基于金/银核-壳纳米粒子比色法检测胆固醇的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于金/银核?壳纳米粒子比色法检测胆固醇的方法，该方法包括以胆固醇氧化酶为催化剂使胆固醇与氧气反应生成过氧化氢；将生成的过氧化氢与金/银核?壳纳米粒子表面的银纳米壳层反应，蚀刻银纳米壳层；利用紫外?可见光谱仪进行检测。本发明有效利用了金/银核壳纳米粒子在反应前后表面等离子体共振(SPR)吸收峰强度显著变化的同时伴随着颜色的显著变化特性，不需加入额外显色剂，不需要借助精密仪器检测，并且不需要复杂、费时的酶固定过程，避免了此过程可能导致的纳米材料团聚的缺陷，简化了检测方法，本发明具有成本低、快速、简便、敏感且特异性好的优点。
【专利说明】
基于金/银核-壳纳米粒子比色法检测胆固醇的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种基于金/银核-壳纳米粒子比色法检测胆固醇的方法。
【背景技术】
[0002]胆固醇在细胞中起着重要的作用。它不仅是细胞膜的重要组成成分，也是合成胆汁酸，维生素D和类固醇激素的原材料。胆固醇是生化检测的指标之一。胆固醇含量应该维持在正常的水平内，胆固醇含量偏尚，癌症(结肠癌、肺癌、乳腺癌、白血病、儿童脑癌、胃癌、肝癌)、糖尿病、冠状动脉心脏病，尚血压，糖尿病的发病率也在上升。胆固醇含量偏低时，贫血、消瘦症候群的发病率变高。
[0003]贵金属纳米材料，尤其是金银纳米材料由于其在可见到近红外光谱区域的SPR吸收引起的独特的可调光学特性而引起了大量的关注。在过去的几十年里，人们发展了许多基于单组份的纳米材料的方法用以检测各种分析物质如葡萄糖，胆固醇，尿酸，DNA，各种酶以及金属离子等。与单组份的金属纳米粒子相比，含有两种不同金属元素的双金属纳米粒子可以通过控制核的尺寸，壳的厚度，化学组成，粒子之间的距离等来调控等离子体共振的波长，强度等性质。另外双金属纳米粒子因其两种不同的金属组分之间的相互协同作用而使等离子体共振性质极大增强。众所周知，与金纳米粒子相比，银纳米粒子显示出了更强及更灵敏的SPR，但如何制备出性质非常稳定的银纳米粒子仍然是一个挑战，而现在人们已经很容易制备出尺寸和形貌可控，稳定性和生物相容性好，并且SPR吸收广泛的金纳米粒子。为了结合金纳米粒子和银纳米粒子两者的优点，人们制备出了金/银核-壳纳米粒子并将其应用于各种领域。
[0004]在各种检测胆固醇的方法中，颜色检测法具有的肉眼可见的优点，它不需昂贵复杂的仪器以及特定培训的专业技术人员，在众多分析检测方法中具有竞争性优势。大部分现有的颜色检测胆固醇的方法大多利用纳米材料的催化性能。具体如下:首先将胆固醇氧化酶固定在纳米材料的表面，然后利用胆固醇氧化酶催化胆固醇与氧气反应生成过氧化氢，纳米材料催化过氧化氢氧化显色剂而发生显色反应。整个检测过程包含了复杂而费时的酶固定过程，并且酶固定过程可能会导致纳米材料的团聚。同时在此过程中需要加入额外的显色剂如TMB，ABTS2—等，无疑增加了体系的复杂性。因此这些缺点限制了这些方法的应用。
[0005]因此开发一种简单、快速、准确、定量检测胆固醇的新方法在临床检测方面具有重要意义！
【发明内容】
[0006]发明目的:针对上述现有技术存在的问题，本发明是提供了一种基于金/银核-壳纳米粒子比色法检测胆固醇的方法。本发明中针对胆固醇氧化酶作用于胆固醇产生的过氧化氢与金/银核-壳纳米粒子中的银纳米壳层反应使其刻蚀，而使光学性质发生显著改变，从而建立比色法检测胆固醇，它具有方法简单，灵敏度高、准确性好、适用于复杂的体系等优点，并且实验结果用肉眼便可直接观测而无需贵重的大型仪器。
[0007]本发明的技术方案如下:
[0008]本发明提供了一种基于金/银核-壳纳米粒子比色法检测胆固醇的方法，其特征在于，该方法包括:以胆固醇氧化酶为催化剂使胆固醇与氧气反应生成过氧化氢;将生成的过氧化氢与金/银核-壳纳米粒子表面的银纳米壳层反应，蚀刻银纳米壳层;利用紫外-可见光谱仪进行检测。
