一种莱克多巴胺免疫磁珠分离富集试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种莱克多己胺免疫磁珠试剂盒及其对样品中莱克多己胺的分离富 集方法。属于免疫学领域。
【背景技术】
[000引莱克多己胺（Ractopamine,RAC)，化学名称为1-(4-径基苯基）-2[1-甲 基-3-(4-?基苯基）-丙氨基]-乙醇盐酸盐，与克伦特罗（瘦肉精）均为β-受体兴奋 剂，在临床上普遍用于治疗支气管炎和哮喘病。近几年的研究表明，RAC具有控制动物营养 代谢路径、增强饲料转化率等作用，因此被用作新型促生长添加剂。但由于莱克多己胺在猪 等动物的体内具有残留并可W通过生物链方式进入人体，当积累超过一定量时表现出毒副 反应，出现屯、动过速、屯、律失常及肌肉疼痛等症状。近年来，随着政府对"瘦肉精"监控力度 的增强，RAC被不法商贩作为"瘦肉精"替代品应用于猪养殖业中。我国农业部2002年176 号公告将RAC规定为违禁药物。相应地，对于莱克多己胺的检测技术的研究提出了更高的 要求。简单、快速、准确、灵敏的莱克多己胺检测技术也越来越受到食品企业、检测机构的广 泛关注。
[0003] 莱克多己胺残留分析主要采用免疫分析法、气相色谱-质谱法（GC-M巧、高效液相 色谱-质谱法（HPLC-M巧、液相色谱-串联质谱法化C-MS/M巧等方法。由于上述检测方法 的样品前处理均需要使用净化装置，包括C18柱、石墨化碳固相萃取柱、弗罗里娃±固相萃 取柱、硅胶SPE固相萃取柱等。上述固相萃取柱价格昂贵，约为500-2000元/支，且净化步 骤繁琐，需要多种有机溶剂。莱克多己胺免疫磁珠分离技术由于内含Fe3〇4的纳米磁珠的表 面修饰官能团可与莱克多己胺特异性单克隆抗体结合构成莱克多己胺免疫磁珠，通过外加 磁场利用抗体的特异性免疫反应从混合溶液中富集和分离莱克多己胺，莱克多己胺免疫磁 珠的净化载体为分散状，可提高特异性单克隆抗体与检测祀物质的结合概率，从而提高样 品中莱克多己胺的回收率，增加了莱克多己胺检测方法的准确度。免疫磁珠的磁珠与抗体 之间的结合键为化学结合键，结合程度较为牢固；免疫亲和柱是利用抗原和抗体的特异性 结合性质的特殊的SPE小柱。抗体与载体存在的共价键为疏水作用力及离子交换作用力等 物理结合力，其结合力度没有免疫磁珠的化学结合键的结合力度大。而且免疫亲和柱的载 体为固相，抗体与检测祀物质的结合概率与免疫磁珠相比较会低。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种莱克多己胺免疫磁珠分离富集试剂盒， 采用该试剂盒进行样品中莱克多己胺的分离富集时具有较高的特异性、回收率和准确度， 简化样品前处理步骤，避免样品前处理过程中使用多种和大量的有机溶剂。
[0005]为实现上述目的，本发明提供一种莱克多己胺免疫磁珠分离富集试剂盒，其包括 偶联莱克多己胺单克隆抗体的磁珠、复溶液和磁铁，所述偶联莱克多己胺单克隆抗体的磁 珠是由莱克多己胺单克隆抗体与磁珠的质量比为1:500~800混合并溶于2-(N-吗嘟代） 乙横酸一水合物中偶联制备而成，所述莱克多己胺单克隆抗体是由莱克多己胺半抗原与牛 血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Ba化/c小鼠制备获得。
[0006] 所述莱克多己胺半抗原是由莱克多己胺经重铭酸化晚氧化，得到酬基莱克多己胺 中间体，再将中间体与对径基苯阱进行缩合反应，在苯环邻位引入待簇基的间隔臂，得到对 径基苯阱化莱克多己胺半抗原，得率为88%，其结构式如式I所示。
[0007]
[000引所述复溶液含有0. 2%牛血清白蛋白、0. 04%吐溫-20W及0. 02%Nary勺憐酸盐 缓冲液或抑7. 4的Ξ径甲基氨基甲烧缓冲液，所述百分含量均为质量百分含量，所述偶联 莱克多己胺单克隆抗体的磁珠在复溶液中保存。
[0009] 所述磁铁产生外加磁场，使偶联莱克多己胺单克隆抗体的磁珠聚集在磁铁上，达 到分离磁珠的目的。
[0010] 本发明还提供了分离富集样品中莱克多己胺的方法，包括下列步骤：
[0011] 1)用试剂盒进行样品中莱克多己胺的分离富集；
[0012] 2)将富集有莱克多己胺的偶联莱克多己胺单克隆抗体的磁珠用甲醇洗脱，回收甲 醇液，用于检测分析。
[0013] 本发明的有益效果如下：
[0014] 1)本发明试剂盒的具有较高的特异性和准确性，对莱克多己胺的捕获浓度可达到 20ng/mg(每毫克免疫磁珠可W捕获20ng莱克多己胺），样品添加回收率> 85% ;
[0015] 2)本发明试剂盒中的偶联莱克多己胺单克隆抗体的磁珠与液体经磁力作用容易 快速分离开来，分离过程简单，可省去离屯、和过滤等繁琐的操作过程，节约时间，在撤去外 加磁场时，磁珠无磁性记忆，能够均匀分散，不出现聚集现象；
[0016] 3)磁珠具有一定的机械度和化学稳定性，能耐受一定浓度的酸碱溶液和微生物的 降解，其结构内的磁性物质不易被氧化，磁性微粒的运种物理化学性质稳定特点，使其磁性 不易下降；
