质谱仪鉴定血清中游离dna的方法、试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，涉及一种质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法、试剂盒及其应用。所述方法包括PCR反应、PCR产物纯化、单碱基延伸、延伸产物纯化、质谱仪检测的步骤；所述试剂盒包括PCR反应试剂、纯化试剂及单碱基延伸反应试剂。本发明相比于现有技术具有灵敏度高、特异性强、简便安全、速度快、高通量、更节约时间等优点。
【专利说明】质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法、试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法、试剂盒及其应用，具体而言是利用PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技术，选用Kras基因对血清中游离DNA进行检测的方法。
【背景技术】
[0002]游离循环核酸是一种存在于人的体液中的细胞外游离状态核酸。游离循环DNA的分子大小在500bp~30kb之间。正常人外周血中游离DNA主要来自细胞核DNA和线粒体 DNA，其含量较少，而肿瘤患者的外周血游离DNA主要来源于肿瘤细胞。
[0003]近年来，随着对游离核酸研究的不断深入，游离DNA的检测已经在疾病监控、胎儿产前诊断和肿瘤研究中取得众多进展。检测恶性肿瘤患者血液中游离DNA用于基因诊断已成为研究热点，且研究显示血液中游离DNA有可能成为一种新的肿瘤诊断及预后判断的标志物。游离DNA是存在于血液、滑膜液等体液中的细胞外游离DNA。研究发现许多肿瘤患者游离DNA与正常人相比有很大差异。游离DNA检测避免了当前分子诊断需要采集癌组织作为标本来源的困难，是一种有潜力的肿瘤标志物。
[0004]近年研究发现在外周血液中能够检测到早期肿瘤细胞逸出的突变DNA，成为良好的肿瘤诊断、治疗预后的生物标记。Kimura等(2006年)报道能够在循环血液中检测到Kras 突变，认为检测这些外周血液中的突变DNA，可以知道患者体内是否存在微小病灶、肿瘤手术后是否存在转移、靶向药物靶标位点的分子学特征等，从而作出相应治疗方案。因此，检测Kras基因的突变，还将有助于评价治疗效果，有助于对肿瘤发病风险进行预测，有助于对肿瘤转移进行早期诊断。
[0005]由于血液中游离DNA的含量很低，通常每毫升仅为纳克水平，已经大大超出传统的溴化乙啶染色和紫外分光光度仪等实验室常用的DNA定量方法的检测范围。而荧光定量 PCR方法涉及到荧光染料，容易引起假阳性。
[0006]申请号为200910177851.2的中国发明申请文件提供了一种检测KRAS基因和/或 BRAF基因的核苷酸突变位点的方法，该方法在一定程度上提高了检测的灵敏度和准确度， 但是其检测速度仍不能满足现状的需求。所以本领域需要一种不仅具有高灵敏度和准确度，而且能真正提高速度的检测游离DNA的方法。
【发明内容】
[0007]本发明提供一种高灵敏度、准确的检测游离DNA的方法，以克服现有技术的不足。 具体是一种质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法，该方法的技术原理为:利用联合PCR技术、 单碱基延伸技术和质谱检测技术，对血清中游离DNA进行检测；其中:在单碱基延伸过程中，对PCR的纯化产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在突变处分别延伸一个核苷酸，使得所延伸的核苷酸类型，分别与突变处的基因型相关；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，以质谱对待检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质，进而确定各突变处的基因型。
[0008]本发明目的是提供一种质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法，包括如下步骤:
(1)PCR反应:游离DNA中Kras基因进行PCR扩增，得到含Kras基因12密码子和13 密码子区域的PCR产物；所述PCR扩增是用序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2的PCR引物进行扩增；
(2)PCR产物纯化:对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；
