用于检测核酸、核酸的甲基化状态和突变体的包含信号对和疏水性核苷酸、无茎信标的寡...的制作方法

专利名称：：用于检测核酸、核酸的甲基化状态和突变体的包含信号对和疏水性核苷酸、无茎信标的寡...的制作方法
技术领域：
：本发明涉及检测核酸序列的状态，如存在、表达、曱基化和/或突变，特别是单点突变，以及其中正确靶和其它靶之间的差异可小至一个核苷酸的其它序列的领域。本发明涉及包含信号对(例如荧光团和猝灭剂)以及至少一个疏水性核苷酸的寡核苷酸和寡核脊酸类似物。本发明还涉及通过使用寡核苷酸类似物和容易获得的仪器检测序列差异和优化条件的新方法。特别地，本发明涉及使用包含信号对和至少一个疏水性核苷酸的寡核普酸或寡核苷酸类似物(如包含嵌入剂的核苷酸类似物)特异性检测耙核酸的量或检测一个与其它序列的差异可小至一个核苷酸的序列。
背景技术：
：核酸(如DNA和RNA)以及许多核酸类似物，如PNA、HNA、MNA、ANA、LNA、INA、CNA、CeNA、TNA、(2'-NH)-TNA、(3'-NH)-TNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、P-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、双环-DNA、6-氨基-双环-DNA、5-表-双环-DNA、a-双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0-DNA、双环[3.2.1]-DNA、双环[4.3.0]酰胺-DNA、J3-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃来苏糖基-NA、2'-R广RNA、2'-0R广RNA(Ri为任何取代基)、a-L-RNA、a-D-RNA、P-D-RNA和其它类似物，能够与互补核酸链特异性杂交。此特异性识别可用来检测规定的核酸序列的存在，例如用于诊断目的。可以检测核酸序列之间的微小差异。也可以确定给定基因存在的mRNA的量，进而描迷该特定基因的表达水平。许多可用分析依赖于通过互补的可检测探针来检测特异的核酸。通常14需要分离未结合探针和结合探针以检测所述特异性核酸，而这通常需要多个费时的分离步骤。DNA诊断学是发展最快的研究领域之一，并且现在随着可获得的人基因组图谱(旨在获得详细的全序列)的日益详细，人们对此领域的关注有望进一步扩大。已报道了具有142万个单核苷酸多态性(SNP)的图谱，预计至少有60,000个SNP位于人外显子中。有趣的是，两个人之间的基因组DNA序列的差异平均约为每IOOO个核苷酸有一个核苷酸差异。因此，特异性DNA序列可用于确定个体的身份。此外，突变可指示临床病症的诱因。遗传病的一个经典实例就是镰状细胞贫血，一种由单个基因(p-球蛋白基因)的单个tt变化(第6个密码子处的GAG变为GTG)引起的遗传缺陷。搜索仅有一个或两个威基差异的序列为高效(快速和易于进行以及经济)检测核酸序列的工具创造了需求。生物学的另一个主要领域;l^因組的甲基化。基因组中"CpG'，对的甲基化是表观遗传信息的关键组成，并在印迹以及包括精神障碍、肿瘤生物学和病毒感染在内的多种临床情况中显示发挥重要功能。检测基因曱基化状态常用的灵敏技术是使用亚硫酸氬钠处理基因组DNA，将所有未甲基化的胞嘧啶"C"转化为脱氧核糖尿嘧啶"dU，，，而甲基化的胞嘧啶"MeC"则不反应，然后进行扩增反应。亚石克酸氢盐处理基因组DNA将DNA转化为富含"A-T"的，基本上是三核普酸的基因组(甲基化"CpG"对中存在的"MeC"例外)，曱基化的或未曱基化的"CpG"对的差异就转化为序列的差异(参见图5)。使用曱基化特异性PCR(MSP)时，可以在扩增之后通过测序、限制性酶切消化或在凝胶电泳之后通过凝胶上条带的存在与否对DNA进行分析。可选地，可使用MSP和非特异性染料对DNA进行实时PCR分析。由于富含"A-T"的DNA亲合力相对较低和辨别单个"C"和"T"核苷酸存在困难的性质，亚碌u酸氢盐处理的DNA富含"A-T"的性质给扩增分析中的引物和探针带来了特殊的难题。例如，检测核酸序列突变的不同技术包括单链构象分析、变性梯度凝胶电泳、异源双链体分析、化学错配裂解和直接测序。Grompe(M.Grompe(1993)Ato紅eGe"幼cs，5:111-117)对这些技术进行了综述。在这些众多的:汰术中，也可以使用基于荧光的方法。实时聚合酶链式反应(RT-PCR)的发明以快速和准确的方式革新了确定基因状态(如表达)(实时逆转录酶聚合酶链式反应)的方法，但是该技术也用于辨别相似的乾。尽管此技术已有许多进步，但仍未满足改进这些技术的需要。当今使用最广泛的一些探针包括分子(Molecular)信标、TaqMai^探针(TaqMan是RocheMolecularSystems,Inc的注册商标)、蝎形(Scorpion)引物和双杂交FRET探针(Arya等(2005)iev.Mo/.Z)zagn.5:209-219最近对此进行了综述)。在不同的应用中，每种技术彼此都各有优缺点。所有这些技术共同的缺点就是设计困难，通常需要计算机软件或专家的辅助和较长时间的优化才能工作(软件的实例为程序，如美国AppliedBiosvtems(www.appliedbiosvstems.com)提供的PrimerExpress、PremierBiosoft(www.premierbiosoft.com)提供的BeaconDesigner和Primer3(版权所有(c)1996,1997,1998,1999,2000,2001，2004,WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch，j呆留所有4又利("http:〃frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3www.cgi))。TaqMar^分析使用基于DNA的包含由荧光团和猝灭剂组成的信号对的探针。该方法优选需要所述荧光团和所述猝灭剂位于探针的相反末端以实现可达到的最好信噪比。在PCR反应的扩增过程中，所述探针与其被扩增的耙序列特异性杂交。当到达TaqMai^探针时，Taq聚合酶通过使用其外切核酸酶活性降解该探针，所述荧光团因此可以自由远离猝灭剂，避免猝灭信号。通过所迷外切核酸酶活性产生的荧光与存在的乾序列的量相关。知道PCR反应的效率，即可使用所述焚光信号计算耙序列的起始量。已报道了对TaqMaif探针的一些改进，以优化TaqMar^分析的特异性和灵敏度。这些改进包括引入小沟结合物和核苷酸类似物，如用于增加对靶序列的亲合性和能够使用较短的探针的锁核酸(LoekedNucleicAcid)(参见详细的说明和下文的参考文献)。但是，在所有已报道的TaqMan⑧分析中，完整探针的荧光团的猝灭依赖于随机巻曲螺旋(coilhelix)的形成。分子信标("发夹"或"茎环(stem-loop)"探针)包含两个茎序列，探针的每个末端各有一个，如果没有可用的耙序列与分隔所述两个茎序列的序列(环序列)杂交互补，则它们将能形成双链体。所述探针通常包含由连接至该探针相反末端的荧光团和猝灭剂組成的信号对。当形成茎时，荧光团和猝灭剂就会因此接近，从而猝灭信号。但是如果所述环序列与靶序列杂交，所述的两个茎序列和所述荧光团和猝灭剂就会因此分开，允许产生和读取信号。由于所述探针没有或只有很小的背景信号，因此据称分子信标可用于同质性分析和活细胞中的耙序列检测。所述分子信标的茎序列与輩巴序列无关。适当的茎形成和稳定性依赖于茎的长度和G:C含量以及其溶于其中的緩冲液的条件。因为把序列的G:C含量、长度和可能存在的非耙序列的相似程度可能也会有所差异，环序列的长度和G:C含量将会随探针不同而不同。因此有必要使用优化的茎序列，所述茎序列依赖于环序列。此外，所述分子信标不仅将竟争扩增子的重新退火，而且将竟争所述探针的分子内退火。也已发表了一些关于无茎信标(线性信标)(包括基于DNA和PNA的无茎信标)的先前技术。DNA无茎信标(Myanard，US2005/0227247)被赋予了耐受5'至3'外切核酸酶活性消化和聚合酶3'延伸活性的能力。当探针未结合时，置于探针一端的荧光团^皮置于所述探针另一端的猝灭剂的猝灭，受随机螺旋巻曲形成的控制。Maynard教导报道分子和猝灭剂分子优选隔开18或20个碱基，以实现最佳的信噪比。该文件和其先前技术声称此比值强烈依赖于探针的长度。对核酸酶消化的抗性是这些无茎信标的固有属性，所以这些探针不能用于核酸酶依赖性分析，如TaqMai^分析。