研究所，货号M030 ;
[0151] 4)极低密度脂蛋白溶液：称取4. Omg极低密度脂蛋白溶于4. OmLO. OlM pH9. 0硼 酸盐缓冲液中，充分振荡溶解，配制成1.0 mg/mL的极低密度脂蛋白溶液；
[0152] 5)透析袋的截留分子量14000,购买自Bioshop Inc ;
[0153] 透析袋的预处理：将透析袋放入500mL的EDTA-NaHCO3溶液中，煮沸IOmin ;倾弃 EDTA-NaHC03溶液，用CldH2O轻轻漂洗，再用500mL5mmol/L EDTA煮沸IOmin ;弃掉煮沸液，彻 底用CldH2O清洗，加入大量的CldH2O浸泡透析袋4°C过夜。使用时，戴上手套，取出透析袋， 用大量的CldH2O彻底冲洗其内外表面；
[0154] A)铬-极低密度脂蛋白鳌合物的合成：在提纯源于人体的极低密度脂蛋白或按照 生物学方法重组的极低密度脂蛋白中加入铬离子进行螯合反应，得到反应溶液，具体操作 步骤如下；
[0155] 1)取 2. Omg ITCBE 溶于 2mLDMS0 中；
[0156] 2)缓慢将步骤1制备的液体加入极低密度脂蛋白溶液中，边滴加边震荡，于25°C， lOOr/min的摇床中作用24h，然后用透析袋透析24h，除去未与极低密度脂蛋白结合的 ITCBE ；
[0157] 3)将透析所得的液体用lmol/L HCl调节pH值至7. 0,然后缓慢逐渐滴加80 μ 1 lmmol/L铬离子溶液，边滴加边振荡，以免铬离子使蛋白变性沉淀；
[0158] 4)将加好的溶液在25°C，100r/min的摇床中反应2h，用处理好的透析袋进行透析 24h ；
[0159] 5)将透析好的液体于-20°C分装保存，得到铬-极低密度脂蛋白螯合物的反应溶 液。
[0160] B)铬-极低密度脂蛋白螯合物纯化：采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液 中未反应的极低密度脂蛋白、特异性抗体和铬离子，即得铬-极低密度脂蛋白螯合物，具体 包括以下步骤：
[0161] (1)溶解样品：将上述步骤A)的铬-极低密度脂蛋白螯合物溶解于生理盐水中， 得铬-极低密度脂蛋白螯合物的溶液；
[0162] (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与极低 密度脂蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0163] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)的溶液，然后上柱，使极低 密度脂蛋白与填料特异性结合；
[0164] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0. lOmol/L的 Na2HP0j§液进行洗脱；
[0165] (5)收集：收集步骤（4)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0166] (6)透析：将步骤（5)的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次后，4°C透 析过夜，收集样本；
[0167] (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与铬特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0168] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(6)中样本，然后上柱；
[0169] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的 Na2HP0j§液进行洗脱；
[0170] (10)收集：收集步骤（9)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0171] (11)透析：将步骤（10)的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次后，4°C 透析过夜，收集样本，即得铬-极低密度脂蛋白螯合物。
[0172] C)对铬-极低密度脂蛋白鳌合物的鉴定，具体步骤如下：
[0173] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶作为介质制备胶床；
[0174] (2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的铬-极低密度脂蛋白螯合物，复溶于生理 盐水中，得铬-极低密度脂蛋白螯合物的溶液，取8 μ L前述溶液，加入2 μ L上样缓冲液，并 混匀，然后加样于样品槽中；
[0175] (3)电泳：连接电泳板，加电泳缓冲液进行电泳；电泳过程中，电流为22mA恒流，环 境温度为4°C ;至溴酚蓝移至胶底部时停止电泳，图1为本发明所述铬-极低密度脂蛋白鳌 合物的非变性电泳条带图，M泳道为变性Marker，VLDL泳道为极低密度脂蛋白；
[0176] (4)检测：在胶床上找出含铬的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶解， 然后再采用ICP-MS或AAS检测是否含有铬以及检测铬的含量。
[0177] D)鉴定结果
[0178] 1)AAS检测结果
