的光射向“石英玻璃板-等折射率溶液-石英玻璃基片”形成的一体结构上，在石英玻璃基片的表面发生全内反射。

首先利用了面平行光光源，所述面平行光光源由面平行光光源发生器发出，所述面平行光光源发生器包括激光光源和激光光束扩束器；调节面平行光光源发生器的位置和角度，是通过调节与之相连的伺服电机在激光光源支架上的位置和面平行光光源发生器在伺服电机上的转动角度实现的；面平行光光源照射到石英玻璃基片表面的光源激发光能够覆盖石英玻璃基片，并且在石英玻璃基片的表面100nm范围内形成全内反射的隐失波，全内反射的隐失波激发探针上已经完成杂交和荧光标记的荧光物质发出标记荧光，同时保证光源激发光在石英玻璃板上产生全反射。

其次所述检测方法还利用了等折射率溶液的两个特点，一是利用了等折射率溶液“等折射率”这一本质特点，第二点还利用了等折射率溶液具有一定“粘合作用”的特点，从而保证石英玻璃板、等折射率溶液和基因芯片的石英玻璃基片粘合在一起，等同于一块石英玻璃，折射率一致，形成一个“石英玻璃板-等折射率溶液-石英玻璃基片”一体结构，保证面平行光光源发生器发出的光源激发光全内反射并形成全内反射的隐失波，全内反射的隐失波只沿基因芯片的石英玻璃基片表面传播，使基因芯片的石英玻璃基片100nm范围内薄层中的石英玻璃基片上已经完成杂交和荧光标记的探针上的标记荧光物质受到激发而发出标记荧光，并通过检测仪的相机成像，面平行光激发光本身、全内反射的隐失波均不能进入相机成像，从而解决了对荧光成像的背景干扰问题。

图2示出了根据本发明的实施例的方法所构造的全内反射式基因芯片检测仪的结构示意图，所述检测仪将石英玻璃板2安置在暗箱1中，从而把暗箱1分为光源暗箱3与成像暗箱16两部分；所述石英玻璃板2是嵌合在暗箱1中的，石英玻璃板2的厚度小于光源暗箱3和成像暗箱16过渡区域暗箱1的厚度；石英玻璃板2的长度大于基因芯片的石英玻璃基片10的长度。石英玻璃板2对暗箱1的分隔，保证了在成像暗箱16的成像过程中光源暗箱3内的光源激发光7和光源反射光8均不进入到成像暗箱16中，从而可以在一定程度上避免背景光的干扰，产生这样效果的原因是光源激发光7在石英玻璃板2上产生全反射。

进一步地，所述成像暗箱16位于所述光源暗箱3的上方，且成像暗箱16的沿水平的第一方向的尺寸小于光源暗箱3的沿所述水平的第一方向的尺寸。所述石英玻璃板2的沿所述水平的第一方向的尺寸大于成像暗箱16的沿所述水平的第一方向的尺寸。

在暗箱1的内壁表面上还设置了阻断光反射材料17，这里的暗箱1包括了光源暗箱3与成像暗箱16，即光源暗箱3与成像暗箱16的内表面上都设置了阻断光反射材料17，尤其是在成像暗箱16的表面设置阻断光反射材料17，保证了暗箱1内表面上所有的光不会再次反射，阻断了暗箱1，尤其是成像暗箱16内的光反射污染带来的背景干扰。

在激光光源支架4上安装伺服电机5，与所述伺服电机5相连的还包括面平行光光源发生器6。所述面平行光光源发生器6包括激光光源和激光光束扩束器。通过调整安置在激光光源支架4上的伺服电机5的上下位置，以及调整面平行光光源发生器6在伺服电机5上的转动角度，可以调整面平行光光源发生器6发射的光源激发光7在石英玻璃板2上的入射角度，当入射角度调整到大于“石英玻璃板-等折射率溶液-石英玻璃基片”的临界角，同时面平行光光源发出的光源激发光7又能够照射覆盖到整个石英玻璃基片10时，产生全内反射光源反射光8，并在石英玻璃基片10的100nm范围内薄层中形成全内反射的隐失波11，光源反射光8又会被光源暗箱3内壁表面附着的阻断光反射材料17吸收，不会形成反射或散射，也不会进入成像暗箱16中。这样通过面平行光光源激发光位置与角度的调节以及阻断光反射材料17的二次吸收，又一步避免背景干扰。