Gildea等(WO1999/21881)介绍了基于PNA的包含信号对的线性信标，所述对的两个部分位于探针的两端。该发明和基于DNA的线性信标的发明的不同在于Gildea情形中的主链单体单元是PNA而不是DNA的主链单体单元。他们教导我们探针背景的降低是因为PNA的作用方式，并且相似长度和标记构型的核酸和PNA探针的结构和功能显然不同。据说，该文件中描述的探针应不受下列因素中的两个因素的影响探针长度、Mg^+浓度、緩冲液的离子强度以及荧光团和猝灭剂之间的光谱重叠，前三个因素一般仅在PNA和一些其它基于DNA类似物的探针中观察到。该文件没有描述包含插入探针中的疏水性分子的寡核苷酸类似物。该文件描述的探针也部分具有核酸酶消化抗性(PNA的固有属性)，因此这些揮^十不能用于核酸酶依赖性分析，如TaqMan⑧分析。在先前技术中，已描述了包含信号对的核普酸和核苷酸类似物Kutyavin和同事将MGB分子接合至探针的3'-端，并将其用于5'-核酸酶PCR分析中(Kutyavin等(2000)Wwc/"ci^;s.28:655-661),同一实验室还描述了一个叫做Eclipse的系统，其中MGB连接至探针的5'-端，并且不需要聚合酶的核酸酶活性Afonina，L等(1997)M/de/cjc/必i"25:2657-2660)。在这两个系统中，多态性^tt(潜在的错配点)应置于距MGB连接位点约5个核苷酸的地方，以产生匹配乾和错配耙的最佳的辨别，这与普通的基于DNA的探针相反，先前的研究表明，如果多态性碱基被置于该类探针的中央，则其具有最高的熔解温度差异以及最高的特异性。探针未结合时荧光的猝灭受限于随机巻曲。设计选项受限制可能是一个不利条件，因为探针设计经常必须具有高度的灵活性，以避免形成不需要的二级结构。Letertre等2003显示，锁核酸LNA可以用于5'-核酸酶PCR分析，其结果与使用MGBTaqMan⑧探针获得的结果相当(Letertre，C.等(2003)Mo/.Ce〃户roZ^17:307-311)。但是，难以设计最佳的包含LNA的探针有两个原因第一，LNA核苷酸具有核酸酶抗性，而在5'-核酸酶分析中所述探针需要被降解，第二，LNA核苷酸具有极高的自亲合性，因此如果不精心设计就将形成二级结构。先前已表明，仅具有少量LNA核苦酸的DNA-LNA杂种可以形成的二级结构如此稳定，以至于所述探针无法与互补的单链DNA靶杂交(Filichev等(2004)C/iem6/oc/je附.5:1673-1679)。Seitz，O.(2000)4"g￡w.J加五d39:3249-3252)介绍了无茎肽核酸(PNA)信标。未结合靼核酸时，PNA信标趋向于折叠成致密的随机巻曲螺旋，而这经常是不合需要的。尽管基于PNA的技术相比基于DNA的技术在某些方面具有一些优点，但是它们比基于DNA的技术更加昂贵，并且在合成和发现最佳条件方面比基于DNA的分析提出更多挑战。因为PNA由蛋白质和寡核香酸组合构成，所以PNA的行为不总是易于预测。WO2004/033726介绍了在存在由连接了荧光团的探针和为双链嵌入剂的自由浮动猝灭剂分子组成的荧光系统的条件下，测量扩增样品中的荧光。WO1999/21881、US2002/0064772和EP1484337介绍了包含PNA和对离子强度、镁浓度、荧光团和猝灭剂之间的光镨重叠和探针长度不敏感的相关分子的线性信标。这些专利中没有包括或讨论包含疏水性分子的探针。US2005/0233360介绍了具有荧光团和靠近位于探针同一端的捽灭剂的探针。与互补核酸杂交后，所述荧光团或所述猝灭剂之一将与形成的双链体(通过嵌入或小沟结合)相互作用，所述荧光团将能够发荧光而不被猝灭。WO01/73118介绍了包含荧光团和任选地猝灭剂的探针。所述荧光团的行为的不同将取决于輩巴核酸中是否存在错配，并借此辨别彼此。所述探针还可用于解链温度点分析(meltingpointanalysis)。所述探针通常必须封闭3'-端以避免延伸。US2005/0227247介绍了荧光团位于一端而猝灭剂位于另一端的探针的使用，其中所述探针在3'末端的一个或多个硫代磷酸酯(phosphorthioate)插入物保护该探针不受5'至3'外切核酸酶的降解。荧光团会因随机巻曲而发生猝灭。US2005/0227257介绍了探针双链体的使用，其中一条链包含荧光团，而另一条链包含猝灭剂。一条链比另一条链长，并且如果探针对的两条链彼此结合，则所迷猝灭剂和荧光团将靠近^:置。但是当存在完全互补的靶时，所述较长的探针将优先与该靶结合，从而将所述荧光团与猝灭剂分隔开来，进而允许发荧光。探针的猝灭受探针系统两个部分的双螺旋形成的控制。US2005/0064463介绍了可任选地以荧光团和猝灭剂标记以及在探针末端包含小沟结合物(MGB)的探针。MGB增加了互补DNA的亲合力，US1999/5925517和US2000/6103476介绍了称作"分子信标"的发夹探针。所述探针包含各自位于寡核苷酸或寡核香酸类似物一端的荧光团和猝灭剂。所述寡核苷酸或寡核苷酸类似物划分为不同的序列当所述探针未结合任何靶核酸时，序列l和3构成发夹结构的茎，而序列2则与靶核酸互补。背景焚光依赖于序列1和3之间的双螺旋形成。WO03/052132介绍了包含嵌入的假核苷酸以增加对乾核酸的亲合力、增加核酸酶稳定性的发夹探针(因为荧光标记物和/或降低自亲合性)。该发明和说明书未讨论本发明的"无茎信标"的积克念。该文件还介绍了使用互补探针检测靶核酸，但是与本发明的发现不同，其未介绍未结合探针的无茎猝灭。US2000/6037130介绍了具有较短波长收获体和较长波长发射体和猝灭剂的三标记发夹揮:针。与标准的分子信标相比，存在的额外荧光团增加了荧光产生，并因而增加了信噪比。US2002/6355421介绍了发夹形PNA分子信标的方法、试剂盒和组合物。该文件未介绍无茎信标的概念。US2005/0158720介绍了三联分子信标(TMB)，该信标包含三个寡核苷酸组件一个形成发夹结构，另外两个则与形成的茎的两侧分别互补。本专利申请引用的所有专利和非专利参考文献在此也整体结合入本文。
发明内容科学家长期以来一直希望能够检测、定量和鉴定核酸的靶序列。已开发了几种用于该目的的技术，如"分子信标"("发夹探针")和"TaqMan"，但是所有现在可用的工具和技术都具有一些局限和缺点。分子信标是在实时PCR的退火温度下，不但必须竟争扩增子的重新退火，而且必须竟争探针的分子内退火的发夹性探针。因此探针的优化、严格条件和设计是必须的。但是与分子内茎形成的形成不同，TaqMan探针依赖于随机巻曲的螺旋结构来猝灭未结合探针的荧光以及依赖于聚合酶的核酸酶活性来"激活"荧光团。异乎寻常的是，本发明公开了共价插入寡核苷酸或寡核苷酸类似物的疏水性分子促进了未结合寡核苦酸的折叠，并且同时所述疏水性分子不会阻止与靶序列(如果存在)的杂交。本发明首次提出的探针结合了疏水性分子屏蔽或减少疏水性表面与水溶液接触(通过与其它疏水性分子相互作用)的趋势和两部分信号对之间增加的相互作用(寡核苷酸类似物的每半边各有一部分)(参见图1)。因此，本发明提到的未结合探针信号对之间的相互作用不单是因为随机螺旋巻曲，而且另一方面不需要分子内设计茎结构以影响未结合探针的猝灭。与先前公开的"分子信标"相似的是，本发明所述探针具有很好的信噪比。所以根据本发明的探针在此也叫做"无茎信标"。本发明所述无茎信标一般短于其相应的分子信标，原因是它们一般不包含互补区(即无"茎")。它们更易于设计和优化，并且疏水性基团的存在可以进一步简化所述探针的纯化。如上所述，它不需要:&计分子内自退火延伸区，其退火温度必须高于读数温度并低于其竟争结合靶核酸的温度。本发明所述的无茎信标比其相应的没有插入疏水性分子的线性探针具有更好的信噪比，并可用于核酸酴农赖性以及核酸酶非依赖性分析。分子探针的主要挑战之一就是如何能够辨别差异小至一个核苷酸的非常相似的靶。一般而言，探针越短，一个错配对亲合性的影响越大，因此就越容易辨别完全互补乾和错配的乾。本发明介绍了易于设计和具有低背景荧光的一种新型分子探针。所述探针由核苷酸和/或核苷酸类似物、信号对(例如荧光团和猝灭剂)和至少一个额外的疏水性部分组成，该疏水性部分将有助于实现比不包含所迷疏水性分子的所述核苦酸或核苷酸类似物更好的信噪比。本文所述探针可用于许多不同的应用，包括诊断乾核酸(如特殊等位基因、单核苷酸多态性(SNP)、突变和甲基化状态(表观遗传信息))的表达、存在。因此，本发明的第一个目标是提供包含信号对和至少一个疏水性分子，优选地为下文所迷疏水性核苷酸的寡核苷酸类似物，其中所述寡核苷酸类似物的信噪比显著高于或低于(与值1不同)相应的不包含所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的信噪比。