[0009]本发明提出的一种基于金/银核-壳纳米粒子比色法检测胆固醇的方法的进一步优选方案为:
[0010]所述金/银核-壳纳米粒子的合成步骤包括:将巯基化甲基聚乙二醇(SH-PEG)修饰的金纳米粒子分散在缓冲溶液中，并加入AgNO3混合均匀后，再加入对氨基苯酚(p-AP)，并于室温下反应10?40min;所述的缓冲溶液为DEA缓冲溶液;其中DEA缓冲溶液为含有0.2-3mM MgSO4的pH为8-ll的浓度为550-650mM的DEA缓冲溶液;其中，所述AgN03的浓度为0.I?0.5M;所述对氨基苯酚(p-AP)的浓度为0.1?ImM。
[0011 ] 所述SH-PEG修饰的金纳米粒子的制备步骤包括:向金纳米粒子中加入SH-PEG，在不断搅拌下于室温下反应I?3h，最终溶液在12200?13200rpm，2-10°C下离心20?30min，离心后复溶在超纯水中，2-10 °C保存，得到SH-PEG修饰的金纳米粒子。
[0012]所述金纳米粒子的制备步骤包括:将实验中所用的玻璃器皿用王水浸泡，再用超纯水冲洗干净，烘干待用;将30-70mL浓度为0.5_3mM的HAuC14溶液加热至沸腾，并在沸腾状态下持续搅拌，加入1-1OmL浓度为30-50mM的柠檬酸钠溶液，继续保持沸腾10_30min ；移除热源，搅拌10-30min，冷却至室温，制备得到金纳米粒子。
[0013]所述金纳米粒子的直径为5-30nm，其中金纳米粒子的直径优选为13nm。
[0014]所述以胆固醇氧化酶为催化剂使胆固醇与氧气反应生成过氧化氢的步骤包括:向不同浓度的胆固醇溶液中加入浓度为I?2mg mL—1的胆固醇氧化酶，于30-45°C下温育0.3?lh，所述胆固醇溶液和胆固醇氧化酶溶液的体积比值为3?I。
[0015]所述将生成的过氧化氢与金/银核-壳纳米粒子表面的银纳米壳层反应包括:将金/银核-壳纳米粒子溶液加入到以胆固醇氧化酶为催化剂使胆固醇与氧气反应生成过氧化氢的溶液中，并于室温下反应0.5?lh。
[0016]本发明通过胆固醇与氧气在胆固醇氧化酶催化作用下反应生成过氧化氢，生成的过氧化氢与金/银核-壳纳米粒子表面的银纳米壳层反应，从而刻蚀银纳米壳层，导致SPR吸收峰强度显著下降，同时伴随着溶液颜色的显著变化的性质，比色法检测胆固醇。
[0017]有益效果:本发明相对于现有技术，具有以下优点:
[0018](I)本发明体系简单不需加入额外的显色剂。
[0019](2)本发明利用了金/银核壳纳米粒子在反应前后颜色显著变化特性，不需要借助精密仪器检测，简化了检测方法，因此可用比色法检测胆固醇。
[0020](3)本发明在整个检测过程不需要复杂而费时的酶固定过程，避免了酶固定过程而导致纳米材料的团聚的可能性。
[0021](4)本发明具有简便、敏感且特异性好的优点。
[0022](5)本发明成功的用于实际样品的检测，准确度高。
【附图说明】
[0023]图1显示了基于金/银核-壳纳米粒子比色法检测胆固醇的原理图。
[0024]图2显示了胆固醇检测实验原理验证图。a线:金纳米粒子的紫外吸收光谱;b线:向金纳米粒子中加入AgNO3后溶液的紫外吸收光谱;c线:向金纳米粒子中加入p-AP后溶液的紫外吸收光谱;d线:向金纳米粒子中加入AgNO3和p-AP后溶液的紫外吸收光谱;e线:向金纳米粒子中加入AgNO3和p-AP后，反应一段时间后，再将此溶液与胆固醇和胆固醇氧化酶反应液混合后溶液的紫外吸收光谱；
[0025]图3显示了定量检测胆固醇的紫外光谱图。图3A:在不同浓度的胆固醇存在下，得到的紫外光谱图(胆固醇的浓度:0，0.3，5，25，50，100，200，300，400，600，80(^10;图38:紫外吸收强度与胆固醇的浓度拟合曲线；图3B的插图:吸光度与胆固醇浓度之间的线性关系。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
[0027]本实验中用到的试剂和仪器:
