封闭液，并洗 涤；
[0215] (3)加酶标抗体：移去封闭液，洗涤后，加入用稀释缓冲液稀释至抗体浓度为 2 μ g/mL的HRP酶标抗体，37°C作用2小时，使其与抗Cr抗体反应；
[0216] (4)洗脱：移去酶标抗体，用稀释缓冲液对洗脱液进行稀释，使洗脱液中木瓜蛋白 酶的浓度：酶标抗体中抗体的浓度=1:5、1:10、1:20、1:40、1:80的倍比将洗脱液加入微孔 中，每个浓度作3个复孔，分别放置于37°C下作用lh、2h、3h ;移去洗脱液，洗涤，待洗涤完成 后，加入底物，37°C避光作用30分钟，加终止液终止反应；
[0217] (5)于450nm的检测波长下在酶标仪上分别读取每个微孔的OD值，具体结果参见 表4，
[0218] 表4不同洗脱液稀释倍数下的检测结果
[0219]
[0220] 通过比较OD值，以判断ELISA孔壁上结合的抗Cr抗体-酶标抗体复合物洗脱程 度，当OD值最低时，抗Cr抗体-酶标抗体复合物洗脱程度达到最大。如表4所示，当洗脱 液中木瓜蛋白酶的浓度：酶标抗体中抗体的浓度=1:20时，洗脱程度最大；而作用时间为 lh、2h、3h时，各组OD值变化不大，可见随着时间的延长，酶活力逐渐减弱，在酶浓度不变的 情况下，延长消化时间并不能提高消化率，所以本实验中洗脱液的作用时间为l_3h皆可， 综上所述，我们选择洗脱液1:20作为最适工作浓度，l-3h作为最适洗脱时间。
[0221] 应用实施例
[0222] 应用实施例1
[0223] 采用酶联免疫法（ELISA法）检测100份标本血浆中的铬-极低密度脂蛋白螯合 物，即采用具体实施例方法一记载的方法检测，具体操作步骤如下：
[0224] 1)包被：将抗极低密度脂蛋白抗体包被于固相载体上，用稀释缓冲液稀释至1000 倍，加入ELISA板微孔中，37°C保存1小时后于冰箱中4°C储存；
[0225] 2)封闭：移去稀释缓冲液，洗涤，加封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，洗涤， ELISA板37°C放置1小时后于冰箱中4°C储存；
[0226] 3)加样：以标本血浆作为待测样本，以已知含量的铬-极低密度脂蛋白螯合物作 标准品，用稀释缓冲液将待测样本和标准品均稀释至20倍，加入微孔中，37°C作用1小时；
[0227] 4)加抗Cr抗体：移去样品，洗涤，加入用稀释缓冲液稀释至5000倍的抗Cr抗体， 37°C作用1小时，使其与极低密度脂蛋白上的金属铬反应；
[0228] 5)加酶标：移去抗Cr抗体，洗涤，加入用稀释缓冲液稀释至抗体浓度为2 μ g/mL 的酶标抗体，37°C作用1小时，使其与抗Cr抗体反应；
[0229] 6)底物温育：移去酶标抗体，洗涤，加入底物，37°C避光作用30min，以与加底物液 相同的速度和顺序滴加入终止液；
[0230] 7)检测：于450nm波长下在酶标仪上分别读取待测样本和标准品的OD值，结果如 表5所示。
[0231] 表5方法一对100份标本血浆的实测结果
[0232]
[0233] 本应用实施例1中，步骤7)中，也可以不使用酶标仪检测，而是直接通过显色进行 定性检测。
[0234] 应用实施例2
[0235] 采用酶联免疫与原子吸收光谱结合法（ELISA法+AAS法）检测100份标本血浆中 铬-极低密度脂蛋白螯合物，即采用具体实施例方法二记载的方法检测，具体操作步骤如 下：
[0236] 1)包被：将抗极低密度脂蛋白抗体包被于固相载体上，用稀释缓冲液稀释包被蛋 白至1000倍，加入ELISA板微孔中，4°C过夜18小时；
[0237] 2)封闭：移去稀释缓冲液，洗涤，加封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，洗涤， ELISA板4°C下保存；
[0238] 3)加样：以标本血浆作待测样本，以已知含量的铬-极低密度脂蛋白螯合物作标 准品，用稀释缓冲液将待测样本和标准品稀释至20倍，加入微孔中，37°C作用1小时；
[0239] 4)洗脱：移去待测血浆样本，洗涤，加入0· 8mol/L的Na2HPO4溶液，37°C作用2小 时；
[0240] 5)检测：从ELISA微孔中取样，于原子吸收光谱仪检测待测样本和标准品中螯合 于极低密度脂蛋白上的铬，结果如表6所示。
[0241] 表6方法二对100份标本血浆的实测结果
[0243] 应用实施例3 ：
[0244] 采用酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法（ELISA法+ICP-MS法）检测100 份标本血浆中铬-极低密度脂蛋白螯合物，即采用具体实施例方法三记载的方法检测，具 体操作步骤如下：
[0245] 1)包被：将抗极低密度脂蛋白抗体包被于固相载体上，用稀释缓冲液稀释包被蛋 白至1000倍，加入ELISA板微孔中，4°C保存18小时；
[0246] 2)封闭：移去稀释缓冲液，洗涤，加封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，洗涤， ELISA板4°C保存；
[0247] 3)加样：以标本血浆作待测样本，以已知含量的铬-极低密度脂蛋白螯合物作标 准品，用稀释缓冲液将待测样本和标准品稀释至20倍，加入微孔中，37°C作用2小时；
[0248] 4)洗脱：移去待测样本和标准品，洗涤，加入0· 8mol/L的Na2HPO4溶液，37°C洗脱 2小时；
[0249] 5)酸化：在溶液中加入硝酸对溶液进行酸化，封口过夜，彻底酸化；
[0250] 6)检测：加入过氧化氢，并且加热赶酸，取样于电感耦合等离子体质谱仪下检测 待测样本和标准品中螯合于极低密度脂蛋白上的铬，结果如表7所示。
[0251] 表7方法三对100份标本血浆的实测结果