因此，本发明的目标是提供包含信号对和至少一个疏水性核苷酸的寡核苷酸类似物，其中所述疏水性核苦酸具有通用结构X誦Y-Q其中X是核苷酸或核苷酸类似物或能够掺入核酸或核酸类似物主链的主链单体单元，Q是本发明所述疏水性分子，并且不参与特异性氢键合，也不是信号对的部分；和子的连接体部分其中，当所述寡核香酸类似物由未与靶核酸杂交变为与耙核酸杂交或相反时，所述寡核苷酸类似物的信噪比显著好于相应的不包含所述疏水性分子、由与所述寡核苷酸类似物相同的核香酸序列组成的寡核苷酸或寡核苷酸类似物和所述耙核酸的杂种(相应的杂种)的信噪比。更具体地说，本发明的目标是提供包含n个核苷酸和/或核苷酸类似物的连续序列和至少一个疏水性核普酸的寡核脊酸类似物，其中所迷寡核香酸类似物共价连接至信号对，其中所述疏水性核香酸具有通用结构X國Y-Q其中X是核苷酸或核普酸类似物或能够摻入核酸或核酸类似物主链的主链单体单元，Q是不参与沃森-克里克(Watson-Crick)氬键合的疏水性分子；和Y是连接所述核普酸或核普酸类似物或主链单体单元和所述疏水性分子的连接体部分；和其中n是至少为4的整数；和其中所述至少一个疏水性核苷酸被置于距一端最多9个核苷酸和/或核普酸类似物的位置；和其中所述信号对由两部分系统组成，其中一个部分^:置于距5'端6个核苷酸和/或核苷酸类似物以内的位置，而另一个部分^L置于距3'端6个核苷酸或核苷酸类似物以内的位置；其中所述信号对的所述部分与所述疏水性核苷酸不同，条件是当所述信号对的一个部分作为悬挂端被置于5'端时，则5'端的第一个核苷酸或核苷酸类似物不是疏水性核苦酸；当所述信号对的一个部分作为悬挂端^皮置于3'端时，则3'端的第一个核苷酸或核苷酸类似物不是疏水性核苦酸。应注意的是，虽然一些疏水性分子单独或作为对的一部分可产生可检测的信号，但是上述疏水性分子并不净皮认为是所述信号对的部分。因此，所述寡核苷酸类似物包含疏水性核苷酸和信号对的两个部分。发明人还发现具有增强的核酸酶稳定性的寡核普酸类似物可以用于在例如扩增反应之后确定终点，所述核酸酶包括包含外切核酸酶活性的聚合酶。因此本发明的第二个目标是提供使用具有增强的外切-和/或内切-核酸酶稳定性的寡核苷酸类似物(例如本发明所述的任何寡核苷酸类似物)的方法和可以用于检测和/或鉴定大量不同的扭序列的标准条件。这些方法还可用作优化特异性分析的条件的快速方法。因此，本发明的目标是提供检测本发明所述寡核苷酸类似物和核酸混合物中的乾序列之间的杂交的方法，所述方法包含如下步骤1)提供可能包含耙序列的核酸混合物；和2)提供本发明所述寡核苷酸类似物；和3)将所述核酸和所述寡核苷酸类似物在允许杂交的条件下孵育；和4)检测杂交。提供在扩增过程中检测、鉴定和/或定量本发明所述寡核苷酸类似物和冲莫丰反中的乾序列之间的杂交的方法也是本发明的目标。a)提供适合用于检测、鉴定和/或定量乾序列和/或突变体序列的核酸混合物；和b)提供包含扩增酶的扩增緩沖液、引物组和本发明所述寡核苷酸类似物，其中所述引物和所述寡核苷酸类似物能够与所述靶序列和/或突变体序列杂交，所述扩增酶能够以模板指导方式延伸引物，而所述扩增緩冲液包括扩增酶执行此延伸所必需的物质(引物和才莫板除外)；和c)将引物和寡核脊酸类似物与核酸混合物在允许所述引物发生杂交的条件下孵育；和d)使用杂交的序列通过所述扩增酶和核苷酸、核苷酸类似物、寡核苷酸或寡核苷酸类似物进行所述引物3'端的才莫板延伸；和e)将核酸、延伸产物和寡核普酸类似物在允许杂交的条件下孵育；和f)检测杂交；和任选地重复步骤c)至f)。本发明进一步的目标是提供检测或鉴定耙和/或突变体序列以及快速确定同质性分析的最佳读数温度范围的通用方法，其中所述方法包含上文所述的检测杂交的方法，其中将下列步骤添加至最后一步之后5)将所述混合物变性，然后快速冷却至设定温度(起点高于亲合温度)；和6)测量信号对的信号；和7)通过重复步骤1)至3)确定包含信号对的所述核酸类似物的亲合力，同时逐渐降低步骤l)中的温度，直至该温度降低至低于亲合温度。提供包含下列步骤的确定杂交的方法也是本发明的目标a)提供包含n个核苷酸和/或核苷酸类似物的连续序列和至少一个疏水性核苷酸的寡核苷酸类似物，其中所述寡核苷酸类似物共价连接24至由两部分系统组成的信号对，其中所述疏水性核苷酸具有通用结构X誦Y國Q其中X是核苷酸或核普酸类似物或能够掺入核酸或核酸类似物主链的主链单体单元，Q是不参与特异性沃森-克里克氬键合的疏水性分子；和Y是连接所述核苷酸或核苷酸类似物或主链单体单元和所述疏水性分子的连接体部分；和其中n是至少为6的整数；和其中所述信号对的两个部分的距离在所述寡核苷酸类似物未与靶序列杂交时比所述寡核苷酸类似物与靶序列杂交时更近；和b)提供可能包含所述寡核苷酸类似物的靶序列的核酸混合物；和c)将所述核酸和所述寡核苷酸类似物在允许杂交的条件下孵育；和d)通过确定所述信号对的所述部分是否靠近而检测杂交；e)进而确定杂交。本发明进一步的目标是提供检测、鉴定或定量和快速确定扩增反应的最佳读数温度范围的通用方法，其中所述方法包含如下步骤1)提供适合用于检测、鉴定和/或定量把序列和/或突变体序列的核酸混合物；和2)提供引物组、扩增緩冲液(包含扩增酶)和寡核苷酸或寡核苷酸类似物，其中所述寡核苷酸或寡核香酸类似物具有核酸酶抗性和/或所述扩增酶不包含任何核酸酶活性；和3)将所述引物和寡核苷酸或寡核苷酸类似物与所述核酸混合物在允许杂交的条件下孵育；和4)检测杂交；和255)测量信号强度时按照一定的幅度逐渐增加温度，直至达到所需的延伸温度，和6)完成延伸反应，将形成的扩增子变性，然后重复步骤c)至f),直至发生所需的扩增。提供扩增乾序列的方法也是本发明的目标，所迷方法包含如下步骤1)提供任选地包含所述耙序列的核酸混合物；和2)提供引物组、扩增緩冲液(包含扩增酶)和寡核苷酸或寡核苷酸类似物，其中所述引物和所述寡核苷酸或寡核苷酸类似物能够与所述靶序列或其互补序列杂交，条件是当所述扩增酶包含核酸酶活性时，所述寡核苷酸或寡核苷酸(oligonucletide)类似物具有核酸酶抗性；和3)将所述引物和寡核苷酸或寡核苷酸类似物与所迷核酸混合物在允许杂交的条件下孵育；和4)检测杂交；和5)检测杂交时按照一定的幅度逐渐增加温度直至达到所需的延伸温度，和6)完成延伸反应，将形成的扩增子变性，然后重复步骤3)至6)，直至发生所需的扩增。此外，还公开了如何使用至少两个本发明所述无茎信标表征单核苷酸多态性和辨别其它非常相似的核酸。因此本发明的第三个目标是向核酸混合物提供至少两个无茎信标，其中所迷无茎信标用与每个预期可能的基因型分别同源互补的不同信号对进行标记。本发明的第四个目标是提供包含无茎信标的试剂盒。图1A)当不存在互补靶时，无茎信标的疏水性分子会彼此相互作用，使荧光团(圓点)和猝灭剂(黑色方块)靠近。因此荧光团^皮猝灭。B)如果加入或形成了互补靶，例如在扩增反应过程中，无茎信标将会展开并与该靶结合。c)当无茎信标与其互补靶结合时，荧光团和猝灭剂将不再靠近，因此荧光团将会发荧光。图2无茎DNA(TaqMan样)序列(填充标志物，FAM-AAAAATCCCGCGAACTCC-BHQ1)[SEQIDNO:l]和可比较的具有4个包含疏水性分子的假核苷酸(用2表示，3-(3,4-二羟基丁基)-7,9-二甲基吡啶并[3',2':4，5]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4卿國酮)的磷酸二酯(phosphordiester)的插入物，包含下文的疏水基团XXVI)插入的无茎信标(中空标志物，FAM-A2AAA2ATCCCG2CGA2ACT-BHQ1)[SEQIDNO:2]分別与其匹配(菱形，GCGGGAGTTCGCGGGATTTTTTAG、[SEQIDNO:39]和错配(方块，GTGGGAGTTTGTGGGATTTTTTAG)[SEQIDNO:40]的DNA靶杂交的解离曲线。显然，无茎信标SB的背景荧光大大低于DNA探针的背景荧光。如果仅DNA或SB和DNA探针二者均与靶寡核苷酸杂交，则该区域分别加芏或^下划线。杂交区域中的错配用灰色突出显示。标签"2"指插入的假核苦酸(3-(l-0-(4,4'-二曱氧三苯基曱基(dimethoxytriphenylmetyl))-2-0-(2-氰乙基二异丙基酰氨亚磷酸盐)-l,2-丁二醇)-4-N-(7,9-二甲基-3H-吡啶并[3',2':4，5]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-酮)的亚磷酰胺)包含下文所述的编号为XXVI的嵌入疏水性基团。