[0028]氯金酸(HAuCl4.4H20)，柠檬酸钠(Na3C6H5O7.2H20)，硝酸银(AgNO3)，对氨基苯酚(P-AP)，胆固醇氧化酶(ChOx)，胆固醇，二乙醇胺(DEA)，紫外分光光度计(Cary 100，Agilent，Singapore)，透射电镜(JEM-2010 ,Hitachi ,Japan)，混合祸旋仪(IKA German)，离心机(Eppendorf German)，数码相机(DSC-W730，Sony ,Japan)。
[0029]实施例1:
[0030]基于金/银核-壳纳米粒子比色法检测胆固醇的方法，包括以下步骤:
[0031]SH-PEG修饰的金纳米粒子的合成步骤:将所用到的所有玻璃器皿用王水浸泡，再用超纯水冲洗干净，烘干待用;将30-70mL、比如为50mL的浓度为ImM的HAuCl4溶液加热至沸腾(其中HAuCl4溶液的浓度范围在0.5-3mM也能解决本申请所要解决的技术问题)，并在沸腾状态下持续搅拌，加入Ι-lOmL、优选为5mL浓度为38.8mM的柠檬酸钠溶液(在本发明的技术方案中，柠檬酸钠溶液的浓度范围可为30-50mM);继续保持沸腾10-30min、优选为15min;移除热源，搅拌10-30min、优选为15min;冷却至室温，制备得到金纳米粒子;取制备得到的金纳米粒子溶液ImL，并向其中加入6mL，25mM的SH-PEG，在不断搅拌下于室温下反应2h，最终溶液在13200rpm、2-10°C下(优选为4°C)下离心20-30min(优选为25min)，离心三次后复溶在超纯水中，2-10°C保存(优选为4°C)，得到SH-PEG修饰的金纳米粒子。
[0032]金/银核-壳纳米粒子合成步骤:将SH-PEG修饰的金纳米粒子分散在550-650mM(优选为600mM)DEA缓冲溶液(pH=9.8，其中600mM DEA中含有ImM MgSO4)中(本发明的技术方案中，DEA缓冲溶液pH范围为8-11，优选pH为9.8;可预知MgSO4浓度范围为0.2_3mM，优选为ImM)，并向其中加入2μΙ^?度为0.25Μ AgNO3 (本发明AgNO3浓度范围为0.I?0.5Μ，优选浓度为0.25Μ)混合均匀后，再加入93.75μΙ^度为0.667mM(本发明p-AP浓度范围为0.1?1禮，优选浓度为0.667mM)的p-AP，最终溶液体积为350yL，于室温下反应40min，制得金/银核-壳纳米粒子。
[0033]胆固醇检测步骤:将含有浓度为1.5mg mL—1的胆固醇氧化酶分别与不同浓度胆固醇(O，0.3，5，25，50，100，200，300，400，600，800μΜ)的溶液混合，所述胆固醇溶液和胆固醇氧化酶溶液的体积比值为2(本发明技术方案中体积比值范围3?I，优选体积比值为2)，混合后的体积为150yL，两者充分混合后，在37°C恒温水浴锅中反应30min后，将350yL金/银核-壳纳米粒子加入到以上胆固醇氧化酶催化胆固醇与氧气反应后的溶液中，于室温下反应30min，反应结束后，将最终溶液去扫描紫外-可见光谱。分析得到紫外吸收图谱，绘出胆固醇线性图。实验结果见图3:胆固醇在0.3到300μΜ呈良好的线性关系，检测限是0.15μΜ。注:反应总体积为500yL。
[0034]实施例2
[0035]基于金/银核-壳纳米粒子比色法检测胆固醇的方法，包括以下步骤:
[0036]SH-PEG修饰的金纳米粒子的合成步骤:将所用到的所有玻璃器皿用王水浸泡，再用超纯水冲洗干净，烘干待用；将50mL浓度为ImM的HAuCl4溶液加热至沸腾，并在沸腾状态下持续搅拌，加入5mL浓度为38.8mM的柠檬酸钠溶液，继续保持沸腾15min;移除热源，搅拌15min，冷却至室温，制备得到金纳米粒子;取制备得到的金纳米粒子溶液ImL，并加入6mL，浓度为25mM的SH-PEG，在不断搅拌下于室温下反应2h，最终溶液在13200rpm，4°C下离心25min，离心三次后复溶在超纯水中，4°C保存，得到SH-PEG修饰的金纳米粒子。
[0037]金/银核-壳纳米粒子合成步骤:将SH-PEG修饰的金纳米粒子分散在600mMDEA缓冲溶液(pH=9.8，其中600mM的DEA中含有ImM MgSO4)中，并向其中加入2yL，0.25M的AgNO3混合均匀后，再加入31.25yL，0.667mM的p-AP，最终溶液体积为350yL，于室温下反应40min，即可制得金/银核-壳纳米粒子。
