ala,Sweden(www.gelifesciences.com)。
[0087] CD
[0088]CDMXl(P0020026)，也称为"GyrolabADACD",来自Gyros AB,Uppsala,Sweden(WWW.gyros,com)。柱状填充物为（15ym)链霉亲和素衍生的 Dynospheres?(InvitrogenDynalA.S. ,Oslo,Norway)。
[0089] 样品制备
[0090] 标准曲线通过蛋白A在PBS中的5mg/ml多克隆IgG(pH7.4)中稀释，使蛋白A和 IgG之间形成复合体来制备。
[00川质量控制（QC)样品是在5mg/ml的多克隆或单克隆IgG的存在下，W已知浓度的 蛋白A制备成的不同的稀释液。
[0092] 671~〇1油"法
[0093] 在分析之前用于样品的自动酸解离的方法开发于CDMX1中。该用于在5mg/ml的 IgG存在下自动酸解离和分析M油SelectSuRe?配体的方法示于图3中，其中两栏表示分析 之前在捕获柱上和在样品中的处理。W=柱洗涂，C=捕获剂，S=样品，1 =酸解离1，2 = 酸解离2,SA=样品施加在捕获柱上，和D=检测剂。箭头表示不同的处理步骤如何互连。
[0094] 实验实质上如图3中概述的进行，但使用H种不同的对蛋白A的捕获抗体，也就 是，分别为商购鸡多克隆抗体，商购小鼠单克隆抗体，和专有的多克隆抗体，样品中浓度变 化的IgG和蛋白A或蛋白A衍生物（M油SelectSuRe)，W及变化的捕获柱的洗涂处理。结 果示于下文。
[0095] 实验
[0096] 如下文将要描述的，实验如上文概述的使用CDMX1进行，阐明使用不同抑的原理， 一方面解离样品中预形成的蛋白A-IgG复合体，另一方面下述抑下进行免疫测定，在该抑 下很大程度上防止复合体再形成，且在该抑下捕获抗体足够有活性，在5mg/ml的IgG的存 在下产生对M油Select SuRe?配体的剂量响应。
[0097] 所得数据表明蛋白A衍生物MabSelectSuRe可在亚ppm(sub-ppm)水平下在5mg/ ml的IgG浓度下测定。因此，用于M油SelectSuRe的测定从约Ing/ml向上跨至产生约 0. 2ppm(w/w)的灵敏度。
[0098] 现将描述使用上述H种不同捕获抗体的实验。
[0099] 鸡多克隆抗蛋白A抗体作为捕获和检测抗体（P肥.5下解离和抑3. 5下捕获）
[0100]MabSelectSuRe
[0101] 早期有迹象显示，由鹿大的过量IgG的存在造成的某些微小残余影响与 M油SelectSuRe?配体相比稍微影响回收结果。该见于图4中比较曲线1和2。图4阐 明测定如方法部分所述的仅含M油SelectSuRe?配体（1)、和抑2. 5和3. 5下处理后的 M油selectSuRe巧mg/ml的hIgG(2)的标准曲线的剂量响应关系。作为对照，含5mg/ml hIgG的M油SelectSuRe的标准曲线在抑2. 5下进行解离，但测定在抑8. 0下中和后进行 (3)，最后，M油SelectSuRe在5mg/ml的hIgG下的标准曲线（剂量响应曲线）不进行解离 并在抑7. 4下运行测定（4)。
[0102] 发现，上述指出的问题能够潜在地通过将IgG并入M油SelectSuRe标准品中来解 决。当尝试了该方法时，对于大部分试验的M油SelectSuRe/IgG比例，偏离的回收数据恢 复至预期水平，如W下图5和表1所示。
[0103] 图5示出在5mg/ml的hIgG的存在下M油SelectSuRe的标准曲线。捕获柱在捕 获步骤之前使用甘氨酸-巧樣酸盐缓冲液（pH3. 5)洗涂，并在分析过程结束之前在使用PBS 中和柱之前进一步洗涂两次。
[0104] 表1示出当使用图5中的标准曲线时QC样品的平均偏差（averagebias)。
[0105]衷 1
[0106]
【主权项】
1. 一种通过包括将分析物结合至能够特异性结合所述分析物的配体的免疫测定来定 量测定流体样品中所述分析物的方法，其中至少部分所述分析物作为分析物复合体存在， 和其中所述方法包括下述步骤： a) 使所述样品处于第一酸性pH，从而至少实质上解离存在的任何分析物复合体并将 实质上所有分析物以游离形式提供， b) 将所述第一酸性pH升高至第二酸性pH，其中防止复合体的再形成，但其中允许分析 物与所述配体的结合，和 c) 测定分析物与所述配体的结合以定量测定所述样品中的所述分析物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述配体为抗体。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中将所述配体固定化至固体支承体。
4. 根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述分析物选自蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、 蛋白L、及其衍生物，和其中所述样品包含IgG。
5. 根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述第一酸性pH选自在约1. 5至约 3. 2的范围内，和所述第二酸性pH选自在约2. 7至约4. 5、优选约2. 8至约4. 5的范围内。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述第一酸性pH选自在约2. 3至约2. 5的范围内 和/或所述第二酸性pH选自在约2. 8至约3. 2的范围内。
7. 根据权利要求4或5所述的方法，其中所述第二酸性pH选自在约3. 0至约3. 2的范 围内。
8. 根据权利要求1至7任一项所述的方法，其包括当测定所述分析物的浓度时使用响 应相对于分析物浓度的标准曲线，其中所述标准曲线使用包含分析物和能够与所述分析物 复合的至少一种物质的样品制备。
9. 根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述方法在微流体系统中进行。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述微流体系统包含在可旋转盘中，和其中流体 输送可通过离心力完成。
11. 一种试剂盒，其用于进行分析物的免疫测定，所述分析物至少部分以复合体形式存 在于流体样品中，所述试剂盒包括： 检测剂，其能够结合至所述分析物， 第一酸性缓冲液，其具有在约1. 5至约3. 2范围内的pH，和 第二酸性缓冲液，其具有在约2. 7至约4. 5范围内的pH。
12. 根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述分析物能够结合至固定化于固相的配 体，和其中所述试剂盒还包括针对所述分析物的捕获剂，其中所述捕获剂能够结合至所述 固相。
13. 根据权利要求11或12所述的试剂盒，其中所述捕获剂是生物素化的，且所述配体 为亲和素或链霉亲和素。
【专利摘要】公开了一种通过免疫测定来定量测定流体样品中分析物的方法，所述免疫测定包括将所述分析物与能够特异性结合所述分析物的配体结合，其中至少部分所述分析物作为分析物复合体存在。所述方法包括下述步骤：a)使所述样品处于第一酸性pH，从而至少实质上解离存在的任何分析物复合体并将实质上所有分析物以游离形式提供，b)将所述第一酸性pH升高至第二酸性pH，其中防止复合体的再形成，但其中允许分析物与所述配体的结合，和c)测定分析物与所述配体的结合以定量测定所述样品中的分析物。
【IPC分类】G01N33-84, G01N33-53
【公开号】CN104718453
【申请号】CN201380051645
【发明人】M·因加纳斯, P·莱赫托宁
【申请人】Gyros专利公司
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2013年10月3日
【公告号】EP2904393A1, US20150268238, WO2014055025A1