图3无茎信标(SB，中空标志物，FAM-T2AGG2GCGT2TTTT2T-BHQ1)[SEQIDNO:3]和无茎DNA(TaqMan⑧样探针)(实心标志物，FAM画ATTTTAGGGCGTTTTTTTG誦BHQ1)[SEQIDNO:4]与其匹配的華巴(菱形，CCGCAAAAAAACGCCCTAAAATCCC、[SEQIDNO:5]和错配的乾(方块，CCGCAAAAAAACACCCTAAAATCCC、[SEQIDNO:6]退火的解离曲线的负导函数的比较。虽然所述DNA中还有6个互补核tt，但是SB以相同强度与其互补靶结合，只是结合更加特异。SB分别在63.7。C和49.9X:下与其匹配和错配的靶杂交，存在13.8。C的差异，而所述DNA分别在64.9'C和57.rC下与其匹配和错配的乾杂交，仅存在7.8。C的差异。如果仅DNA或SB和DNA探针二者均与靶寡核苷酸杂交，则该区域分别加l或^下划线。杂交区域中的错配用灰色突出显示。SB的信号更高，这是因为它们的背景荧光较低。标签"2"指插入的假核苷酸(3-(l-0-(4,4'-二甲氧三苯基甲基(dimethoxytriphenylmetyl))-2-0-(2-氰乙基二异丙基酰氨亚磷酸盐)-l,2-丁二醇)-4-N-(7,9-二曱基-3H-吡啶并[3',2':4,5]噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮)的亚磷酰胺)包含下文所述的编号为XXVI的嵌入疏水性基团。图4A)不存在或存在较少的互补DNA靶时部分互补的无茎信标SB。两个探针彼此结合和/或自身进行折叠，从而猝灭焚光。曱基化检测点(多态性位点)和探针之间的错配用浅灰色条突出显示。B)如果加入或者在扩增步骤中形成互补的DNA靶，SB将优先结合DNA靶，而不是与另一SB结合。C)结果是与靶互补的SB现在能够发荧光，因此可以被检测，而另一SB自身进行折叠，并猝灭自身的荧光。图5此图说明亚硫酸氬盐处理基因组DNA将所有未甲基化的脱氧胞嘧啶(dC)转化为脱氧尿嘧啶(dU)，而将甲基化的dC保持不变。A)亚硫酸氢钠与dC的化学反应，B)基因组DNA,C)亚硫酸氢盐处理的未甲基化的DNA和D)亚硫酸氬盐处理的具有一个甲基化的CpG对的DNA。中部的粗条突出显示CpG对，而所有其它条突出显示基因组DNA中dC的位置和变成dU。图6测量荧光时在每个阶段逐渐增加温度的扩增设置文件。首先按照制造商的建议活化DNA聚合酶。然后执行45个扩增循环。所述循环包含退火和首次测量(例如50°C)，之后逐渐增加温度，例如按2度的幅度，测量每个阶段的荧光。重复此操作直至达到正常的延伸温度，例如72。C。每个测量阶段的持续时间应尽可能的短。里面写有"结束"而边界处写有"1"的放大镜说明在该阶段的末尾处测量了一(l)次焚光。图7扩增设置文件使用终点亲合读数。首先根据制造商的说明活化DNA聚合酶。然后使用最佳退火温度(例如50。C)和任选地额外的读数温度(例如55。C和6(TC)扩增DNA区域。重复此操作直至发生满意的扩增。扩增之后，执行终点亲合测量，可选地可对两条链进行变性(在高至95。C的温度下)，然后逐渐降低每次冷却的温度(例如每个步骤rc)，进行冷却(例如在第一步中至72°C)。每次将混合物冷却至给定步骤的选择温度时都测量信号，然后将信号保持一小段时间让探针与它的扭退火。重复此操作直20078至达到需要的温度，至少达到两个探针都与它们的互补靶结合的水平(例如45°C)。里面写有"结束，，而边界处写有'T，的放大镜说明在该阶段的末尾处测量了一Ci;)次荧光。图8此图说明了如何使用图6所示方案区分完全互补(曱基化的DNA)和错配的靶(未甲基化的DNA)的荧光。在45t:至59。C时，甲基化的探针(FAM-A2AAA2ATCCCG2CGA2ACT-BHQ1)[SEQIDNO:7]也会少量结合错配的靶，但是在6rc和高至7rc时，探针特异性结合完全互补靶。则在以后的测量中，可以对此探针使用6rc的读数点。多态性位点用灰色突出显示。标签"2"指插入的假核苷酸(3-(l-0-(4,4'-二甲氧三笨基甲基(dimethoxytriphenylmetyl))-2-0-(2-氰乙基二异丙基酰氨亚磷酸盐)-1,2-丁二醇)-4-N-(7,9-二甲基-3H-吡啶并[3',2':4,5]噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-S同)的亚磷酰胺)包含下文所述的编号为XXVI的嵌入疏水性基团。图9显示使用图7所示方案和FAM-标记(FAM-TT1GAATCG1GTTT1T-BHQ1)[SEQIDNO:8]或HEX-标记探针完全互补(在此实例中为甲基化的DNA)和错配的非靶(在此实例中为未曱基化的DNA)的荧光信号的实例。两种探针均在45。C和50。C之间特异性退火。在以后的测量中，可能需要对两种探针使用46。C的读数点。从不同的设置文件中清楚可见，使用所述方案区分两个相关的靶(在此实例中为甲基化的与未曱基化的DNA)非常简单。每个探针中的多态性位点用灰色突出显示。标签"1"指插入的假核苷酸((S)-l-(4，4'-二曱氧三苯基曱氧基(dimethoxytriphenylmetyloxy))-3-花甲氧基&}^1161116111)40乂>0-2-丙醇的亚石辟酰胺)包含疏水性嵌入分子芘。图10，上图显示实施例8所述的实验中使用的PCR循环设置文件。中图和下图显示荧光原始数据，并且下图显示按实施例8所述方法获得的定量数据。图ll，上图显示按实施例9所述方法获得的结果。下图显示测量设置文件。图12显示按实施例9所述方法获得的结果。29图13显示按实施例IO所述方法获得的结果。曲线显示使用下列探针的结果4针—0U针—02—探针—05~#:针_06~#:针—07~^笨针—ref图14A和B说明了实时PCR设置文件，它们可以用于本发明所述方法。具体实施例方式核酸术语"核酸"涵盖天然存在的核酸(DNA和RNA)，包括天然存在的DNA和RNA衍生物，如但不限于曱基化的DNA、含有DNA的加合物和共价结合至蛋白质的RNA。术语"核酸类似物"涵盖天然存在的核酸(DNA和RNA)的合成衍生物和类似物。合成的类似物包含一个或多个核苷酸类似物。术语"核普酸"一般指天然存在的核普酸，例如天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核普酸，或核糖核香酸或脱氧核糖核苷酸的天然存在的衍生物。术语"核苷酸类似物"包含所有能够被掺入核酸主链和能够进行特异性威基配对(参见下文)、与天然存在的核苷酸基本相像的核苷酸类似物。术语"疏水性核苷酸"指下文将详细描述的疏水性核苷酸。疏水性核苷酸一般不是天然存在的。术语"寡核苷酸"指核苷酸的寡聚体。术语"寡核苷酸类似物"指包含至少一个疏水性核苷酸和/或核苷酸类似物和/或假核苷酸，和任选地天然存在的核苷酸的寡核苷酸。因此术语"核酸"或"核酸类似物"指基本上由多个核苷酸和/或核苷酸类似物和/或疏水性核香酸组成的任何分子。疏水性核苷酸将在下文进行详细描述。本发明所述核酸或核酸类似物可包含具有不同的主链单体单元的差别更大的核普酸和核脊酸类似物(参见下文)。优选地，本发明所述核酸或核酸类似物的单链能够与大致互补的单链的核酸和/或核酸类似物杂交形成双链的核酸或核酸类似物。更优选地，此双链的类似物能够形成双螺旋。优选地，所述双螺旋的形成是因为氢键合，更优选地，所述双螺旋是选自由A型、B型、Z型及其中间构型双螺旋组成的组的双螺旋。因此，本发明所述核酸和核酸类似物包括但不限于选自以下的核酸和/或核酸类似物类型PNA、HNA、画A、ANA、LNA、INA、CNA、CeNA、TNA、(2'誦NH)画TNA、(3'-NH)-TNA、a誦L誦核糖-LNA、a-L-木糖匪LNA、卩-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、双环-DNA、6-^^-双环-DNA、5國表-双环-DNA、a-双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA、双环[3.2.1]-DNA、双环[4.3.0]酰胺-DNA、P-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃来苏糖基誦NA、2'國R广RNA、2'-0R广RNA(R！