[0038]胆固醇检测步骤:将含有1.5mg mL—1的胆固醇氧化酶与不同浓度胆固醇(O，0.09,
0.5，5，25，50，100，150，200，300μΜ)的溶液混合，所述胆固醇溶液和胆固醇氧化酶溶液的体积比值为2，混合后的体积为150yL，充分混合后，在37 °C恒温水浴锅中反应30min后，将350μL金/银核-壳纳米粒子加入到以上150yL反应液中，于室温下反应30min，反应结束后，将最终溶液去扫描紫外-可见光谱。分析得到紫外吸收图谱，绘出胆固醇线性图。胆固醇在0.09到150μΜ呈良好的线性关系，检测限是0.04μΜ。注:反应总体积为500yL。
[0039]上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种基于金/银核-壳纳米粒子比色法检测胆固醇的方法，其特征在于，该方法包括:以胆固醇氧化酶为催化剂使胆固醇与氧气反应生成过氧化氢;将生成的过氧化氢与金/银核-壳纳米粒子表面的银纳米壳层反应，蚀刻银纳米壳层;利用紫外-可见光谱仪进行检测。2.根据权利要求1所述的一种基于金/银核-壳纳米粒子比色法检测胆固醇的方法，其特征在于，所述金/银核-壳纳米粒子的制备方法包括:将巯基化甲基聚乙二醇修饰的金纳米粒子分散在缓冲溶液中，并加入AgNO3混合均匀后，再加入对氨基苯酚，并于室温下反应10?40mino3.根据权利要求2所述的一种基于金/银核-壳纳米粒子比色法检测胆固醇的方法，其特征在于，所述缓冲溶液包括含有0.2-3mM MgSO4的pH为8-ll的浓度为550-650mM的DEA缓冲液。4.根据权利要求2所述的一种基于金/银核-壳纳米粒子比色法检测胆固醇的方法，其特征在于，所述AgN03的浓度为0.1?0.5M;所述对氨基苯酸的浓度为0.1?ImM。5.根据权利要求2-4任一所述的一种基于金/银核-壳纳米粒子比色法检测胆固醇的方法，其特征在于，所述巯基化甲基聚乙二醇修饰的金纳米粒子的制备方法包括:向金纳米粒子中加入巯基化甲基聚乙二醇，在不断搅拌下于室温下反应I?3h，反应结束后在12200?13200rpm，2-10°C下离心20?30min，离心后复溶在超纯水中，2-10°C保存，得到巯基化甲基聚乙二醇修饰的金纳米粒子。6.根据权利要求5所述的一种基于金/银核-壳纳米粒子比色法检测胆固醇的方法，其特征在于，所述金纳米粒子的制备方法包括:将玻璃器皿用王水浸泡，再用超纯水冲洗干净，烘干待用;将30-70mL浓度为0.5_3mM的HAuCl4溶液加热至沸腾，并在沸腾状态下持续搅拌，加入1-1OmL浓度为30-50mM的柠檬酸钠溶液，继续保持沸腾10_30min;移除热源，搅拌10-30min，冷却至室温，制备得到金纳米粒子。7.根据权利要求6所述的一种基于金/银核-壳纳米粒子比色法检测胆固醇的方法，其特征在于，所述金纳米粒子的直径为5-30nm。8.根据权利要求1所述的一种基于金/银核-壳纳米粒子比色法检测胆固醇的方法，其特征在于，所述以胆固醇氧化酶为催化剂使胆固醇与氧气反应生成过氧化氢的制备步骤包括:向不同浓度的胆固醇溶液中分别加入浓度为I?2mg mL—1胆固醇氧化酶，于30_45°C下温育0.3?Ih;所述胆固醇溶液与胆固醇氧化酶溶液的体积比值为3?I。9.根据权利要求1或8所述的一种基于金/银核-壳纳米粒子比色法检测胆固醇的方法，其特征在于，所述将生成的过氧化氢与金/银核-壳纳米粒子表面的银纳米壳层反应的步骤包括:将金/银核-壳纳米粒子溶液加入到所述以胆固醇氧化酶为催化剂使胆固醇与氧气反应生成过氧化氢的溶液中，并于室温下反应0.5?Ih小时。
【文档编号】G01N21/33GK105911047SQ201610200535
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月1日
【发明人】卫敏, 卫伟, 谢岩黎
【申请人】河南工业大学