具体实施例1：根据图2所示构造好所述检测仪后，在石英玻璃板2上滴加等折射率溶液9，此处，我们选择的等折射率溶液9为与石英玻璃折射率一致的乙二醇溶液，并在等折射率溶液9的上方放置一块空白的石英玻璃基片10，形成折射率一致的“石英玻璃板-乙二醇溶液-空白石英玻璃基片”一体结构，然后，在空白的石英玻璃基片10上滴加含有alexafluor488所标记核酸溶液（利用pcr方法引入edu(胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine)类似物，5-ethynyl-2'-deoxyuridine)制备），打开面平行光光源发生器6，此处的面平行光光源发生器6包括了激光光源和激光光束扩束器，产品选用长春新产业光电技术有限公司的mdl-xs-488型号，调整面平行光光源的入射角，选择与alexafluor488（吸收峰495nm、发射峰519nm）相适应的带通滤光片14，比如可以是带通(bp)为525/30的滤光片；经过带通滤光片14过滤选择后，高分辨率相机15只能够观察到绿色荧光，在光源暗箱3外即成像暗箱16中检测不到蓝光激发光,从而可以验证光源激发光7全反射形成了光源反射光8和全内反射的隐失波11，完成光路系统的调试，并验证了激发光全内反射的隐失波完成了荧光激发。

具体实施例2：根据具体实施例1完成光路系统调试后，取出空白的石英玻璃基片10，确保等折射率溶液9的乙二醇溶液仍为充满状态，将完成杂交和荧光标记的石英玻璃基片10放置在成像暗箱16中等折射率溶液9的上部；打开面平行光光源发生器6，通过高分辨率相机15获取基因芯片杂交结果的荧光图像，将获得的荧光成像图像上传到数据中心进行基因芯片杂交检测结果分析。

通过具体实施例1，调整了面平行光光源发生器6的位置和角度，保证了光源激发光7形成全内反射的隐失波11，所述全内反射的隐失波11只沿检测仪的在基因芯片的石英玻璃基片10的表面传播，光源激发光7本身不能进入成像暗箱16，消除了光源激发光7对荧光成像的背景干扰，提高了基因芯片杂交结果的信噪比。同时全内反射的隐失波11能够使基因芯片上已经完成杂交和荧光标记的探针12被激发，发出标记荧光13，标记荧光13穿过带通滤光片14进入高分辨率相机15并完成荧光成像。在后期构造所述检测仪的过程中，还可以进行优化，引入智能系统，从而实现检测前全反射光路系统的自动调试。此外，还可以在成像暗箱16中引入光亮度计，对进入成像暗箱16的光线进行检测，进一步确保光源暗箱3中的蓝色激发光不会进入成像暗箱16。

所述的高分辨率相机15被设置在成像暗箱16中，为本检测仪的成像器件，所述高分辨率相机15嵌合在成像暗箱16中与石英玻璃板相对的一侧，高分辨率相机15选用一种高量子效率、低噪声的光谱成像相机，相机分辨率高，更适合于对基因芯片杂交结果的精准分析，增强检测的准确性，此处，高分辨率相机15可以选用ccd相机（德国pco公司，pco.pixelflyusb系列）。高分辨率相机15位于成像暗箱16内部的一端还设置有带通滤光片14，带通滤光片14主要作用是将探针12发出的标记荧光13进行光谱选择，选择出合适带通的带通滤光片14，从而使探针12发出的标记荧光13进入高分辨率相机15，不需要的波谱的光被阻止通过，从而更适用于本检测仪进行精准成像分析。

具体实施例3：在构造全内反射式基因芯片检测仪的过程中，为了保证面平行光照射到基因芯片的基片上的光源激发光能够照射覆盖到整个基因芯片的基片，比如基因芯片的基片选用石英玻璃基片10，可能石英玻璃基片10的两端会有部分光源激发光7通过，为了保证光源激发光7不进入成像暗箱16中，在石英玻璃基片10放置位置两端设置移动式的，阻断光反射材料17，石英玻璃基片10放置好以后，调整移动式阻断光反射材料17，保证石英玻璃基片10的两端与移动式阻断光反射材料17紧密相连，从而进一步保证了光源激发光7对成像的背景干扰。

具体实施例4：根据具体实施例1完成光路系统调试后，可以通过在所述检测仪中引入智能系统，计算出面平行光光源发出的光源激发光7的光路和石英玻璃板2下部的照射范围数据，从而计算出石英玻璃板2下部需要设置阻断光反射材料17的长度，在石英玻璃板2下方引入移动式阻断光反射材料17，根据计算出的需要设置阻断光反射材料17的长度数据，移动调整石英玻璃板2下方移动式阻断光反射材料17的覆盖面，保证光源暗箱3中只有所需的光源激发光7照射到石英玻璃板2上，其他背景光都被阻断光反射材料17所阻断，不会通过石英玻璃板2两端的间隙进入成像暗箱16中。