[0179] 取步骤C)分离出的蛋白条带溶液，以石墨炉原子吸收光谱法（AAS)初步测定极低 密度脂蛋白中重金属铬的含量，如下表所示，以NaCl溶液、KBr溶液、KCl溶液为空白对照；
[0180] 表1极低密度脂蛋白中铬的含量
[0181]
[0182]
[0183] 2)同步辐射X荧光分析
[0184] 蛋白条带内微量元素含量的SRXRF分析在北京正负电子对撞机（BEPC)的4W1〃 同步辐射束线上完成。储存环中电子束流能量为2. 2GeV，束流强度100mA。样品移动台 (TSA200型，北京卓立汉光公司）可在计算机控制的步进马达驱动下沿X、Y二维方向上移 动以改变入射光斑位置，移动步长为〇. 〇〇25_。从样品发射出的X射线由Si (Li)探测器 (PGT Inc.LS30143-DS)探测，探头与入射SR线共平面且相互垂直，距样品照射点20mm，信 号用PGT多道分析仪（MCA 4000)获取输出。用11. 5keV的单色同步辐射光激发样品，调节 入射光斑（lmmx 3mm)位置使之处于条带一端，在300s的测定时间内，光斑一直沿条带均勾 缓慢移动，计数结束时光斑移到该条带另一端。沿电泳方向每Imm取一个谱。采用AX IL 软件处理数据，并用来源于空气且含量恒定的Ar信号峰对其它元素峰进行归一处理，以抵 消束流强度变化对信号强弱产生的影响。在相同的条件下以同样的方式测量定量标准干胶 膜的荧光谱。
[0185] 图2为本发明所述的铬-极低密度脂蛋白螯合物的电泳条带的同步辐射X线荧光 分析图，图中横坐标为蛋白条带位置，纵坐标为该条带铬金属能量（含量）值。
[0186] 检测条件的确宙
[0187] 1.抗极低密度脂蛋白抗体、抗Cr抗体最佳工作浓度以及血浆的最佳稀释倍数的 确定。
[0188] 酶联免疫法检测铬-极低密度脂蛋白螯合物的方法，具体包括以下步骤：
[0189] 1)包被：将抗极低密度脂蛋白抗体蛋白包被于固相载体上，分别用稀释缓冲液将 包被蛋白以1 :500、1 :1000、1 :2000、和I :4000的倍比稀释，加入ELISA板微孔中，每个浓度 包被三排，4°C保存18小时；
[0190] 2)封闭：移去稀释缓冲液，洗涤，加入封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，洗 涤；
[0191] 3)加待测样本：用稀释缓冲液将待测血浆样本按1 :10、1 :20、1 :40的倍比稀释， 加入微孔中，以已知含量的铬-极低密度脂蛋白螯合物作标准品，设置阴性对照和空白对 照，加入微孔中，37°C作用1小时；
[0192] 4)加二抗：移去待测血浆样本，洗涤，加入用稀释缓冲液按1 :5000、1 :10000、1 : 20000、I :40000的倍比稀释的抗Cr抗体，37°C作用1小时，使其与极低密度脂蛋白上的金 属铬反应；
[0193] 5)加酶标：移去抗Cr抗体，洗涤，加入用稀释缓冲液稀释至抗体含量为2 μ g/mL 的HRP酶标抗体，37°C作用1小时，使其与抗Cr抗体反应；
[0194] 6)底物温育：移去酶标抗体，洗涤，加入底物，37°C避光作用30min，加入终止液；
[0195] 7)检测：于450nm波长下在酶标仪上分别读取标准品、待测血浆、阳性对照、阴性 对照和空白对照样本的OD值。
[0196] 本实施例中，采用本发明提供的铬-极低密度脂蛋白螯合物标准品作为阳性对 照，分别以不加待测血浆作为阴性对照1，即依次加入了抗极低密度脂蛋白抗体、封闭液、抗 Cr抗体、酶标和底物；
[0197] 以不加抗Cr抗体的对照试验组作为阴性对照2,即依次加入了抗极低密度脂蛋白 抗体、封闭液、待测血浆、酶标和底物；
[0198] 以不加酶标的对照试验组作为阴性对照3、即依次加入了抗极低密度脂蛋白抗体、 封闭液、待测血衆、抗Cr抗体和底物；
[0199] 以同时不加待测样本和抗Cr抗体的对照试验组作为阴性对照4,即依次加入了抗 极低密度脂蛋白抗体、封闭液、酶标和底物；
[0200] 以不加抗极低密度脂蛋白抗体作的对照试验组为空白对照1，即加入了封闭液、待 测血浆、抗Cr抗体、酶标和底物；
[0201] 以及以只加底物的对照试验组为空白对照2,以只加 PBS的对照试验组为空白对 照3。
[0202] 表2为不同抗极低密度脂蛋白抗体稀释倍比、血浆稀释倍比、抗Cr抗体稀释倍比 的样本OD值数据，
[0203] 表2不同抗极低密度脂蛋白抗体、抗Cr抗体以及血浆稀释倍比下的检测结果
[0206] 从表2可知，抗极低密度脂蛋白抗体的稀释倍比为1:1000时，样本OD值大于平行 条件下的其它抗极低密度脂蛋白抗体的稀释倍比；该组样本中，血浆稀释倍比为1:20时， 抗Cr抗体稀释倍比为1:5000时，OD值最大，为0. 707。
[0207] 表3为抗极低密度脂蛋白抗体的稀释倍比为1:1000、血楽;稀释倍比为1:20、抗Cr 抗体稀释倍比为1:5000时相对应的阳性对照、阴性对照和空白对照的OD检测值，
[0208] 表3阳性对照、阴性对照及空白对照的检测结果
[0209]
[0210] 从表3可知，阴性对照组OD检测值小于0. 1，说明该优化条件下，本方法的系统误 差性小，满足分析方法要求，所以选此值所对应的浓度作为最佳工作浓度。
[0211] 2. ELISA洗脱液最佳工作浓度及洗脱时间确定
[0212] 为寻求最适宜的洗脱条件，通过酶联免疫法在抗Cr抗体与酶标抗体温育后，以不 同浓度的洗脱液进行洗脱，再通过酶标仪检测OD值，具体步骤如下：
[0213] (1)包被：将抗Cr抗体蛋白包被于固相载体上，用稀释缓冲液按I :5000的倍比稀 释，加至ELISA板微孔中，4°C保存16小时；
[0214] ⑵封闭：移去稀释缓冲液，洗涤后，加封闭液，37°C放置1小时，移去