(3)单碱基延伸:使用iPLEXPro酶、ddATPs、ddCTPs、ddTTPs和特异性的延伸引物，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对；所述特异性的延伸引物为SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5 中的任一条或几条；
(4)延伸产物纯化:对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化；以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；
(5)质谱仪检测:将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测。
[0009]上述方案中优选的是，步骤(1)中所述突变的基因名12S、12R、12C、12D、12A、12V、 13D中的任一种或几种，所述12S、12R、12C、12D、12A、12V、13D基因序列分别为AGT-GGC， CGT-GGC, TGT-GGC, GAT-GGC, GCT-GGC, GTT-GGC, GGT-G^C，带下划线的为突变后的碱基。
[0010]上述任一方案中优选的是，步骤(1)中所述引物I和引物2的5’端都增加3-15个保护碱基序列，以使PCR引物的分子量增大，从而避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果。
[0011]上述任一方案中优选的是，所述引物I和引物2的5’端都增加的保护碱基序列为:ACGTTGGATG。
[0012]上述任一方案中优`选的是，步骤(1)中所述PCR扩增是用dNTPs、MgCl2进行扩增， 所述 dNTPs 为 dATP、dTTP, dGTP、dCTP。
[0013]上述任一方案中优选的是，步骤(1)中所述PCR扩增是用Taq酶进行扩增。
[0014]上述任一方案中优选的是，步骤(1)中所述PCR扩增经变性、退火、延伸三个步骤； 所述变性温度为95°C，所述退火温度为56°C，所述延伸温度为72°C。
[0015]上述任一方案中优选的是，所述变性时间为10秒，所述退火时间为10秒，所述延伸时间为30秒。
[0016]上述任一方案中优选的是，步骤(2)中所述PCR产物纯化是利用SAP酶纯化。
[0017]上述任一方案中优选的是，所述SAP酶纯化是先在温度为37°C下纯化45分钟，然后在温度为85°C下15分钟使SAP酶高温失活。
[0018]上述任一方案中优选的是，步骤(3)中所述单碱基延伸经过变性、退火、延伸三个步骤，所述变性温度为94°C、退火温度为52°C、延伸温度为72°C。
[0019]上述任一方案中优选的是，所述变性时间为5秒、退火时间为5秒、延伸时间为5秒。
[0020]上述任一方案中优选的是，步骤(4)中所述延伸产物纯化是向延伸产物中加入纯化水和树脂，混匀后纯化。[0021]上述任一方案中优选的是，所述纯化时间为30分钟。
[0022]上述任一方案中优选的是，步骤(5)中所述质谱仪检测是利用飞行时间质谱仪对点样后的靶片进行检测和结果判断。
[0023]上述任一方案中优选的是，所述飞行时间质谱仪包括激光器、真空系统、质量分析器、电子数据系统、系统状态检测卡、触摸屏电脑、样品室和数据处理系统。
[0024]上述样品室的第一个作用是作为放取、承载靶板的工具，它能够确保靶板可以在短时间内方便的放取，并平稳的固定在底座上；第二个作用是辅助保持仪器真空度，防止飞行管中的真空环境被放取靶板的开放性的过程破坏；第三个作用是精确定位和靶板微距移动，通过微距步进电机的使用，可以使靶板进行微距移动以达到选择靶环上不同靶点的目的。
[0025]上述任一方案中优选的是，所述激光器为氮气激光器、半导体激光器、光纤激光器中的任一种。
[0026]上述任一方案中优选的是，所述光纤激光器是用掺稀土元素的玻璃光纤作为增益介质的激光器。光纤激光器拥有制造成本低及其光纤的可饶性所带来的小型化、集约化优势；它所采用的玻璃材料具有散热快，转换效率较高，激光阈值低的特点；而且光纤激光器的谐振腔内无光学镜片，具有免调节、免维护、高稳定性的优点；同时它还拥有很高的电光效率，综合电光效率高达20%以上。
[0027]上述任一方案中优选的是，所述氮气激光器包括脉冲激光器和激光光路。60Hz激光器的使用能使数据更快的生成，间接地提高了仪器的分析速度。
[0028]上述任一方案中优选的是，所述激光光路采用自动对焦。
[0029]上述任一方案中优选的是，所述自动对焦是通过光学透镜的组合使激光斑点在 50um至200um之间可调。这样就能充分满足不同样品的实验需求，能使激光斑点大小与共振结晶体的大小相匹配，确保获得全面的离子信息。该激光光路设计方案所提供的对焦范围是同类产品中最宽的。