为取代基)、a画L-RNA、a画D画RNA、P-D-RNA和其混和物和其杂种，以及其磷原子修饰(如但不限于硫代磷酸酯、曱基磷酸化物、亚磷酰胺(phosphoramidiate)、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、磷酸三酯和硼代磷酸酯)。此外，不含磷的化合物也可用于与核苷酸连接，如但不限于甲亚氨基甲基、乙酸甲酯(formacetate)、硫代乙酸甲酯(thioformacetate)和包含酰胺的连接基团。特别是核酸和核酸类似物可包含一个或多个本发明所述疏水性核苦酸。在本文中，"混合物"意在涵盖包含不同类型核苷酸或核普酸类似物的核酸或核酸类似物链。此外，在本文中，"杂种，，意在涵盖包含以下的核酸或核酸类似物一条链包含具有一个或多个主链类型的核苷酸或核脊酸类似物，而另一条链包含具有不同主链类型的核苷酸或核苷酸类似物。术语"双链体"意指核酸和/或核酸类似物的两条链的杂交产物，其中所述链优选为相同类型的核酸和/或核酸类似物。HNA意指，例如如VanAetschot等，1995所述的核酸。MNA意指如Hossain等，1998所述的核酸。ANA指如Allert等，1999所述的核酸。LNA可是如WO99/14226(Exiqon)所述的任何LNA分子，优选地，LNA是逸自WO99/14226的摘要中描述的分子。更优选地，LNA是如Singh等(1998)、Koshkin等(1998)或Obika等(1997)所述的核酸。PNA指例如如Nielsen等，1991所述的肽核酸。INA指如专利WO03/051901所述的包含嵌入剂假核普酸的核酸。术语"核苷酸"指核酸或核酸类似物的构建组块(buildingblock)，术语核普酸涵盖天然存在的核普酸和其衍生物以及能够与天然存在的核苦酸和其衍生物执行基本上相同的功能的核苷酸。但是一般而言和更优选地，如本文所用，术语"核苷酸"仅指天然存在的核苷酸和其天然存在的衍生物。天然存在的核苷酸包含包含四种核碱基腺"票呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)之一的脱氧核糖核苷酸和包含四种核碱基腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)、鸟噪呤(G)或胞嘧啶(C)之一的核糖核苷酸。核苷酸类似物可是能够掺入核酸主链和能够进行特异性碱基配对的任何核香酸样分子。本发明所述的非天然存在的核苷酸(核苷酸类似物)包括但不限于选自以下的核苷酸PNA、HNA、MNA、ANA、LNA、INA、CNA、CeNA、TNA、(2'-NH)-TNA、(3'-NH)-TNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、p-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、双环-DNA、6-tt-双环-DNA、5-表-双环-DNA、a-双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA、双环[3.2.1]-DNA、双环[4.3.0]酰胺-DNA、P-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃来苏糖基-NA、2'-R广RNA、2'-OR广RNA(R！为取代基)、a-L-RNA、a-D-RNA、P-D福A。本发明所述核苷酸和核苷酸类似物的功能是能够通过互补核苷酸的核碱基的氩键合与所述互补核香酸发生特异性相互作用以及能够被掺入核酸或核酸类似物。天然存在的核苷酸以及一些核苷酸类似物能够通过酶学方法掺入核酸或核酸类似物，例如通过RNA或DNA聚合酶，但是核苦酸或核苷酸类似物也可通过化学方法掺入核酸或核酸类似物。此外，核酸或核酸类似物可通过将两个较小的核酸或核酸类似物偶联至另一个核酸或核酸类似物进行制备，例如这可通过连接酶用酶学方法完成，或可用化学方法完成。核苷酸或核苷酸类似物包含主链单体单元和核碱基。所述核碱基可是天然存在的核碱基或其衍生物或其能够执行基本相同功能的类似物。核碱基的功能是能够通过氢键与一个或多个其它碱基特异性締合。因此核tt的重要特征就是其仅可与一个或少量其它核碱基形成稳定的氢键，但是其不能与大多数其它核碱基(通常包括其自身)形成稳定的氩键。一个核碱基与其它核威基的特异性相互作用通常称为"碱基配对"。碱基配对造成互补核脊酸之间的特异性杂交。本发明所述互补核苷酸是包含能够进行碱基配对的核碱基的核普酸。天然存在的核苷酸的核tt(nucleotbase)之间的碱基配对在此也称作沃森-克里克氢键合。在DNA中，沃森-克里克氢键合包括腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶m形成碱基对，以及鸟噤呤(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对。在RNA中，胸腺嘧咬被替换为尿嘧啶gj)。因此，在天然存在的核碱基中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)配对；而鸟噪呤(G)与胞嘧咬(C)配对。因此，例如，包含A的核苷酸与包含T或U的核苷酸互补，包含G的核苷酸与包含C的核苷酸互补。本发明所述核苷酸可进一步进行衍生以包含附加的分子实体。核苷酸可以在核碱基或主链单体单元上进行衍生。碱基上的优选衍生位点包括腺嘌呤的8-位、尿嘧啶的5-位、胞嘧啶5-或6-位和鸟噪呤的7-位。杂环修饰可以归为三个结构类别增强碱基堆叠、增加氢键合和它们的组合。通过扩大平面系统的兀-电子云增强威基堆叠的修饰的代表为在嘧咬的5-位和7-去氮-嘌呤的7-位进行接合、亲脂<务饰。嘧啶的5-位取代修饰包括丙炔、己炔、噻唑和仅曱基；7-去氮噪呤的7-位取代基包括碘、丙炔基和氰基。也可以将胞嘧啶的5-位从丙炔修饰为五元杂环和修饰为三环稠环系统(从4-和5-位(胞嘧吱钳)发散)。另一种类型的杂环修饰的代表为2-M-腺嘌呤，其中附加的氨基在A-T碱基对中提供了另一个氬键，类似于G-Ctt对的三个氬键。提供组合效应的杂环修饰的代表为2-M-7-去氮-7-修饰的腺嘌呤和异源双链体的具有乙氧氨基官能团的三环胞嘧啶类似物。此外，N2-修饰的2-氨基腺噤呤修饰的寡核苷酸是常用的修饰。核糖或脱氧核糖部分的优选衍生位点是非连接性碳位置C-2'和C-4'的修饰、连接性碳C-l'、C-3'和C-5'的修饰、糖氧0-4'的替换、脱水糖修饰(构象受限)、环糖修饰(构象受限)、核糖呋喃环大小的变化、糖与糖的连接位点(C-3'与C-5'/C-2'与c-5')、杂原子环修饰的糖和上述修饰的组合。但是，其它位点也可进行矛;亍生，只要核酸或核酸类似物整体的碱基配对特异性不受千扰。最后，当主链单体单元包含碌酸基团时，一些主链单体单元的磷酸可进行衍生。假核苷酸是能够被插入核酸或核酸类似物，但不包含核碱基的核苷酸类似物。^R核香酸可是连接至其自身主链单体单元的疏水性分子，例如本发明所述疏水性核苷酸。假核普酸通常^又通过化学方法插入，而很少-故天然酶识别。如本文所用，寡核芬酸或寡核苷酸类似物是基本上由核苷酸和/或核苷酸类似物和/或假核苷酸序列组成的分子。优选地，寡核苷酸或寡核苷酸类似物包含3-200、5-100、6-30个核苷酸和/或核苷酸类似物和/或布￡核苷酸和/或疏水性核苷酸个体，如上所述。靼核酸靶核酸或靶核酸类似物指包含一个或多个寡核香酸和/或寡核苷酸类似物(例如引物或探针)的一个或多个杂交位点/序列的核苷酸或核苦酸类似物序列。靶序列可发现于任何核酸或核酸类似物，包括但不限于，RNA、基因组DNA、质粒DNA、cDNA、线粒体DNA、亚硫酸氩盐处理的DNA，并可例如包含野生型或突变体基因序列(如其编码序列或调控序列)，或扩增的核酸序列(例如通过PCR进行扩增时)，或修饰的DNA(例如使用可以改变DNA的化学组成的化学剂，如DNA的亚^Tu酸氬盐处理)。靶序列可是任何长度。所指的位点可以是或不是一个连续的序列。例如所述位点可由被任何数量的核苷酸和/或核苷酸类似物隔开的两个或多个连续的子序列构成。但是，优选地，所述乾序列是连续的。优选地，所指的位点的总长度，由该特定的靶核酸或把核酸类似物上所有的子序列构成，由所述寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物构成，通常小于100个核苷酸和/或核普酸类似物。包含至少一个信号对和至少一个本发明所述疏水性分子的核苷酸类似物不被视作靶核酸。