[0017] 4)磁珠的润洗和洗脱分别用去离子水和甲醇，0.1 mL的偶联莱克多己胺单克隆抗 体的磁珠只需ImL甲醇洗脱即可，所用试剂的量较少，磁珠的润洗和洗脱过程较环保。
【附图说明】
[0018] 图1为莱克多己胺半抗原合成反应式。
[0019] 图2为莱克多己胺半抗原核磁共振氨谱图。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1 :试剂盒具体组分的制备
[0021] 1.莱克多己胺半抗原合成
[0022] 莱克多己胺半抗原是由莱克多己胺经重铭酸化晚氧化，再与对径基苯阱进行缩合 反应，在苯环邻位引入带簇基间隔臂，得到对径基苯阱化莱克多己胺半抗原。
[0023] 取0.Ig莱克多己胺l.Og加入乙腊中溶解，再加重铭酸化晚0. 78g，揽拌，再加入 500μL乙酸，于80°C揽拌lOh，停止反应后，用旋转蒸发仪除去乙腊，再加入水和乙酸乙醋 萃取，分层后除去水相，有机相用无水硫酸钢干燥并蒸干，上硅胶柱，流动相氯仿与甲醇的 体积比为氯仿：甲醇=10:1，进行洗脱分离，得到中间体〇.93g;取中间体0.93g加入乙醇 溶解，加入对径基苯阱0. 72g，于70°C下揽拌化，停止反应后，将溶剂蒸干，得到黄色固体， 再加入乙酸乙醋洗涂结晶，得到对径基苯阱化莱克多己胺半抗原0. 87g，收率为88%。合成 反应式如图1所示。取上述半抗原产物经核磁氨谱测定，如图2所示，化学位移δ=llppm 的位置为簇基氨，化学位移δ=7. 85的位置为苯阱中苯环的氨，运些特征峰的存在证明偶 联成功，半抗原结构正确。核磁鉴定结果：?NMR(CDCl3, 300ΜΗ幻δ: 11. 0 (S，1Η，C00H)，6. 8 4-7. 85 (d, 12H,ArH),5. 35 (s,IH,OH),2. 79 (m,IH, -CH-),2. 55 (t, 2H,CH2),2. 60 (t, 2H, -CH2 -)，2. 0 (s,IH,NH)，1. 7 (m, 2H, -CH2-)，1. 12 (s, 3H, -CH3)。
[0024] 2.免疫原的制备
[00幼取13mg对径基苯阱化莱克多己胺半抗原，溶解于1血N，N-二甲基甲酯胺（DMF) 中；取30mg二氯乙烧巧DC)和N-径基班巧酷亚胺（N服）用0. 2mL水充分溶解后，加入半抗 原溶液中，室溫下揽拌2地，即可得到反应液A;称取牛血清白蛋白度SA) 50mU使之充分溶 解在4mL抑值为7. 2的憐酸盐缓冲液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到BSA溶液中，并于室 溫下揽拌24h;用0.Olmol/L的憐酸盐缓冲液于4°C透析3天，每天换3次透析液，W除去未 反应的小分子物质，得到莱克多己胺免疫原；分装，于-2(TC保存备用。
[0026] 3.莱克多己胺单克隆抗体的制备
[0027] 1)动物免疫：用上述制备出的免疫原（RAC-BSA)按100μg/只，W生理盐水溶解 免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Ba化/c雌鼠，初次免 疫后第7、14、28天W免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天W 免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。
[0028] 2)细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨 髓瘤细胞（SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂（PEG4000)进行融合，用HAT 培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37°C，5 %C〇2培养箱中培 养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。
[0029] 3)杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛 选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接化ISA方法，W包被抗原（预先用方阵法常规滴定其最 佳包被浓度和阳性血清稀释度）包被酶标板，加入被测孔培养上清，解育，清洗后加入莱克 多己胺标准品溶液50μL再加入细胞上清液50μL和羊抗鼠IgG-HRP50μL于37°C反应 30min，洗板，再加入底物液显色液100μ以于25°C下避光反应15min，再加入终止液50μ以 巧憶〇〇45。。准下降到对照孔的50%W下，判为阳性，经2~3次检测都为阳性的孔，立即用 有限稀释法进行亚克隆化。