[0030] 4)单克隆抗体制备：将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清 液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8~10周龄Ba化/c小鼠腹腔注射液体石蜡0. 5mL/ 只，7~10日后腹腔注射杂交瘤细胞1~2XlOV只，7~10日后抽取小鼠腹水，离屯、取上 清，测定效价，并冻存备用。
[0031] 5.偶联莱克多己胺单克隆抗体的磁珠的制备
[00础 1)磁珠活化
[0033] 表面有-C00H基团的磁珠（购于DYNAL粒径为2. 8μπι)，其含量是0.leq/g~ 0. 3eq/g，取100μL磁珠，用含有抑5. 0、0. 05%的吐溫-20的浓度为25mmol/L的2-(N-吗 嘟）乙横酸一水合物（MES) 100血洗涂两次，磁分离后移除上清；磁珠活化前，用4°C胆存的 上述MES溶液分别配制50mmol/L的邸C和N服溶液；分别向装有磁珠的离屯、管中加入新配 置的邸C和N服溶液各50μL满旋混匀，室溫活化30min;将离屯、管置于磁分离架上进行磁 分离4min，移除上清液，再向其中加入100化、抑5. 0、25mmol/L的MES清洗2~3次后即 可得到表面有簇基活化的磁珠。所述百分含量为质量百分含量。
[0034] 2)偶联莱克多己胺单克隆抗体的磁珠的制备
[003引将10μg莱克多己胺单克隆抗体溶解到60μL、抑5. 0、25mmol/L的MES中，向其中 加入5mg活化的磁珠，或将5μg莱克多己胺单克隆抗体溶解到60μL、抑5. 0、25mmol/L的 MES中，向其中加入4mg活化的磁珠，并用上述浓度MES溶液调节总体积至100μL轻柔地 混匀磁珠与莱克多己胺单克隆抗体；室溫条件下偶联30min或4°C偶联化，该期间可利用满 旋仪使磁珠保持混匀状态；离屯、管置于磁分离架上进行磁分离5min，移除上清液；为了泽 灭未反应的-C00H，可加入100μL，抑7. 2~抑7. 6的Ξ径甲基氨基甲烧灯RI巧反应15min 或100μ^pW.O、乙醇胺浓度为50mmol/L的憐酸盐缓冲液封闭磁珠；用100μ^Ο.2% BSA、0. 1 %吐溫-20的憐酸盐缓冲液清洗封闭好的磁珠3~5次，将磁珠复溶于含0. 4%的 BSA、0. 08%吐溫-20、0. 02%Nar^的憐酸盐缓冲液中，于2°C~8°C保藏。所述百分含量为 质量百分含量。
[003引实施例2 :试剂盒的组建
[0037] 组建检测莱克多己胺磁免疫磁珠分离富集试剂盒，使其含有下列组分：
[0038] 偶联莱克多己胺单克隆抗体的磁珠 [003引复溶液
[0040] 磁铁
[0041] 将偶联莱克多己胺单克隆抗体的磁珠加入到复溶液中，至终浓度为lOmg/血。
[0042] 实施例3 :试剂盒对样品中莱克多己胺的分离富集方法
[0043] 1)取溶有偶联莱克多己胺单克隆抗体的磁珠复溶液0.ImL于lOmL离屯、管中，用 5mL去离子水润洗磁珠1-2次，将离屯、管在磁铁上静置2-3min，确保磁珠全部吸附在磁铁 上，每次用磁铁分离磁珠和洗液；
[0044] 2)将尿液样品5mL加入到装有润洗好的偶联莱克多己胺单克隆抗体磁珠的lOmL 的离屯、管中，混匀，室溫下反应20min;或者将动物组织、饲料样品用均质器均质后，称取 5. 0 + 0. 05g样品至样品瓶中，分别加入1. 5 + 0. 05g氯化钢，20mL50%甲醇溶液，用满旋仪 满旋5min，室溫下3000;r/min离屯、5min，或静置后取10血上清液过滤代替离屯、过程，吸取 5mL离屯、上清液/滤液，加入5mL去离子水，混匀，吸取离屯、上清液/滤液与去离子水的混合 液5mL与偶联莱克多己胺单克隆抗体的磁珠混匀，在室溫下反应20min;
[0045] 3)反应完成后，用磁铁分离磁珠，用5mL去离子水清洗磁珠，清洗两次；
[0046] 4)将1血甲醇加入到装有经过步骤3)清洗过的磁珠的10血离屯、管中，混匀，静置
[0047] Imin，用磁铁分离磁珠，回收甲醇溶液，用于检测分析。
[004引实施例4 :试剂盒质量的测定
[0049] 1.试剂盒的捕获量和回收率
[0050] 试剂盒捕获量的定义为：每毫克偶联莱克多己胺单克隆抗体的磁珠可W捕获莱克 多己胺的最大量。制备莱克多己胺浓度分别为10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/ mL样品溶液，每份猪尿、牛尿、羊尿、饲料、猪肉、猪肝、牛肉、羊肉样品溶液为山以取莱克多 己胺单克隆抗体免疫磁珠O.lmL分别加入至上述样品中，用试剂盒进行样品中莱克多己胺 的分离和富集，并用莱克多己胺酶联免疫巧LISA)检测试剂盒对用偶联莱克多己胺单克隆 抗体的磁珠处理过样品进行检测，偶联莱克多己胺单克隆抗体的磁珠捕获量和样品添加回 收率如表1所示：