突变体序列34本发明所述术语"突变体序列"涵盖与特异性靶序列存在至少一个，》口1，侈'J:i口2，》口3，侈'J》口4，如5，合Ji口6，》口7，侈'J:i口8，^口9，i"列》口10，如10至20，例如20至50,如多于50个核碱基差异的序列。例如本发明所述突变体序列可包含一个或多个突变。术语"突变"涵盖与特异性乾序列相比，一个或多个核苷酸变为另一个或多个其它核香酸的变化。此外，术语"突变"涵盖在核酸内缺失和添加核苷酸，例如与耙序列相比缺失或添加核香酸。另外，它还涵盖曱基化模式的变化。靶序列可包含多态性位点(详情参见下文)，因此靶序列可包含一个多态性，而"突变体序列"可包含另一个多态性。在一个实施方案中，所述靼序列是野生型序列，即最常见的天然存在的序列，而所述突变体序列与所述野生型序列相比包含一个或多个突变。因此，在一个实施方案中，本发明所述突变可以是多态性，如单核苷酸多态性(SNP)。例如所述多态性可指示特异性DNA图谱。例如，特异性DNA图谱的信息可被用于鉴定个体。例如特异性DNA图语可被用于鉴定罪犯或犯罪嫌疑人或鉴定尸体或尸体残骸。在另一个实施方案中，突变涉及核苷酸的甲基化或去甲基化。因此，在一个实施方案中，本发明所述突变可处于核苷酸的甲基化状态，如CpG对的曱基化。例如甲基化可指示特异性DNA图语，而该图镨的信息可指示疾病状态。甲基化状态的检测通常在将非曱基化的CpG转化为dUpG对(通过使用化学剂例如亚硫酸氬钠处理)之后进行。此外，特异性DNA图谙可被用于确定个体之间的关系，例如亲子关系或更远的关系。关系也可是不同的物种或给定物种不同的群体之间的关系。在一个实施方案中，突变可指示临床疾病或突变可指示增强的临床疾病风险。所述临床疾病可例如选自由肿瘤性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病和代谢紊乱(包括糖尿病)组成的组。此外，突变可指示预定的药物处理的特异性响应。例如突变可指示个体是否对所述药物处理有正响应或个体能否耐受特异性药物处理。多态性4立点在本发明中，术语"多态性位点"涵盖核酸中人们感兴趣的特异性位置。例如，多态性位点可以是已知多态性的特异性位置，如其核苷酸性质对研究人员重要的单核苷酸多态性(SNP)。它也可以是核酸中由于其它原因对研究人员重要的特异性位置。因此多态性位点是使用者在试图区分两个或多个可能的靶时，通过使用本发明所述无茎信标从其获得信息的位置。多态性位点可以是核苦酸、核苷酸类似物、核酸或核酸类似物中人们感兴趣的任何位点。因此，本发明所述多态性位点是在所述位点内的一个或多个位置可包含多个不同的核苷酸之一和人们对确定所述位点内包含哪个(些)核苷酸感兴趣的位点。多态性位点可包含多于一个或多个核苷^/核苷酸类似物，如至少2，例如在2至10范围内，如在2至5范围内。优选地，多态性位点包含一个核苷酸。因此，举例来说，如果人们对确定给定輩巴序列内的特异性位置是A或G感兴趣，那么该特异性位点即被称为本发明所述"多态性位点"。技术人员将很容易能够鉴定多态性位点。样品材料描述区分包含特异性靶序列的核酸或核酸类似物和包含突变体序列的核酸的列。所述混合物可包含于细胞内，例如完整细胞内。例如，所述细胞可是原核细胞或真核细胞，如植物细胞或哺乳动物细胞。在此实施方案中，所述方法可用于进行原位杂交。36例如，所述混合物可是供试核酸或核酸类似物样品。例如，所述样品可是合成制备的样品(可在体外已经过或未经过进一步加工)。所述供试核酸或核酸类似物样品可包含任何核酸或核酸类似物，例如DNA、RNA、PNA、HNA、丽A、ANA、LNA、CNA、CeNA、TNA、(2'陽NH)陽TNA、(3'-NH)-TNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、P-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、双环-DNA、6-氨基-双环-DNA、5-表-双环-DNA、a誦双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA、双环[3.2.1]-DNA、双环[4.3.0]酰胺-DNA、卩-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃来苏糖基-NA、2'-R-RNA、2'-0R-RNA、a-L-RNA、a-D-RNA、(3-D-RNA和其混合物和其杂种。人们经常需要测试个体，如哺乳动物，例如人类的DNA或RNA。在这种情况下，所述供试核酸或核酸类似物样品是从所述个体获得的样品。所述样品可获自体液样品(例如血液样品)，活组织检查，头发、指曱或类似样品或任何其它合适的样品。在检测相应的靶核酸和/或核酸类似物和/或其突变体的存在之前，样品可在体外进行加工。例如样品可经过可将核酸从样品中完全或部分纯化出来的一个或多个纯化步骤。此外，样品可以已经过扩增步骤，其中的核酸量已经扩增，例如通过聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应、连接酶链式反应或任何其它合适的扩增方法。此类方法对技术人员为公#p,例戈口，参见SambrookJ等，2000，MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆实验手册)(第三版)，ColdSpringHaborLaboratoryPress。在本发明的一个优选实施方案中，供试核酸样品选自由基因组DNA或基因组DNA的扩增产物，如基因组DNA的PCR扩增产物组成的组。所述方法可在检测之前包括分离步骤，其中杂交的寡核苷酸或寡核苷酸类似物将与未杂交的寡核苷酸或寡核苷酸类似物分离，这可以有利于仅特异性检测杂交的寡核苷酸或寡核苷酸类似物。例如，在与寡核苷酸或寡核苷酸类似物杂交之前，核酸混合物可被固定在闺体支持物上。杂交之后，未杂交的寡核苷酸或寡核苷酸类似物可^^洗脱下来，而杂交的寡核苷酸或寡核苷酸类似物可^皮检测。但是执行时没有分离步骤的检测也包含在本发明内。因此，检测可在加入核酸混合物、本发明所述寡核香酸类似物和其它需要的试剂后的封闭管内执行。此类方法在本文中也^皮称为同质性方法。靶DNA可是，例如特定的基因、基因片段、微卫星或任何其它DNA序列。人们特别感兴趣的是特殊DNA(其可以是真核、原核、古细菌或病毒来源)的检测。重要的是，本发明可有助于通过分析已知与特定微生物相关的特定序列对各种传染性疾病进行诊断和/或基因分型。靶DNA可以复杂的生物核酸混合物(RNA和DNA)和非核酸(例如完整细胞或粗细胞提取物)形式提供。如果靶DNA为双链或者具有明显的二级和三级结构，杂交之前可能需要对其进行加热。在这种情况下，加热可在向含有寡核苷酸类似物的杂交介质中引入核酸之前或之后进行。一些情况下可能也需要在杂交分析之前，通过本领域已知的任何方法将核酸从复杂的生物样品中提取出来以降低背景千扰。复杂的生物混合物。此复杂的生物混合物包括广泛的真核和原核细胞，包括原生质体；或可容纳靶脱氧核糖核酸的其它生物材料。因此，所述方法适用于組织培养动物细胞、动物细胞(例如血液、血清、血浆、网状细胞、淋巴细胞、尿、骨髓组织、脑脊液或从血液或淋巴制备的任何产物)或任何类型的活组织检查(例如肌肉活组织检查、肝脏活组织检查、肾活组织检查、膀胱活组织检查、骨活组织检查、软骨活组织检查、皮肤活组织检查、胰腺活组织检查、肠道活组织检查、胸腺活组织检查、哺乳动物活组织检查、子宫活组织检查、睾丸活组织检查、眼睛活组织检查或脑活组织检查，在裂解緩冲液中匀浆)、植物细胞或对渗透休克敏感的其它细胞和细菌、酵母、病毒、支原体、原生动物、立克次体、真菌的细胞和其它小的微生物细胞及类似细胞。例如，本发明的分析和分离程序可用于检测感兴趣的非致病性或致病性微生物。通过检测包含疏水性核苷酸的寡核香酸或寡核苷酸类似物和生物样品中拥有的核酸之间的特异性杂交，即可确定微生物的存在。在本发明的一个实施方案中，需要在给定的时间使用本文所述的寡核苷酸类似物检测给定靶核酸的量。例如，在实时PCR中，这可通过定量所述寡核苷酸类似物的信号或通过查看需要对给定靶核酸进行多少扩增以产生可检测的信号而完成。但是也可使用其它的定量方法。同源核酸当核酸、核酸类似物、寡核苷酸或寡核苷酸类似物能够杂交时，即说它们是同源互补的。优选地，同源互补核酸、核酸类似物、寡核苷酸或寡核苷酸类似物能够在低严格性条件下杂交，更优选地，同源互补核酸、核酸类似物、寡核苷酸或寡核苷酸类似物能够在中严格性条件下杂交，更优选地，同源互补核酸、核酸类似物、寡核苷酸或寡核苷酸类似物能够在高严格性条件下杂交。