[0030]上述任一方案中优选的是，所述真空系统包括差动抽取泵。样品在离子化过程和后续的离子自由飞行过程中均需要较高水平的真空度。在离子源中，`电离过程需要10_5Pa 的高真空度以避免放电现象发生；在飞行管中则需要高达10_6Pa的真空度以避免离子飞行时和气体小分子碰撞而造成能量损失。在真空系统上采用了先进的真空差动抽取泵的方案，即在两台串联的真空泵的作用下形成梯度真空差，以差动抽取的方式快速的形成高真空环境。这种先进的抽真空方式可以保证飞行管内的真空环境不受离子源的压强变化而波动，提高了仪器的分辨率和灵敏度。
[0031]上述任一方案中优选的是，所述差动抽取泵包括分子涡轮泵和隔膜泵。
[0032]上述任一方案中优选的是，所述质量分析器包含延时提取装置、飞行管、检测器和控制电路。质量分析器是基质辅助激光解析仪的一个关键部件，它的好坏决定了仪器分离样本的能力，是科学仪器分辨率和准确度的关键。
[0033]上述任一方案中优选的是，所述电子数据系统包含了数据信号转换板、信号输入输出控制主板、信号输入输出控制副板、信号获取与传输控制板、高低电压控制板。信号会由离子到达检测器的次数和顺序的最初始状态经放大器放大并传输到信号获取与传输控制板，经数据信号转换板运算和拟合后生成表达谱图谱。数据分析处理系统需要较高的电子电路设计基础和对表达谱信号的深刻理解，电路设计的小型化也需要对电子器件排布有较高的认识，还需要避免高集成度设计对板路系统稳定性带来的干扰。具体技术路线为: (I)采用微通道板作为信号放大器；(2)使用高通量的数据转化和处理设计；(3)制作小型化，集成度高的数据板路系统。
[0034]微通道板的使用可以提高仪器的灵敏度。高通量的转化和处理设计可以使检测信号快速的得到接收和分析，减少数据溢出的发生。小型化，集成度高的数据板路系统可以使仪器进一步缩小仪器整体尺寸，降低仪器功耗。
[0035]数据板路系统需要较高的电子电路设计基础和对表达谱信号的深刻理解，电路设计的小型化也需要对电子器件排布有较高的认识。在原有基础板路上的重排和集成是整个系统的关键，高集成度的设计会对板路系统的稳定性带来一定的困难。
[0036]上述任一方案中优选的是，所述系统状态检测卡包括集成电路板和检测系统；系统状态检测卡可以用来随时检测多个系统的运行状态，并做出简单的问题判断。具体技术路线为:(1)为不同的系统如真空系统，控制系统，进样系统等设计检测接口 ；(2)设计系统状态检测卡并集成通路开关并开发相应的底层检测软件。
[0037]设计出能正确反馈各系统状态的集成电路板和具有简单判断能力的检测系统需要对各个系统的信号传输和控制深入了解，需要预分析可能出现的问题并为这些问题的状态设计反馈读取和判断方案。
[0038]上述任一方案中优选的是，所述触摸屏电脑安装在质谱仪机箱内部，直接与质谱仪数据输出端连接，并与质谱仪共享电源触摸屏电脑。与基质辅助激光解析科学仪器共享电源以提高整体集成度，同时使操作更加方便简单。
[0039]上述任一方法在鉴定血清中游离DNA的过程中的应用。
[0040]上述任一方法在检测基因突变时的应用。
[0041]本发明的另一目的是提供一种鉴定血清中游离DNA的试剂盒，该试剂盒用于鉴定血清中游离DNA的方法中，所述试剂盒包括:
(1)PCR反应试剂，包括:PCR引物、耐高温的DNA聚合酶、dNTPs、PCR反应缓冲液、 buffer ;所述 PCR 引物为 SEQ ID No:1 和 SEQ ID No:2 ；
(2)PCR产物纯化试剂；
(3)单碱基延伸反应试剂，包括:延伸引物、耐高温的单碱基延伸酶、ddNTPs、延伸反应缓冲液；所述耐高温的单碱基延伸酶是iPLEX Pro酶；所述延伸引物为SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5中的任一条或几条。
[0042]上述案中优选的是，所述耐高温的DNA聚合酶为Taq酶。
[0043]上述任一方案中优选的是,所述PCR反应缓冲液为Tris-CL缓冲液。
[0044]上述任一方案中优选的是，所述PCR引物的5’端包含有保护碱基，所述保护碱基序列为5-15个碱基序列。
[0045]上述任一方案中优选的是，所述保护碱基序列为ACGTTGGATG。
[0046]上述任一方案中优选的是，所述PCR产物纯化的试剂为碱性磷酸酶、碱性磷酸酶和外切酶Exo1、电泳凝胶回收试剂、PCR产物纯化柱中的任一种或几种。其中当包括碱性磷酸酶和外切酶ExoI的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。
[0047]上述任一方案中优选的是，所述试剂盒还包括外切酶、点样及质谱检测用靶片、基因组DNA提取试剂等试剂。