本发明的核心是通过构造“石英玻璃板-等折射率溶液-石英玻璃基片”一体结构形成全反射，等折射率溶液9是将石英玻璃板2和石英玻璃基片10形成一体的关键，构造所述全内反射式基因芯片检测仪的关键步骤是滴加等折射率溶液9，因此在石英玻璃板2的上端预留能够承载等折射率溶液9的空间，检测时，通过移液器将空间滴加充满等折射率溶液9；更换石英玻璃基片10时，需要检查等折射率溶液9是否为充满状态；使用完毕后需要用移液器移除所有的等折射率溶液9；更换不同的等折射率溶液9时，需要在移除原有等折射率溶液9的基础上，用新的等折射率溶液9润洗至少1次后再滴加至充满状态。

根据本发明的总体构思，提供了一种全内反射检测基因芯片杂交结果的方法，首先通过光路设计调节面平行光光源，即调节面平行光光源发生器6发出的面平行光光源的光源激发光7的角度，使之发出光源激发光7在石英玻璃板2上产生全反射；其次，通过等折射率溶液9将石英玻璃基片10和石英玻璃板2粘合在一起形成折射率连续一致的光学体系，使全内反射的隐失波在石英玻璃基片10表面传播，保证光源激发光7和全内反射的隐失波11不进入高分辨率相机，消除荧光成像的背景干扰。

根据本发明的总体构思，构造了一种全内反射式基因芯片检测仪，石英玻璃板2把暗箱1分隔成光源暗箱3与成像暗箱16，保证光源暗箱3中的光源激发光7与光源反射光8都在光源暗箱3中，均不进入到成像暗箱16；同时，暗箱1的内壁表面附着阻断光反射材料17，保证暗箱1（这里所述的暗箱1既包括光源暗箱3，又包括成像暗箱16）内表面上所有的光不会再次反射，从而进一步阻断了成像暗箱16内的光反射污染。基因芯片的石英玻璃基片10通过等折射率溶液9和石英玻璃板2粘合在一起，形成折射率一致的光路体系，保证在石英玻璃基片10形成全内反射的隐失波11，全内反射的隐失波11激发了基因芯片上已经完成杂交和荧光标记的探针12，探针12发出的标记荧光13透过带通滤光片14在高分辨率相机15上完成荧光成像，荧光成像结果经过数据分析和整理，最终获得基因芯片杂交的检测结果。通过单独成像暗箱16的分隔、阻断光反射材料17的布局，石英玻璃材质折射率一致的入射光全内反射体系和面光源激光位置与角度的调整，层层递进的阻断了激发光源、反射光源、散射光源等背景光对荧光成像结果的背景干扰。

在基因芯片杂交结果的检测过程中，都需要进行荧光成像，将激发光折射到探针上的标记荧光物质并激发荧光物质发出标记荧光，标记荧光再进入检测器完成荧光成像。现有常用的基因芯片杂交结果的检测仪的成像过程中,激发光与标记荧光同时存在于探针上，导致存在的激发光会对荧光成像结果造成背景干扰，过高的背景干扰会形成假阴性或假阳性；假阴性会造成疾病的延误治疗，还会造成无法挽回的生命损失。

根据本发明提供的全内反射检测基因芯片杂交结果的方法，将利用面平行光光源形成全内反射成像原理应用于基因芯片杂交结果检测中，消除荧光成像的背景干扰和提高杂交信号的信噪比。

根据本发明提供的全内反射检测基因芯片杂交结果的方法所做出的全内反射式基因芯片检测仪，通过石英玻璃板把暗箱分隔成光源暗箱与成像暗箱，保证光源暗箱中的光不进入到成像暗箱中；通过暗箱内壁的阻断光反射材料保证暗箱内表面上所有的光不会再次反射，进一步阻断光反射污染；通过等折射率溶液把石英玻璃基片和石英玻璃板粘合在一起，形成折射率一致的光路体系，保证激发光在基因芯片的石英玻璃基片表面形成全内反射的隐失波不会进入到成像器件中造成背景干扰。

因此，通过全内反射检测基因芯片杂交结果的方法的优化构造出全内反射式基因芯片检测仪，利用该方法和该仪器，最大程度上避免了荧光成像过程中的背景干扰，提高了基因芯片杂交结果的信噪比和基因芯片杂交结果的检测灵敏度，使用效果好，具有更高的检测灵敏度和特异性。

尽管已经示出和描述了本公开的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本公开的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行变化。本公开的适用范围由所附权利要求及其等同物限定。