核酸杂交领域的技术人员了解，一般用于指定或控制杂交严格性的因素包括变性剂(像例如曱酰胺)的浓度、盐浓度(即离子强度)、杂交温度、去污剂浓度、pH和离液剂(chaotrope)的存在与否。探针核碱基序列与其靶序列杂交的最佳严格性通常是通过逐一改变这些因素或其中的一部分因素发现的。如本文所用，高严格性条件将表示与一般应用于DNA印迹和杂交(例如，参见SouthernE.M.，1975，J.Mol.Biol.98:503-517)的严格性相当或至少一般严格的严格性。为此，常规的做法是包括预杂交和杂交步骤。此类步骤一般使用含有6xSSPE、5%Denhardt's、0.5%SDS、50%甲酰胺、100pg/ml变性鲑精DNA(在42°0孵育18小时)的溶液执行，然后使用2xSSC和0.5%SDS(在室温和在37。C)漂洗，然后用O.lxSSC和0.5%SDS(在68匸孵育30分钟)漂洗，参见Sambrook等，1989，"MolecularCloning/ALaboratoryManual"(分子克隆实验手册)，ColdSpringHarbor),其通过引用结合入本文。如本文所用，中严格性条件将表示在含有1mMEDTA、10mMNa2HP04.H20、140mMNaCl(pH7.0)的緩沖液或与此相似的对杂交严格性具有大约相同的影响的緩冲液中进行杂交。优选地，提供约1,5pM每种核酸或核酸类似物链。可选地，中严格性可表示在含有50mMKCl、10mMTRIS-HCl(pH9,0)、0.1%TritonX國100、2mMMgCl2的緩沖液中进行杂交。本发明所述低严格性条件表示在由1MNaCl、10mMNa3PO4(pH7.0)组成的緩冲液或与此相似的对杂交严格性具有大约相同的影响的緩冲液中进行杂交。可选地，同源互补核酸、核酸类似物、寡核苷酸或寡核苦酸类似物是在给定序列上彼此大致互补，如大于70%互补，例如大于75%互补，如大于80%互补，例如大于85%互补，如大于90%互补，例如大于92%军补，如大于94%互补，例如大于95%互补，如大于96%互补，例如大于97%互补的核酸、核酸类似物、寡核苷酸或寡核苷酸类似物。优选地，所述给定序列至少4个核苷酸，例如至少7个核香酸，如至少10个核苷酸，例如至少15个核苷酸，如至少20个核苷酸，例如至少25个核普酸，如10至500个核苷酸，例如4至100个核香酸，如6至30个核苷酸长。更优选地，同源互补寡核苷酸或寡核苷酸类似物在其全长上大致同源互补。当一个核苷酸或核苷酸类似物序列的所有核碱基能够与另一个序列的所有核威基形成沃森-克里克氬键时，即认为第一个核苦酸或核苷酸类似物序列与第二个核苷酸或核苷酸类似物序列互补。杂交特异性核酸和/或核酸类似物和/或寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物的杂交特异性指所述杂交事件在给定严格性条件下根据同源互补的杂交配偶体的序列差异对其进行区分的能力。通常情况下，目的是要仅靶向核酸和/或核酸类似物和/或寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物混合物中的一个特定序列(靼序列)，而避免与其它序列杂交(即使它们与所述靶序列具有很强的相似度也不行)。有时，靶和非乾序列在用于杂交的序列区仅有一个或少量核苷酸差异。如本文所用，高杂交特异性表示在某些条件下，例如高严格性条件下，寡核苷酸或寡核苷酸类似物与同源靶序列的杂交将显著优于与任何几乎完全相同的序列(与所述乾序列仅有一个或少量碱基取代i异)的杂交。交叉杂交术语交叉杂交涵盖至少两个核酸和/或核酸类似物之间的任意杂交，即交叉杂交也可表示分子间杂交。因此术语交叉杂交可用于描述，例如核酸类似物序列的杂交。交叉杂交通常发生于探针和一个或多个同源互补的非靶序列之间，即使它们的互补程度低于探针和其互补乾序列的互补程度。这种不必要的效应可能是因为探针比靶大大过量和/或快速的退火动力学。交叉杂交也可通过少量核碱基对之间的氢键合发生，例如PCR反应中的引物之间的氢键合，导致形成引物二聚体和/或形成非特异性PCR产物。特别是包含一个或多个对相同类型的核苷酸类似物具有高亲合性的核苷酸类似物的核酸趋于根椐碱基配对形成二聚体或更高级的复合体。特别是包含核苷酸类似物如但不限于，DNA、RNA、2'-0-甲基RNA、PNA、HNA、MNA、ANA、LNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、P-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、2'-R-RNA、2'-OR-RNA和其混合物的探针对包含相同类型的主链单体单元的其它寡核苷酸类似物一般具有高杂交亲合性。因此即使各个探针分子仅具有较低的互补程度，它们仍趋于杂交。自体杂交术语自体杂交涵盖其中核酸或核酸类似物分子通过自身回折与其自身退火，产生二级结构(像例如发夹结构)的过程，即自体杂交可被视为分子内杂交。在大多数应用中，避免自体杂交非常重要。产生所述二级结构可抑制与所需的核酸乾序列的杂交。这在大多数分析中都是不希望的，例如当所述核酸或核酸类似物用作PCR反应的引物或作为外切核酸酶分析的荧光团/猝灭剂标记的探针时。在上述两种分析中，自体杂交可抑制与耙核酸的杂交，因此外切核酸酶分析中产生的信号强度将会降低。特别是包含一个或多个对相同类型的核苷酸类似物具有高亲合性的核苷酸类似物的核酸趋于自体杂交。特别是包含核苷酸类似物如但不限于2'-0-甲基RNA、PNA、HNA、MNA、ANA、LNA、a-L-核糖-LNA、a誦L画木糖-LNA、P-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、2'-R-RNA、2'-OR-RNA的探针一般具有高自体杂交亲合性。因此即使各个探针分子仅具有较低的自体互补程度，它们仍趋于自体杂交。在一些发明中，最好使用发夹结构和其它二级结构。例如，分子信标就是这样，其中荧光团和猝灭剂被置于寡核苷酸的两端并且其中一端的一小段序列与所述寡核苷酸另一端的一小段序列互补。当不存在耙核酸(与将组成所述茎的两个部分隔开的序列互补)时，所述寡核苷酸两端的两个序列将彼此杂交，生成茎结构，使焚光团和幹灭剂彼此靠近。与分子信标相似，疏水性分子的存在促进或增强了"自体杂交"，这通常也是希望的效应，例如当探针未结合时，导致无茎信标中的信号对更好地相互作用。因此本发明还包含包含一个或多个疏水性核脊酸(可有利于形成所需的所述寡核香酸类似物的三维结构)的寡核香酸类似物。在本发明中，疏水性分子可具有与分子信标中的茎相似的作用，即确保未结合探针中的信号对之间良好的相互作用。因此，在本发明的说明中，所需的疏水性自体杂交(并不是真正的自体杂交，而是自体相互作用)和氬键合造成的不需要的自体杂交之间有明显分别。发夹结构通常最少由3个互补tt对组成，它们形成发夹的茎结构，而本发明所述无茎信标中的疏水性自体杂交不依赖于互补碱基对的碱基配对来增加未结合探针的信号对的相互作用。即使一个或少量核碱基按自体互补的方式匹配，其仍被视为疏水性自体杂交。因此，在一个实施方案中，本发明所述寡核苷酸类似物不包含与所述寡核苷酸类似物内的另一个3核苷酸和/或核苷酸类似物连续序列互补的3核苷酸或核苷酸类似物连续序列。优选地，本发明所述寡核苷酸类似物不包含与所述寡核苷酸类似物内的另一个4核苷酸和/或核苷酸类似物连续序列互补的4核苷酸或核苷酸类似物连续序列。例如，本发明所述寡核苷酸类似物不包含与所述寡核苷酸类似物内的另一个6核苷酸和/或核苷酸类似物连续序列互补的6核苷酸或核苷酸类似物连续序列。例如，本发明所述寡核苷酸类似物不包含与所述寡核苷酸类似物内的另一个8核苷酸和/或核香酸类似物连续序列互补的8核苷酸或核苦酸类似物连续序列。例如，本发明所述寡核苷酸类似物不包含与所述寡核苷酸类似物内的另一个10核苷酸和/或核苷酸类似物连续序列互补的10核苷酸或核香酸类似物连续序列。因此本发明优选的实施方案提供包含信号对和至少一个疏水性分子的寡核香酸类似物，其中所述寡核苷酸类似物的信噪比显著高于或^^于(与值1差别更大)相应的不包含所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的信噪比，并且其中所述寡核苷酸类似物与它们的靶核酸(不包含与所述乾序列不同源互补的茎结构)同源互补。这意味着本发明所述寡核苷酸类似物更易于设计，并且可以短于其相应的分子信标，因为不需要茎来优化信噪比。熔解温度核酸和核酸类似物的熔解指双链核酸分子两条链的热分离。