利用人类外周血中DNA甲基化水平与生物节律相关性检测案件发生时间的方法与流程

本发明涉及一种利用人类外周血中dna甲基化水平与生物节律相关性检测案件发生时间的方法。

背景技术：

当前法医对刑事案件的时间推定，尤其是死亡时间的推定，主要通过如下手段并结合现场勘测等证据进行。

超生反应：由于人体各种细胞、组织和器官对缺氧的耐受能力不一致，临床死亡发生后能存活的时间也不一样。因此能够根据还具有生活能力的组织、器官对外界刺激所发生的反应判断死亡时间。

尸体现象：死亡后24小时内所发生的尸僵,尸斑，尸冷，自溶，角膜浑浊。死亡超过24小时发生的腐败，白骨化，尸蜡形成等

死后生化改变：死亡后肌酸激酶与肌钙蛋白等物质的水平存在随死亡时间延长而增长的现象。

其他还有如组织学改变，死前进餐时间等推定方法。但这些传统方法，都存在着一定的缺陷与不足，受周围环境的影响较大，时常不能给出较准确的时间推定。

生物节律(circadianrhythm)是一种内源性、持续的生理现象，呈现以约24小时为周期的变动。哺乳动物体内的细胞、组织、器官均存在生物节律，并随着外部环境的变化进行内源性的调整以保持相对的稳定性。因此，生物节律可以作为时间推定的一条新思路。

哺乳动物生物节律的调控起搏点位于下丘脑区域的视交叉上核，与一些外周节律起搏器共同维持机体的生物节律。根据现有研究，下丘脑视交叉上核主要通过一些由“节律基因”组成的转录—翻译反馈调控网络来调节生物节律。dna甲基化作为dna化学修饰的一种形式，能在不改变dna碱基序列的前提下改变表现型，在现有的研究中已证实，节律基因的甲基化水平与生物节律密切相关。

技术实现要素：

本发明旨在克服和补充传统司法鉴定时间推定方法受环境影响过大的缺陷，提供一种利用人类外周血中dna甲基化水平与生物节律相关性检测案件发生时间的方法。

所述方法包括如下步骤：

(1)检测正常人体外周血组织在不同时间点的dna的甲基化水平；

(2)根据步骤(1)的结果绘制标准曲线，所述标准曲线公式为：

其中，yij(t)是正常人体外周血组织i中cpg点j在时间点t的甲基化水平；μij为正常人体外周血组织cpg位点特异的均值，rj为振幅，ξj是相位；对结果p值进行bofferoni校正，对于cpg位点甲基化差异达到全基因组节律性表观显著水平的定义值为p<1.82e-7(＝0.05/275337)，而对于基因表达差异达到全基因组节律性遗传显著水平的定义为p<3.22e-6(＝0.05/15519)；

(3)检测待测样本的dna的甲基化水平yij(t)；

(4)将步骤(3)所测结果代入如下公式，通过计算得出时间点t，即为推算的案件发生时间：

yij(t)是样本i中cpg点j在时间点t的甲基化水平；μij为样本cpg位点特异的均值，rj为振幅，ξj是相位；εij(t)是时间t点上的随机误差；对结果p值进行bofferoni校正，对于cpg位点甲基化差异达到全基因组节律性表观显著水平的定义值为p<1.82e-7(＝0.05/275337)，而对于基因表达差异达到全基因组节律性遗传显著水平的定义为p<3.22e-6(＝0.05/15519)。

检测人外周血样本甲基化水平的试剂为本领域常规试剂，检测方法为本领域常规方法。

本发明通过检测人外周血样本甲基化水平，对刑事案件进行时间推定。将基因表达芯片和dna甲基化芯片中校正后的结果分别拟合到24小时的标准曲线上，之后统计检测信号强度yij(t)。得到结果发现在黄种人中，存在着408个节律性cpg位点，节律性cpg位点22点、24点时甲基化水平最高，而在10点、15点甲基化水平最低。根据该特征，对外周血样本的进行甲基化水平测定即能够得到相应的依据进行时间推定。

本发明方法不仅具有一定的精度，并且受外界因素影响较小。可以与传统方法互为补充，提高司法鉴定的准确度。

附图说明

图1为基于正弦曲线模型和弹性网状回归分析模型获取的408个节律性cpg位点所预测的人体节律时间与真实时间的相关程度；

图2为利用分析模型计算待测样本的节律时间，并检测与真实时间的相关程度。

具体实施方式

采集研究对象外周血

dna抽提与质检(qiamapdnabloodminikit)

1.取20μl蛋白酶k加入到1.5ml离心管中；

2.加入200μl全血都离心管中；

3.再加入200μlalbuffer到全血中；

4.涡旋振荡15s,充分混匀；

5.56℃孵育30min，每隔10min摇晃一次；

6.将孵育后的离心管低速点离(<3000rpm)；

7.加入200μl的无水乙醇到离心管中，涡旋振荡15s，低速点离(<3000rpm)；

8.将上一步操作中离心管内的液体全部转移到吸附柱内，同时不要将液体粘在吸附柱外沿，8000rpm、1min，离心后将吸附柱移入到一个干净的2ml收集管中(试剂盒提供)；

