用于确定血清中游离铜的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于确定血清中的'游离'铜（血清铜的一部分在结构上不会结 合到血浆铜蓝蛋白，最近还称作'不稳定的'铜）的新的方法，特别地，涉及用于以高度的灵 敏度和准确度确定患有阿尔茨海默病的患者的血清样本中的游离铜的方法。本发明还涉及 一种用于确定血清中的游离铜的试剂盒，所述试剂盒包括过滤装置和香豆素荧光探针。
【背景技术】
[0002] 在大量的疾病（例如阿尔茨海默病（AD))中确定血清铜是首要的。阿尔茨海默病 是以记忆丧失和进行性痴呆为特征的神经障碍。晚期的疾病发作形式是散发性的并且具 有复杂的疾病病原学，伴随作为最广泛公认为危险因素的亲近和年龄。疾病的原因似乎与 0 _淀粉样蛋白（A0 )肽和神经原纤维缠结中的tau蛋白质类在大脑中的聚集紧密有关。 此外，载脂蛋白E(APOE)基因的e 4等位基因已被证实为增加阿尔茨海默病风险并且降低 发病年龄，尽管它仅占阿尔茨海默病遗传率（留下若干待鉴定的基因危害因素）的百分比 的比例。主张为最普及的阿尔茨海默病假说的'淀粉样蛋白级联'现在已经被采取多种形式 作为新的关于疾病形成的内容。实际上，已经假设了多样的发病机制的途径以贡献于阿尔 茨海默病发作和进展。例如，在涉及需要被作为靶子的疾病级联的致病途径中已经指出除 了 A0低聚物和有毒的tau聚集物之外，还包括氧化性损伤、异常的炎症或能量代谢受损。 有主要通过金属氧化还原反应的氧化性应激导致阿尔茨海默病大脑的损伤的充足的证据。 尤其，已经提出了 A0肽的高的金属化可以是氧化性应激的氧化还原循环的基础，并形成 H202产物、A0低聚体和沉淀物。产生不稳定的铜流动库的金属体内稳态的扰乱可供给大脑 铜储源，大脑铜储源能够参加A 0 -氧化性应激循环，对阿尔茨海默病级联产生多效性。这 种看法现在由说明铜在阿尔茨海默病中稍微而显著地增加，在没有结合到血浆铜蓝蛋白的 铜（还称作'游离'铜）的血清库中的具体且相对高的增加与阿尔茨海默病的典型的征兆 和脑脊髓液标记物相关的多个证据来支持，并且已经在诉说非常轻度认知损伤的受试者中 是明显的。虽然铜功能障碍不能够被臆断为作为疾病的唯一决定因素，但能够主张作为对 于阿尔茨海默病的重要危险因素作用的它的决定性（而不是相关）作用，因为它似乎由实 际临床证据、流行病学证据、实验性证据、荟萃分析（meta-analysis)证据和遗传学证据来 支持。
[0003] 在血液中血浆铜蓝蛋白是主要的铜运载蛋白质，在血清中血浆铜蓝蛋白是主要亚 铁氧化酶蛋白质，并且血浆铜蓝蛋白在结构上结合6个铜原子，形成活性整体-蛋白质的 形式，活性血浆铜蓝蛋白占循环铜的85-95%的比例，剩余的是游离铜。实际上，在先前的 研宄中，发明人过去曾经起始于铜和血浆铜蓝蛋白的测量来判断游离铜，伴随的计算如下： 血清铜浓度通过用通过使用装备有具有平台HGA 800的石墨炉的A Aanalyst 300Perkin Elmer原子吸收分光光度计的原子吸收光谱技术或根据Abe等Clin Chem 1989 (Randox Laboratories，Crumlin，UK)的比色法中的一个测量它们来双重检查；血衆铜蓝蛋白 是通过根据Wolf PI Crit Rev Clin Lab Sci 1982的免疫比池法试验（Horiba ABX， Montpellier，France)来分析的，对于每个血清铜和血衆铜蓝蛋白对，按照公开在Walsh等 Ann Clin Biochem 2003的标准程序，计算结合到血衆铜蓝蛋白（CB)的铜的量和未结合到 血浆铜蓝蛋白的铜（'游离'铜）的量。该计算以umol/L表达'游离'铜，并且基于血浆 铜蓝蛋白含有0. 3%铜的证据。
[0004] 此外，最近发明人根据先前的方法建立了自动化程序以测量血浆铜蓝蛋白氧化酶 活性，其利用邻联茴香胺二氢氯化物作为底物。实际上，众所周知，通过免疫学方法（如在 我们先前的研宄中示出的）获得的血浆铜蓝蛋白的值比那些采用酶（即监控蛋白质的氧化 酶活性）获得的值更高。这是因为脱辅基形式的浆铜蓝蛋白在生物学上不活泼。因此，来 自以上报道的方法和计算的游离铜的值被过低估计。
[0005] 然而，由于它的成本、商业上可利用的血浆铜蓝蛋白的可变的纯度以及在国际单 位中（UI)对报道血清酶的广泛的推荐，通过基于标准血浆铜蓝蛋白溶液的酶方法的血浆 铜蓝蛋白的定量还未被认为是本领域的现有技术。先前，发明人尝试用商业标准（人类血 清血浆铜蓝蛋白，Sigma-Aldrich)从蛋白质的氧化酶活性开始定量化血浆铜蓝蛋白的量， 但是后者的分光镜检查显示在逐日试验中的吸收的蛋白质峰值的衰退，降低了在使用酶的 探测定量化蛋白质的量中的置信度，且需要估计游离铜值。
