[0022] 上述目的通过下述改进的方法来实现，所述方法中，不同的酸性抑一方面用于解 离流体样品中预形成的复合体（如蛋白A-IgG复合体），另一方面进行免疫测定，也就是在 该抑下很大程度上防止复合体再形成，且在该抑下甚至在大量配混组分的存在下捕获分 子（典型地为抗体）也足够地有活性，从而对分析物产生剂量响应。
[0023] 在一个方面，本发明由此提供通过免疫测定来定量测定流体样品中的分析物的方 法，所述免疫测定包括使分析物结合至能够特异性结合该分析物的配体，其中至少部分分 析物作为分析物复合体存在，和其中所述方法包括下列步骤：
[0024] a)使所述样品处于第一酸性抑，从而至少实质上解离存在的任何分析物复合体 并将实质上所有分析物W游离形式提供，
[00巧]b)将第一酸性抑升高至第二酸性抑，其中（至少很大程度上）防止复合体的再 形成，但其中允许分析物与配体的结合，和
[0026] C)测定分析物与配体的结合W定量测定样品中的分析物。
[0027] 本文使用的术语"分析物复合体"包括与特异性W及非特异性结合物质的复合体， 而且还包括分析物的多聚体，例如二聚体或H聚体。
[0028] 配体可例如为抗体。本文使用的术语"抗体"将在广义上解释，是指免疫球蛋 白，该免疫球蛋白可为天然或者部分或全部合成生产的，并且还包括活性片段，包括Fab抗 原-结合片段、一价片段和二价片段。该术语还涵盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源的 结合结构域的任何蛋白质。此类蛋白质可衍生自天然来源，或者部分或全部合成生产。示 例性抗体为免疫球蛋白同种型和F油、F油'、F(油'）2、scFv、Fv、dAb和Fd片段。
[0029] 典型地，该配体固定化至固体支承体。
[0030] 在一个实施方案中，分析物选自蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L或其衍生物（包括 天然变体和重组生产的蛋白质或多肤），并且样品包含IgG。
[003。 在另一实施方案中，第一酸性抑选自在约1. 5至约3. 2 (特别是1. 5至3. 2)的范 围内，第二酸性抑选自在约2. 7至约4. 5 (特别是2. 7至4. 5)的范围内，更优选约2. 8至约 4. 5 (特别是2. 8至4. 5)。第二酸性抑可选自在例如约3. 0至约4. 5 (特别是3. 0至4. 5) 的范围内。
[0032] 在一个实施方案中，第一酸性抑选自在约2. 3至约2.5 (特别是2. 3至2. 5)的范 围内，和/或第二酸性抑选自在约2. 8至约3.2 (特别是2. 8至3. 2)的范围内。可选地， 第二酸性抑选自在约3. 3至约3. 5 (特别是3. 3至3. 5)或约3. 0至约3. 2 (特别是3. 0至 3. 2)的范围内。
[0033] 该方法可在微流体系统（microfluidicsystem)中方便地进行。
[0034] 另一方面，本发明提供用于进行分析物免疫测定的试剂盒，所述分析物至少部分 W复合体形式存在于流体样品中，所述试剂盒包括：
[003引-检测剂，其能够结合至分析物，
[0036]-第一酸性缓冲液，其优选具有在约1. 5至约3. 2范围内的抑，和
[0037] -第二酸性缓冲液，其具有高于第一酸性缓冲液的抑，优选在约2. 7至约4. 5范围 内的抑。
[0038] 在一个试剂盒实施方案中，分析物能够结合至固定化于固相的配体，且该试剂盒 还包括针对分析物的捕获剂，其中所述捕获剂能够结合至固相。
[0039] 优选地，捕获剂是生物素化的，且配体为亲和素（avidin)或链霉亲和素 (streptavidin)。
[0040] 其它优选的实施方案在从属权利要求中描述。