9.向吸附柱中加入500μlaw1buffer，同时不要将液体粘在吸附柱外沿，8000rpm、1min,离心后将吸附柱移入到一个干净的2ml收集管中(试剂盒提供)；

10.向吸附柱中加入500μlaw2buffer，12000rpm、3min，弃去收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中，12000rpm、1min；

11.将吸附柱移入一个干净的1.5ml离心管内(自备)，向吸附柱内加入100μlaebuffer，室温静置3-5min，8000rpm、1min，取收集管内液体，重新加入到吸附柱，室温静置2min，8000rpm、1min，取1.5μldna用做质量检测，其余置于-20℃冻存备用。

亚硫酸氢盐预处理

1.试剂准备：往试剂盒中的ctconversionreagent干粉试管中添加750μl无酶水，210μlm-dilutionbuffer。使用涡旋振荡器充分震荡，使粉末熔化至看不到冰晶，置于抽屉中避光备用；

2.杂交炉准备：将杂交炉的温度调至37℃，使其能够提前升温备用；

3.取200-500ngdna，用水定容至45μl；

4.添加5μlm-dilution试剂混匀至45μldna中；

5.置于提前预热好的37℃杂交炉中孵育15min；

6.添加提前溶解好的ctconversionreagent100μl至孵育好的dna中，使用枪吹打混匀，并将150μl体积混合液均分装成两管；

7.使用pcr仪器过夜，条件：95℃、30s，(60℃、60min)*16cycle，4℃保存。

8.试剂准备：添加24ml无水乙醇至6mlm-washbuffer中备用；

9.添加400μlm-bindingbuffer到试剂盒配套的过滤柱中，颠倒湿润柱子；

10.把样品转入到已添加了bindingbuffer的柱子中，颠倒混匀，是bindingbuffer能够和dna样品混合液充分混匀，10000g，20s离心；

11.加入100μlm-washbuffer至柱中，30s离心；

12.加200μlm-desμlphonationbuffer至柱中，室温静置15min，然后离心30s，丢弃收集管中的废弃液；

13.添加200μlm-washbuffer至柱中，离心30s，再添加200μlm-washbuffer至柱中，离心30s；

14.将柱子转移至一新的1.5ml的离心管中，加10μlm-elutionbuffer，离心30s，将离心后收集管中的液体重新转移到柱子中央，进行第二次离心，此时得到的离心管中的产物即是经过亚硫酸氢盐处理后，可以用做甲基化芯片上样的dna。

15.使用nanodrop检测dna的浓度。

全基因组组扩增

1.编排好dna芯片上样顺序；

2.稀释naoh至0.1n；

3.提前将杂交炉调至37摄氏度预热，备用；

4.添加ma120μl至msa4(96孔板)的目标孔

5.按照实验前编排的上样顺序转移200ng左右的dna至目标孔，并做好记录；

6.添加4μl的提前稀释好的naoh，1600rpm，震荡1min；280g，离心30s；

7.室温下孵育10min；

8.往msa4中添加68μlrpm，75μlmsm；

9.1600rpm，震荡1min。280g点离；

10.将msa4放在在提前预热好的37℃杂交炉中孵育20hr。

dna片段化

1.试剂准备：提前将试剂盒中的ra1，pm1，fms融化至室温，并在280g的条件下离心1min；

2.提前加热恒温仪至37℃，杂交炉48℃备用；

3.朝msa4的目标孔中添加50μlfms；

4.加盖，1600rpm，震荡1min；280g，点离；

5.将msa4置于恒温仪中37℃加热1hr；

6.将恒温仪预加热至95℃备用；

7.添加100μlpm1至msa4的目标孔；

8.加盖，1600rpm，震荡1min；

9.37℃孵育5min；

10.280g，4℃离心；

11.朝msa4的目标孔中添加300μl无水乙醇；

12.加新盖，用相同大小的盒子压住盖子，上下颠倒混匀10次；

13.4℃，孵育30min；

14.3000g，4℃离心20min立即倒掉上清，倒扣于无尘纸上，可见蓝色沉淀；室温干燥1hr；

15.添加46μlral至msa4目标孔的沉淀中，盖上热盖膜，加热3s；

16.将msa4移至48℃杂交炉中，加热1hr；

17.将msa4在1800rpm的转速下，震荡1min；280g，离心1min；

18.将msa4移至95℃恒温仪中，变性30min；

19.室温放置20min至冷却；

20.280g离心1min；

21.取出杂交盒，在杂交盒的芯片槽两端的凹槽中添加400μl的pb2溶液；

22.将芯片放在杂交盒内的gasket上，芯片的每个点样孔中加入15μl变性后的dna样品，每张芯片可同时检测12个样本；

23.将芯片放入杂交盒的芯片槽内，将杂交盒放入杂交炉中48摄氏度杂交16hr。

单碱基延伸、染色、数据扫描

1.试剂准备：取出芯片试剂盒中配套的xc1、xc2、tem、stm、atm缓冲液，室温放置直到溶解，3000g，离心3min；配制95％去离子甲酰胺/1mmedta缓冲液；