[0048]上述任一方案中优选的是，所述基因组DNA提取试剂包括细胞裂解液、蛋白酶、纯化液、漂洗液。
[0049]上述任一种检测试剂盒在鉴定血清中游离DNA的方法中的应用。
[0050]本发明优点如下:
1.灵敏度高:本发明综合了 PCR、单碱基延伸、质谱检测等技术为一体，既可通过PCR技术放大检测模板，又可通过质谱技术检测微量样本，综合了两种技术的优点，远远优于单独使用PCR检测基因突变，因此它的检测灵敏度很高。
[0051]2.特异强:单碱基延伸又称为“微测序”，使用特异性探针对DNA分子进行识别，具有测序技术的高准确性，特异性好、假阳性低等特点；特别的，不同于测序技术延伸数百个碱基，该技术仅延伸单个碱基，出错概率更低。
[0052]3.简便安全:操作简单、安全、自动化程度高、防污染。
[0053]4.相比于现有的技术:速度快、高通量，更节约时间，可在3.5小时左右内完成数百个样本的检测。
5.本发明中采用的质谱仪基于紫外光纤激光器的创新离子源设计，实现能量输出更稳定，更高离子化效率，并延长使用寿命；采用创新的离子推斥技术的高真空度飞行管设计， 在离子加速前对影响测量精度的离子初速度和方向进行校正，同时通过引入二阶无网离子反射器增加离子的飞行时间，大幅提高仪器的分辨率；采用人机交互更便捷的触摸屏一体机设计，降低仪器的应用难度，拓展仪器的应用范围；基于高集成度的电子电路系统，设计创新的仪器故障检测卡，便于仪器使用维护。在进行鉴定血清中游离DNA的过程中提高了对点样后的靶片检测的速度，也提高了对结果判断的灵敏度和准确度。
[0054]本发明中相关术语定义 本发明中，所述 Kras 基因即为 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog ;所述 iPLEX Pro 酶即为 ThermoSequenase。
[0055]本发明提供了一种联合PCR、单碱基延伸和质谱检测等技术，检测血清中游离DNA 的方法。其原理在于:
在PCR步骤中，通过设计并使用合适的引物从而扩增Kras基因12、13密码子所在DNA 片段。
[0056]在单碱基延伸步骤中，对上一步PCR的产物依次进行纯化和多重单碱基延伸。其中，延伸引物共3条，分别与7个突变位点对应，并在对应的突变位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与突变位点处的基因型互补配对(如某突变位点处是A基因型，将在对应的延伸引物上延伸T核苷酸)。在单碱基延伸步骤中，采用ddNTP代替dNTP，因此，在延伸一个碱基后，延伸引物将终止延伸。本发明中不加入野生型对应的碱基，只加入其余三种碱基，很大程度上增强突变型对应的峰高，提高质谱检测的灵敏度。
[0057]在质谱检测过程中，单碱基延伸产物在脱盐纯化后，点至含基质的靶片，并在真空环境中被激光激发，通过飞行管至检测器。不同物质通过飞行管的时间与它们的分子量呈负相关，即分子量越大，飞行速度越慢，到达检测器的时间越晚。)
术语“单碱基延伸”，又被 称之为微测序(mini sequence)，指在体系中加入延伸引物和 ddNTP, ddNTP与延伸引物的3’端连接形成延伸产物(即引物延伸了一个碱基)，根据碱基互补配对原则，由SNP位点处基因型决定具体连接何种ddNTP，这个过程类似于PCR过程中 dNTP根据互补链的碱基组成，逐个添加到PCR引物上。由于“ddNTP”与普通dNTP不同的是，在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，不能同后续的ddNTP形成磷酸二酯键，因而，延伸引物仅在SNP位点处连接一个ddNTP，而不能像PCR那样，不断的往下延伸，因此称之为单碱基延伸。单碱基延伸与测序过程非常相似，测序体系中加入的是dNTP和ddNTP的混合物， 测序引物连接dNTP后将继续延伸，只有连接ddNTP后，方终止延伸，因此测序产生的是长短不一的核苷酸片段的混合物；单碱基延伸体系中加入只有ddNTP，延伸引物只能连接一个 ddNTP,并终止延伸，因此单碱基延伸产生的是延伸引物仅延伸一个碱基的核苷酸片段。