[0051] 表1偶联莱克多己胺单克隆抗体的磁珠捕获量和样品添加回收率结果
[0052]
[0054]由表1可W看出，样品中莱克多己胺浓度为lOng/血、15ng/mL和20ng/mL时，经 莱克多己胺免疫磁珠分离富集试剂盒对样品中莱克多己胺分离富集后，再经化ISA检测方 法检测，得出莱克多己胺添加回收率范围为89. 0% -100. 0%，当样品中莱克多己胺浓度为 25ng/mL和30ng/mL时，得出莱克多己胺添加回收率范围为61. 0% -78. 8%，表明莱克多己 胺免疫磁珠分离富集试剂盒对样品中莱克多己胺的捕获量为20ng/mL。
[00财 2.特异性
[0056]W莱克多己胺作为标准，设莱克多己胺的交叉反应率为100%，用于试剂盒交叉反 应性研究的药物均为与莱克多己胺结构或者功能相似的竞争药物：沙下胺醇、克仑特罗、苯 乙醇胺A、漠氯布特罗、漠布特罗、特布他林、径甲基莱克多己胺、西马特罗、妥布特罗、马喷 特罗、赛布特罗、克仑潘特、齐帕特罗、喷布特罗、克仑丙罗、马布特罗、氯丙那林。猪尿、牛 尿、羊尿、饲料、猪肉、猪肝、牛肉、羊肉样品中分别添加上述18种药物（包括莱克多己胺） 浓度为20ng/mU按试剂盒步骤操作，对样品中莱克多己胺进行分离富集后，利用ELISA检 测方法对样品进行检测，检测结果列于表2 :
[0057] 表2试剂盒特异性试验
[0058]
[0059]
[0060]
[0061]
[0062]
[0063]
[0064] 从表2可W看出，试剂盒对莱克多己胺具有较高的特异性，对与莱克多己胺结构 或者功能相似的竞争药物均无交叉反应。
【主权项】
1. 一种莱克多巴胺免疫磁珠分离富集试剂盒，其特征在于包括偶联莱克多巴胺单克隆 抗体的磁珠、复溶液和磁铁，所述偶联莱克多巴胺单克隆抗体的磁珠是由莱克多巴胺单克 隆抗体与磁珠的质量比为1 :500~800混合并溶于2-(N-吗啉代）乙磺酸一水合物中偶联 制备而成，所述莱克多巴胺单克隆抗体是由莱克多巴胺半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联 物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述莱克多巴胺半抗原是由莱克多巴 胺经重铬酸吡啶氧化，得到酮基莱克多巴胺中间体，再将中间体与对羟基苯肼进行缩合反 应，在苯环邻位引入带羧基的间隔臂，得到对羟基苯肼化莱克多巴胺半抗原，得率为88%， 其结构式如式I所示。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述复溶液含有0. 2%牛血清白蛋白、 0. 04 %吐温-20以及0. 02% NaN3的磷酸盐缓冲液或pH7. 4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，所 述百分含量均为质量百分含量，所述偶联莱克多巴胺单克隆抗体的磁珠在复溶液中保存。4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁铁可以产生外加磁场，使偶联莱 克多巴胺单克隆抗体的磁珠聚集在磁铁上，达到分离磁珠的目的。5. 根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒分离富集样品中莱克多巴胺的方法，包括下 列步骤： 1) 用权利要求1-4任一项所述的试剂盒进行样品中莱克多巴胺的分离富集； 2) 将富集有莱克多巴胺的偶联莱克多巴胺单克隆抗体的磁珠用甲醇洗脱，回收甲醇 液，用于检测分析。
【专利摘要】本发明涉及了一种莱克多巴胺免疫磁珠分离富集试剂盒。包括偶联莱克多巴胺单克隆抗体的磁珠、复溶液和磁铁，偶联莱克多巴胺单克隆抗体的磁珠是由莱克多巴胺单克隆抗体与磁珠的质量比为1：500～800混合并溶于2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物中偶联制备而成，莱克多巴胺单克隆抗体是由莱克多巴胺半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。本发明还涉及一种采用所述的莱克多巴胺免疫磁珠分离富集试剂盒分离莱克多巴胺的样品前处理方法，本方法对莱克多巴胺具有较高的特异性、回收率和准确度，简化样品前处理步骤，避免样品前处理过程中使用多种和大量的有机溶剂。
【IPC分类】G01N1/34, G01N1/40
【公开号】CN105277424
【申请号】CN201510601755
【发明人】徐念琴, 聂雯莹, 马腊腊, 曹东山, 杨昌松, 何方洋, 罗晓琴, 万宇平
【申请人】北京勤邦生物技术有限公司
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年9月21日