2.向芯片实验配套的玻璃槽中添加200ml的pb1缓冲液；

3.往黑色的芯片专用槽中加pb1缓冲液150ml；

4.打开与全自动样本处理系统(tecan)的电脑，打开tecan的电源，将循环水浴箱的温度44℃预加热，运行infiniumrobotcontrol软件，清洗tecan加样针；

5.从杂交炉中取出杂交盒，取出芯片，室温下放置25min冷却至室温，小心的撕去芯片表面的透明薄膜；

6.将芯片置于芯片架上，然后将芯片架放入加有pb1缓冲液的玻璃清洗槽中，上下提动芯片架30次，约1min左右，接着放入另一玻璃清洗槽中，重复操作，以此来取出芯片上多余为杂交的和非特异结合的dna；

7.将从芯片夹上取出来的芯片放入加有pb1缓冲液的清洗槽中的对齐框上，每张芯片上面尽量对齐放置一个spacer，再用玻璃盖住芯片，用专用卡子将玻璃、spacer，芯片固定住，剪去两头多余的spacer；

8.tecan上按照软件程序设定的位置放入xc1、xc2、xc3、tem、stm、atm、ra1和95％去离子甲酰胺/1mmedta缓冲液，将芯片逐个放入tecan加样槽内；

9.运行infiniumrobotcontrol软件，在tecan上进行xstainhd单碱基延伸和荧光染色等各个步骤(3.5h)；

10.试剂准备：取310mlpb1缓冲液至芯片清洗槽中，备用；

11.程序完成后，取下芯片，冷却至室温，去掉玻璃和spacer；

12.将芯片放入已加好310mlpb1缓冲液的清洗槽中，上下提10次洗脱，孵育5min，再将芯片放入xc4缓冲液中进行包被，上下提10次，孵育5min；

13.用真空干燥仪将芯片完全干燥(约1hr)；

14.取出芯片，用无水乙醇湿润的无尘清洁布清洁芯片边缘和背面，注意不要有空气；

15.打开与iscan扫描仪连接的电脑将提前下载好的芯片解码文件存入电脑扫描软件默认的读盘位置。打开扫描仪的电源，使电脑能够检测到连接上了扫描仪。打开iscancontrolsoftware软件，按start键之后扫描仪自动弹出tray，将芯片放入tray上，关闭tray。根据软件的指引，设置数据存储的路径，软件自动找到需扫描芯片的类型。点击scan键，系统自动运行，扫描完毕后点击done，退出扫描系统。

数据处理

使用genomestudio进行芯片数据的初步分析

1.首先下载与所用芯片illumina450k相对应的背景信号值的文件载入到与装有genomestudio的计算机genomestudio中默认的路径中；

2.将扫描成像系统的扫描原始文件上传到同一台计算机中；

3.打开genomestudio软件，选择methylation选项；

4.选择infium选项；

5.与illumina450k芯片对应的assaytype为infinium，选择next；

6.依照引导语，直至finish。

7.根据需要，选择需要查看的窗口；

8.analysis->viewqcdashboard；可以检查芯片实验流程中的各阶段的实验是否成功；

9.根据需要调整columnstypes；avg-beta和intesity，根据是否需要，选择p-value；

10.查看本实验的methylationprofile；

11.导出样本数据结果值；

12.根据samplemethylationprofile以及记录的dna芯片上样顺序，可以知道具体的某一研究对象某一时间点的甲基化水平。

13.对8个研究对象分别在6个时间点(0点，4点，8点，12点，16点，20点)抽取全血，通过芯片检测全基因组甲基化水平。

14.利用正弦曲线模型和弹性网状回归分析模型获取408个节律性cpg位点用于预测节律。f(生理节律时间)＝b0+b1f’(cpg1)+…+b408f’(cpg408)+error；其中f’(cpg)是通过单个cpg甲基化程度所计算的生物节律时间，error是估计残差。对于多个位点的时间估计结果如图1所示。

15.利用步骤14获得的节律性甲基化位点和统计模型，计算甲基化预测时间＝inverse.f(b0+b1f’(cpg1)+…+b408f’(cpg408))。对于待测样本，通过预测模型，可以判定该样本离体时样本来源个体所处的生物节律时间段，从而为司法鉴定的时间推定提供证据。图2展示待测样本利用预测模型所得到的检测结果。