[0058]术语“ddNTP”是一种修饰后的核苷酸，本技术方案共采用三种，它们之间存在分子量差异，ddATP、ddCTP、ddTTP 的分子量分别是 271.2Da、247.2Da、327.1Da，修饰后的 ddITP 的分子量比未修饰的大64.QlDa0当延伸引物根据突变位点的基因型而延伸不同的核苷酸， 将形成分子量差异。通过质谱检测，可分辨出这种差异。例如，某突变位点若是C/T，对应的延伸引物长度为20个碱基(分子量6275.1Da)，当该突变位点处是T基因型，延伸引物将延伸一个A核苷酸并终止延伸，形成21个碱基长、分子量6546.3Da的延伸产物，当该突变位点处是C基因型，延伸引物不延伸，分子量6562.3Da处无延伸产物。即对该突变位点的该实验方案，T基因型对应6546.3Da的质谱峰，C基因型对应6562.3Da的质谱峰。在实际检测过程中，使用者可通过软件对6275.1Da,6546.3Da、6562.3Da三处进行观察:若6275.1Da 处出现质谱峰，则是有部分或全部延伸引物没有与ddNTP结合；不论6275.1Da处是否出现质谱峰，若6546.3Da处出现质谱峰，则该突变位点的基因型为T，若6546.3Da 处质谱峰未出现，则说明没有发生突变。
[0059]SNP:即单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
[0060]SAP 酶:(即为 Shrimp Alkaline Phosphatase, SAP)虫下喊性憐酸酶。
[0061 ]术语 12S、12R、12C、12D、12A、12V 分别是 Kras 基因 12 密码子突变体 AGT、￡GT、IGT、 GAT, GCT, GlT的通俗叫法。
[0062]术语13D是Kras基因13密码子突变体G^C的通俗叫法。
[0063]Taq酶:Taq酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus (Taq)中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。
[0064]术语“保护碱基”，指在PCR引物的5’端额外增加的碱基。由于保护碱基的序列使得PCR引物(即核心引物)的分子量增大，可以避免反应剩余的PCR引物进入质谱检测窗口， 以避免干扰检测效果。此外，延伸引物的5’端也可以适量增加碱基序列，但其作用并非如同PCR引物的保护碱基，使其超出检测窗口，而是适当调整延伸引物的分子量，使延伸引物及其产物在检测窗口内处于一个合理的位置。例如，当两个基因多态位点对应的延伸引物及产物的分子量接近时，通过给其中一个延伸引物增加碱基，改变引物及其产物的分子量， 与其他延伸引物及产物的分子量之间拉大差距，以避免局部区域质谱峰过于集中而产生干扰和分辨不清，从而提高检测效果。因此，增加碱基后的延伸引物及产物的分子量，一定不会超出检测窗口。上述延伸引物的额外碱基可称为引物接头。
[0065]碱性磷酸酶:其作用是降解PCR反应后体系中残余dNTP，其原理是使dNTP的5’ -P 末端转换成5’-OH末端，从而失去与引物结合使引物延伸的能力，避免了对下一步单碱基延伸的影响。
[0066]外切酶Exo1:其作用是从单链DNA的一端开始按序催化水解组成DNA的dNTP之间3，5-磷酸二酯键，使单链DNA最终水解为dNTP。在本技术方案中用于降解PCR反应后残余的PCR引物。由于外切酶可以将单链的PCR引物切除，并不会在检测窗口中出现，因此使用该外切酶时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。
[0067]术语“检测产品”，指用于检测SNP位点基因型的任何常规产品，包括:检测试剂、 检测芯片、检测载体，以及检测试剂盒等。 [0068]术语“纯化”，指用于减少待检体系内其他物质对后续反应的影响的处理步骤。本发明的PCR产物纯化有两种方式:一是分离杂质并丢弃，二是使杂质失去活性。其中，切胶纯化、过纯化柱等都是通过电泳、纯化柱等分离杂质，并回收相对较纯的PCR产物，可以认为是第一种纯化方式，该方式一般耗时，操作复杂，特别是样本量大时；碱性磷酸酶的作用是降解(亦称“消化”)dNTP，使之不能继续作为DNA聚合酶或单碱基延伸酶的底物参与PCR 或单碱基延伸反应，从而不干扰后续反应，可以认为是第二种纯化方式。应当指出的是，单独的外切酶ExoI不起纯化作用，当它与碱性磷酸酶混合使用时，其作用是预先将单链DNA (在反应完成后的PCR产物体系中，主要是剩余的PCR引物)降解成dNTP，再由碱性磷酸酶使 dNTP继续降解。由于PCR引物被降解，不会进入最后的质谱检测步骤，因此，如果计划纯化步骤中增加ExoI外切酶处理，那么无需使用具有保护碱基的PCR引物。此外，在单碱基延伸步骤之前，由于外切酶和碱性磷酸酶都通过高温失活，其不会降解在单碱基延伸步骤中加入的单链的延伸引物、ddNTP等，因此避免对后续实验产生影响。