[0253] 上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围， 本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所 要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种铬-极低密度脂蛋白螯合物，其特征在于，该铬-极低密度脂蛋白螯合物是铬离 子与极低密度脂蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。2. 如权利要求1所述的铬-极低密度脂蛋白螯合物的制备方法，包括以下步骤： A) 铬-极低密度脂蛋白的合成：在提纯源于人体的极低密度脂蛋白或按照生物学方法 重组的极低密度脂蛋白中加入铬离子进行螯合反应； B) 铬-极低密度脂蛋白螯合物纯化：采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液中未 反应的极低密度脂蛋白、特异性抗体和铬离子，即得铬-极低密度脂蛋白螯合物。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于， 所述步骤B)中具体包括以下步骤： (1) 溶解样品：将上述步骤A)的铬-极低密度脂蛋白螯合物溶解于生理盐水中，得 铬-极低密度脂蛋白螯合物的溶液； (2) 平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与极低密度 脂蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱； (3) 上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)的溶液，然后上柱，使极低密度 脂蛋白与填料特异性结合； (4) 洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0. lOmol/L的 Na2HP0j§液进行洗脱； (5) 收集：收集步骤（4)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原； (6) 透析：将步骤（5)的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次后，4°C透析过 夜，收集样本； (7) 平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与铬 特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱； (8) 上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6)中样本，然后上柱； (9) 洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的Na2HPO4 溶液进行洗脱； (10) 收集：收集步骤（9)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原； (11) 透析：将步骤（10)的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次后，4°C透析 过夜，收集样本，即得铬-极低密度脂蛋白螯合物。4. 根据权利要求2所述的铬-极低密度脂蛋白螯合物的制备方法，其特征在于，步骤 B)后还包括步骤C):对铬-极低密度脂蛋白螯合物的鉴定； 其中，步骤C)中具体包括以下步骤： (1) 制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床； (2) 加样：取步骤B)中提取纯化得到的铬-极低密度脂蛋白螯合物，加入上样缓冲液， 并混匀，然后加样于样品槽中； (3) 电泳：连接电泳板，进行电泳； (4) 检测：在胶床上找出含铬的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶解，然后 再采用ICP-MS或AAS检测是否含有铬以及检测铬的含量。5. -种如权利要求1所述的铬-极低密度脂蛋白螯合物在制备检测血样中铬_极低密 度脂蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用。6. -种至少包括如权利要求1所述的铬-极低密度脂蛋白螯合物作为标准品的试剂 盒。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括包被液，该包被液包括捕获极低 密度脂蛋白的物质或捕获金属铬的物质。8. -种定量检测铬-极低密度脂蛋白螯合物的方法，其特征在于，以已知含量的权利 要求1所述的铬-极低密度脂蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测： 酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、 提纯铬_极低密度脂蛋白螯合物与酶联免疫结合法、提纯铬-极低密度脂蛋白螯合物与原 子吸收光谱结合法、提纯铬-极低密度脂蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电 泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
【专利摘要】本发明提供一种铬-极低密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用，该铬-极低密度脂蛋白螯合物是铬离子与极低密度脂蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成，可用于制备检测人体铬-极低密度脂蛋白螯合物的试剂。本发明首次证实了铬离子可直接作用于极低密度脂蛋白。本发明建立了铬-极低密度脂蛋白螯合物的定性定量检测方法，以检测一个地区人群体内极低密度脂蛋白的含量，从而间接反映一个地区铬污染程度以及对人群的健康影响。本发明建立的铬-极低密度脂蛋白螯合物定量检测方法准确度高重、复性好。
【IPC分类】G01N1/34, G01N27/62, G01N33/53, G01N27/447, G01N21/31, G01N1/28
【公开号】CN105044009
【申请号】CN201510413275
【发明人】张积仁, 阳帆, 董欣敏, 吴婧, 蔡睿, 孙遥, 赵乙木
【申请人】上海拜豪生物科技有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月14日