[0006] Hyo Sung Jung等（J. Am. Chem. Soc. 2009)公开了用于确定生物体系中的游离铜的 不同的香豆素探针的合成和使用。
[0007] 本发明的范围是提供新的方法和试剂盒以直接测量在血清中的游离铜，避免在本 领域的方法中发生的游离铜的过低估计或过高估计。
【发明内容】
[0008] 本发明涉及一种在体外用于确定血清中的游离铜的方法和试剂盒。并且如在示例 中所示，发明人发现使用若干方法从全血分离血清时，发生10%和20%之间的游离铜的损 失。此外发明人发现使用不同的荧光探针与铜恰当地结合时，在探针和血清之间出现非特 异性的相互作用。
[0009] 在本文中描述的本发明基于选择若干参数使用过滤膜从全血分离血清并且选择 特殊类的关闭（switch-off)荧光探针用于探测游离铜。在通过本发明设定的条件下的香 豆素荧光探针的应用，允许以高度的准确性和灵敏性确定在血液样本中的游离铜，避免在 从全血分离血清期间游离铜的损失。
[0010] 因此，本发明的目的是一种用于在体外确定血液样本中的游离铜的浓度的方法， 包括如下步骤：
[0011] a)用具有在0. lym至0.5 ym之间的孔径的膜滤器使用在200微升每分钟和500 微升每分钟之间的过滤速度从所述样本的全血分离血清；
[0012] b)使用香豆素荧光探针确定从步骤a)获得的血液样本中游离铜的浓度。
[0013] 本发明的另一个目的是一种用于在体外确定游离铜的浓度的方法，用于在怀疑患 有阿尔茨海默病的患者中确认阿尔茨海默病的临床诊断，包括同样的步骤a)和b)以及进 一步包括将在步骤b)中确定的值与阈值（截止值（cut-off))比较的步骤c)，其中游离铜 的较高的浓度确认阿尔茨海默病的临床诊断。
[0014] 本发明的另一个目的是一种用于在体外确定游离铜的浓度的方法，用于预后患者 的阿尔茨海默病，其中对所述患者的随后时刻收集的血液样本重复所述方法的所述步骤a) 和步骤b)，并且评价在所述患者的所述血清样本中的游离铜的浓度随时间的进展。
[0015] 本发明的另一个目的是一种用于在体外确定游离铜的浓度的方法，用于在遭受轻 度认知损伤的患者中预测从轻度认知损伤（MCI)至阿尔茨海默病的转化，包括同样的步骤 a)和b)以及进一步包括将在步骤b)中确定的值与阈值（截止值）比较的步骤c)，其中游 离铜的较高的浓度表明从轻度认知损伤至阿尔茨海默病的所述转化。
[0016] 本发明的另一个目的是一种用于探测血清中的游离铜的试剂盒，包括具有孔径在 0. 1ym和0. 5ym之间的膜滤器的一个或多个过滤装置以及一种或多种香豆素荧光探针。
【附图说明】
[0017] 图1.在HEPES:DMS0 9:1中存在Cu++(l〇-4M)情况下的香豆素荧光探针7-(二乙氨 基）_2_氧代-N-((吡啶-2-基）甲基）-2H-色烯-3-甲酰胺的校准曲线（A ex= 430nm， 入 eni 490nM) 〇
[0018] 图2.与HEPES:DMS0 95:5 -起的Cu++(l〇-5M)存在下的香豆素荧光探针7-(二乙 氨基）-2-氧代-N-((吡啶-2-基）甲基）-2H-色烯-3-甲酰胺的校准曲线（A ex= 430nm， 入 eni 495nM) 〇
[0019]图3.受者作用特征（ROC)曲线。根据本发明的一个实施例分析了 702个样本。曲 线说明使用本发明能够以高特异性（80% )和离散的灵敏度（60% )获得阿尔茨海默病的 诊断。
[0020] 图4.示出用于本发明的一个实施例的过滤装置。
[0021] 图5.在受到阿尔茨海默病的影响的患者中根据游离血清铜水平预测简易精神状 态检查恶化的可能性的模型。圆圈代表患者的游离血清铜的值。线代表简易精神状态检查 E恶化的预测可能性的模型。在个别的阿尔茨海默病患者中游离铜水平以z-分数，即以从 它们的平均值的标准偏差的方式来表达。从目前的研宄小组，那些得到z-分数高于_〇. 138 的、对应于2. 1 ymol/L的游离铜值的患者，比那些得到他们的'游离'铜值低于这些水平的 患者，具有增加恶化的可能性。
[0022] 图6.游离铜使轻度认知损伤受试者与健康对照和患有阿尔茨海默病的患者区别 开。在考虑阿尔茨海默病组时