[0041] 本发明更完整的理解，及其进一步的特征和优势，将通过参考下列详细说明和附 图来获得。
[004引 为简单简洁起见术语"MabSelectSuRe?配体'將在下文中常称作"MabSelectSuRe"。
【附图说明】
[0043] 图1为用于进行本发明方法的实施方案的微结构的平面图。
[0044] 图2为分别用于蛋白VigG复合体解离和释放的蛋白A的分析的抑间隔的图解。
[0045] 图3为用于M油SelectSuRe?配体在IgGW5mg/ml存在下自动化酸解离和分析 的方法的图解。
[0046] 图4为W叠加格式表示的测定下述标准曲线的剂量响应关系的图；（1)M油Select SuRe仅在缓冲液中；（2)M油selectSuRe巧mg/ml的hIgG，在抑2. 5和3. 5下处理后；（3) (对照）M油SelectSuRe巧mg/mlhIgG，在抑2. 5下解离并在抑8. 0下测定；和（4)(对 照）MabSelectSuRe，5mg/ml的hlgG,没有解离，在抑7. 4下测定。
[0047] 图5为示出MabSelectSuRe在5mg/ml的hIgG的存在下的标准曲线的图。
[0048] 图6为示出M油SelectSuRe在5mg/ml的hIgG的存在下的标准曲线的图。
[0049] 图7为示出天然蛋白A在5mg/ml的多克隆人IgG的存在下的标准曲线的图（复 合体解离的抑为2. 3,分析的抑为3. 3)。
[0050] 图8为示出两种不同分子形式的蛋白A[天然（1)和M油SelectSuRe(2)]在5mg/ ml浓度的多克隆人IgG(0ctagam?)存在下的叠加标准曲线的图。
[005。 图9为示出M油SelectSuRe在不同浓度Humira?(治疗性单克隆抗体）的存在下 的叠加格式标准曲线的图。（1)为M油SelectSuRe仅在缓冲液中；（2)为M油SelectSuRe 在lOmg每ml的Humira?中；做为MabSelectSuRe在 5mg每ml的Humira?中；和（4)为 MabSelectSuRe在 2mg每ml的Humira?中。
[005引图10为示出（1)仅在缓冲液中；似在5mg每ml的化rc巧tin?(治疗性单克隆 抗体）的存在下；（3)在5mg每ml的Humira?的存在下的残余M油SelectSuRe的叠加格 式标准曲线的图。
[0053] 图11为示出MabSelectSuRe在5mg/ml的Humira?的存在下的标准曲线的图。
【具体实施方式】
[0054] 如上所述，本发明基于为解离样品中预形成的复合体和进行免疫测定而采用不同 的酸性抑的原理，且更具体地是通过：首先为了有效的复合体解离而使用相对低的抑，并 随后在酸性的较高抑下进行测定，在该抑下很大程度上防止复合体的恢复，同时捕获剂 (典型地为抗体）对于待定量分析物的有效捕获足够地有活性。
[00巧]所述方法可用多种多样的测定系统和测定格式（assay化rmats)进行。
[0056] 优选地，一种包括了含有固定化的分析物特异性的配体的固体支承体表面的异相 测定系统用来测量分析物浓度；该测量通过直接地或间接地检测分析物（直接测定，包括 夹也测定；或置换测定）或分析物的可检测类似物（竞争测定）在固体支承体表面的结合 量来进行。固体支承体表面可具有多种形状，如同其本身在本领域中已知的一样，并可例如 为填充床（packedbed)中的颗粒，典型地设置在微流体槽或腔中；或可为例如微孔或流动 室或槽等的杯（cuvette)或孔的表面区域。
[0057] 虽然本发明的方法通常可应用于多种多样的分析物和分析物复合体，在下文中将 主要就液体样品中在IgG的存在下对蛋白A和蛋白A衍生物的定量，W及就在微流体系统 (特别是上述Gyrokb?平台）中进行测定来进行描述。
[0058] 可预期通过本发明的方法测定的至少