[0069]术语“检测窗口”，指可用于质谱检测核苷酸分子量的范围，通常涉及引物的设计参考范围。其中，在设计延伸引物时，对于不同的SNP位点，根据这些位点所在DNA区域的序列特点，以及SNP位点的基因型，可以设计出分子量不同的延伸引物和延伸产物，避免不同延伸引物及产物之间由于分子量接近而存在干扰，从而可在一个相对宽阔的检测窗口， 如4000-9000Da，实现对多个SNP位点的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0070]图1为实施例1中按照本发明所述的质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法中对Kl 样本的检测结果。
[0071]图2为实施例1中按照本发明所述的质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法中对K2 样本的检测结果。
[0072]图3为实施例1中按照本发明所述的质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法中对K3 样本的检测结果。
[0073]图4为实施例1中按照本发明所述的质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法中对K4 样本的检测结果。
[0074]图5为实施例1中按照本发明所述的质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法中对K5 样本的检测结果。
[0075]图6为实施例1中按照本发明所述的质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法中对K6 样本的检测结果。
[0076]图7为实施例1中按照本发明所述的质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法中对K7样本的检测结果。
[0077]图8为实施例1中按照本发明所述的质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法中对K8 样本的检测结果。
[0078]图9为实施例1中按照本发明所述的质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法中对K9 样本的检测结果。
[0079]图10为实施例1中按照本发明所述的质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法中对KlO 样本的检测结果。
【具体实施方式】
[0080]为了进一步了解本发明的技术特征，下面结合具体实施例对本发明进行详细地阐述。实施例只对本发明具有示例性的作用，而不具有任何限制性的作用，本领域的技术人员在本发明的基础上作出的任何非实质性的修改，都应属于本发明的保护范围。
[0081]实施例1
一种质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法，包括如下步骤:
(1)PCR反应:游离DNA中Kras基因进行PCR扩增，得到含Kras基因12密码子和13 密码子区域的PCR产物；所述Kras基因是12和/或13密码子发生突变的基因，所述PCR 扩增是用PCR引物I和/或PCR引物2进行扩增；
(2)PCR产物纯化:对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；
(3)单碱基延伸:使用iPLEXPro酶、ddATPs、ddCTPs、ddTTPs和特异性的延伸引物，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对；所述特异性的延伸引物为SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5 ；
(4)延伸产物纯化:对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化；以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；
(5)质谱仪检测:将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测。
[0082]在本实施例中，步骤(1)中所述游离DNA的提取:结直肠癌术后患者10例，采集静脉血，分离血清(约 2ml),米用 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen,货号为55114)提取该患者血清中的游离DNA，编号K1-K10，-20°C备用。所述突变的基因名为 12S、12R、12C、12D、12A、12V、13D，所述 12S、12R、12C、12D、12A、12V、13D 基因序列分别为 AGT-GGC, CGT-GGC, TGT-GGC, GAT-GGC, GCT-GGC, GTT-GGC, GGT-GAC,带下划线的为突变后的喊基。
[0083]在本实施例中， 用于PCR、PCR产物纯化和单碱基延伸的组分如表1:
表1
【权利要求】
1.一种质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法，包括以下步骤:(1)PCR反应:游离DNA中Kras基因进行PCR扩增，得到含Kras基因12密码子和13 密码子区域的PCR产物；所述PCR扩增是用序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2的PCR引物进行扩增；(2)PCR产物纯化:对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化；(3)单碱基延伸:使用iPLEXPro酶、ddATPs、ddCTPs、ddTTPs和特异性的延伸引物，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对；所述特异性的延伸引物为SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5 中的任一条或几条；(4)延伸产物纯化:对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化；(5)质谱仪检测:将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测。
2.如权利要求1所述质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中所述 Kras 基因为 12S、12R、12C、12D、12A、12V、13D 中的任一种或几种，所述 12S、12R、12C、12D、 12A、12V、13D 基因序列分别为 AGT-GGC、CGT-GGC, TGT-GGC, GAT-GGC, GCT-GGC, GTT-GGC, GGT-GAC0
3.如权利要求1所述质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中所述引物I和引物2的5’端都增加3-15个保护碱基序列。
4.如权利要求3所述质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法，其特征在于，所述引物I和引物2的5’端都增加的保护碱基序列为:ACGTTGGATG。
5.如权利要求1所述质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中所述 PCR 扩增是用 dNTPs、MgCl2 进行扩增，所述 dNTPs 为 dATP、dTTP、dGTP、dCTP。
6.如权利要求1所述质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中所述 PCR扩增是用Taq酶进行扩增。
7.如权利要求1所述质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中所述 PCR扩增经变性、退火、延伸三个步骤；所述变性温度为95°C，所述退火温度为56°C，所述延伸温度为72°C。
8.一种鉴定血清中游离DNA的试剂盒，包括:(1)PCR反应试剂，包括:PCR引物、耐高温的DNA聚合酶、dNTPs、PCR反应缓冲液、 buffer ;所述 PCR 引物为 SEQ ID No:1 和 SEQ ID No:2 ；(2)PCR产物纯化试剂；(3)单碱基延伸反应试剂，包括:延伸引物、耐高温的单碱基延伸酶、ddNTPs、延伸反应缓冲液；所述耐高温的单碱基延伸酶是iPLEX Pro酶；所述延伸引物为SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5中的任一条或几条。
9.如权利要求8所述的鉴定血清中游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述耐高温的DNA 聚合酶为Taq酶。
10.如权利要求8所述的鉴定血清中游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应缓冲液为Tris-CL缓冲液。
【文档编号】C12Q1/68GK103602740SQ201310585113
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】张学记, 马庆伟, 张海燕, 林燕 申请人:毅新兴业（北京）科技有限公司