熔解温度(Tm)表示出现50%螺旋(杂交)和巻曲(未杂交)形式的摄氏温度。熔解温度高指示复合体稳定，因此两条链之间的亲合力高。反之，熔解温度低指示两条链之间的亲合力相对较低。因此，通常来说两条链之间的氬键合强将造成熔解温度高。此外，熔解温度依赖于环境的物理/化学状态。例如熔解温度一般依赖于盐浓度和pH。熔解温度可通过许多分析确定，例如其可通过使用UV光镨确定杂交的形成和分解(熔解)或通过焚光来确定。本发明优选的实施方案在存在核酸混合物时，确定包含信号对和至少一个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸类似物的熔解温度。本发明更加优选的实施方案在从核酸混合物中扩增核酸序列反应之后，确定包含信号对和至少一个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸类似物的熔解温度。本发明更加优选的实施方案提供确定包含信号对和至少一个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸类似物的熔解温度的方法，其中所述方法包含如下步骤a)提供测试靶序列或突变体序列存在所需的核酸或核酸类似物的混合物；和b)提供引物组和如本文所述的包含至少一个疏水性分子和信号对的寡核苷酸类似物，其中所迷引物和所迷寡核苷酸类似物能够与所述耙序列和/或突变体序列杂交；和c)将所述引物和寡核苷酸类似物与所述核酸和/或核酸类似物混合物在允许所述引物与所述核酸和/或核酸类似物杂交的条件下孵育；和d)使用所述杂交的靶序列作为模板，用核苷酸或核苷酸类似物或寡核苷酸或寡核苷酸类似物对所迷引物的3'端进行延伸；和e)重复步骤c)至d)直至达到满意的扩增；和迷突变体序列杂交的温度；和g)增加测量信号对的信号时的温度，直至确定所述寡核香酸类似物从其把序列熔解的温度。此外，如本发明所公开，嵌入剂在双链核酸核碱基间的嵌入作用或疏水性分子与沟结合的疏水性相互作用也可稳定双链核酸，并因此导致更高的熔解温度。因此，经常来说，本发明所述寡核苷酸类似物和DNA的杂种一般比相应的DNA/DNA杂种具有更高的熔解温度。因此本发明优选的实施方案提供包含信号对和至少一个疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸类似物，其中所述寡核苷酸类似物的熔解温度显著高于相应的不包含所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的熔解温度。亲合性核酸的亲合性指两个单链热形成双链核酸分子。与熔解温度(Tm)—样，亲合性表示为出现50%螺旋(杂交)和巻曲(未杂交)形式的4聂氏温度。在理想系统中，熔解温度和亲合温度应相等或接近相等，但是有时在测量中并不能达到该平衡，其它条件或混合物中存在的分子可以影响双链体的形成或变性。亲合性高指示复合体稳定，因此两条链之间的亲合力高。反之，亲合性温度低指示两条链之间的亲合力相对较低。因此，通常来说两条链之间的氬键合强将造成亲合性高。此外，如本发明所公开，嵌入剂在双链核酸核威基间的嵌入作用或疏水性分子与沟结合的疏水性相互作用也可稳定双链核酸，并因此导致更高的亲合性，或疏水性分子的位阻效应可导致较低的亲合性。此外，亲合性依赖于环境的物理/化学状态。例如亲合性一般依赖于盐浓度和pH。亲合性可通过许多途径确定，例如其可通过使用UV光镨确定杂交的形成和分解(熔解)或通过两条链退火或变性的荧光变化来确定。本发明优选的实施方案确定包含信号对和至少一个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸类似物对包含核酸的混合物的亲合性。本发明更加优选的实施方案确定执行扩增反应之后，包含信号对和至少一个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸类似物对包含核酸的混合物的亲合性。本发明最优选的实施方案提供确定包含信号对和至少一个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸类似物的亲合性的方法，其中所述方法包含如下步骤a)提供测试靶序列或突变体序列存在所需的核酸或核酸类似物的混合物;和b)提供引物组和如本文所述的包含至少一个疏水性分子和信号对的寡核苷酸类似物，其中所述引物和所述寡核苷酸类似物能够与所述乾序列和/或突变体序列杂交;和c)将所述引物和寡核苷酸类似物与所述核酸和/或核酸类似物混合物在允许所述引物与所述核酸和/或核酸类似物杂交的条件下孵育；和d)使用所述杂交的靶序列作为模板，用核苷酸或核苷酸类似物或寡核苷酸或寡核苷酸类似物对所迷引物的3'端进行延伸；和e)重复步骤c)至d)直至达到满意的扩增；和f)将所述混合物变性并快速冷却至设定温度(起点高于亲合温度)；和g)在所述寡核苷酸类似物杂交之后，扩增子重新退火之前，立即测量信号对的信号；和h)通过重复步骤f)至g)确定包含至少一个疏水性分子和信号对的所述核酸类似物的亲合性，同时逐渐降低步骤f)中的温度，直至该温度降低至低于亲合温度。上述方法的优点是克服了与扩增子的重新退火和包含信号对的所述核酸类似物的置换相关的问题。核酸酶抗性术语核酸酶抗性指寡核苷酸、寡核苷酸类似物、核酸或核酸类似物对核酸酶降解的抗性。核酸酶是通过将核苦酸链切割成较小的单元来催化核酸水解的酶的通用术语，并同时涵盖内切核酸酶(在内部键处切割核酸从而产生不同大小的片段的核酸酶)和外切核酸酶(从核酸的一端开始，一次释》文一个核香酸(连续地)的核酸酶)。核酸酶抗性常规是通过将寡核苷酸与细胞提取物或分离的核酸酶溶液孵育，然后测量随时间保留的完整的寡核苷酸的程度(通常通过凝胶电泳或分光光度法测量)而测量的。测量核酸酶抗性的实例可包含下列步骤a)凝胶纯化寡核苷酸类似物，并使用高效液相色谱纯化的"P-ATP对其进行5'-端标记b)然后将所述寡核苷酸与蛇毒磷酸二酯酶孵育c)在不同的时间点采集样品，立即猝灭反应d)然后在20%变性聚丙烯酰胺凝胶上分离寡核香酸代谢物，之后通过PhosphorImager分析进行定量。高核酸酶抗性指核香酸或核苷酸类似物是稳定的或仅;故核酸酶緩慢降解(与可比较的DNA序列在相似条件下的降解速度相比)，而低核酸酶抗性指核苷酸或核苷酸类似物核_核酸酶降解的速度与相应DNA在相似条件下的降解相当。在本发明的一些实施方案中，本发明所述核苷酸类似物(无茎信标)优选具有高核酸酶抗性，以便探针可以用于终点读数(例如在存在于扩增反应之后)、在测量后重新使用或用于进一步的验证和/或质量控制。本发明优选的实施方案提供包含信号对和至少一个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸类似物，其核酸酶抗性显著高于相应的不包含所述至少一个疏水性基团的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的核酸酶抗性。本发明更加优选的实施方案提供包含信号对和至少一个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸类似物，其中所述寡核普酸类似物对聚合酶潜在的核酸酶活性具有高核酸酶抗性。例如对抗一些TaqDNA聚合酶拥有的核酸酶活性。因此本发明优选的实施方案提供包含信号对和至少一个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸类似物，其中所述寡核香酸类似物在核酸扩增使用的条件下相对稳定。优选地，所述寡核苷酸类似物具有高核酸酶抗性，以便它们在扩增反应中仅有较低程度的降解，例如仅降解0%，如最多1%,例如最多3%，如最多5%，例如最多7%、如最多10%，例如最多15%、如最多25%，例如最多50°/。，例如介于0%和25%,如介于0%和15%,例如介于0%和10%，如介于0%和5%。优选地，上述降解是在与给定核酸酶(优选为外切核酸酶，例如Taq聚合酶)在允许核酸酶活性的条件下孵育后获得的。经常来说，本发明所述寡核苷酸类似物在插入其中的疏水性核苷酸类似物附近具有核酸酶活性抗性。因此，如果核酸酶包含5'-3'外切核酸酶活性，则本发明所述寡核香酸类似物优选在靠近5'端的位置包含至少一个疏水性核苷酸，例如疏水性核苷酸位于距5'端9,优选地6，更优选地4，例如2个核苷酸或核苦酸类似物以内。相似地，如果核酸酶包含3'-5'外切核酸酶活性，则本发明所述寡核苷酸类似物优选在靠近3'端的位置包含至少一个疏水性核香酸，例如疏水性核苷酸位于距3'端9,优选地6，更优选地4，例如2，如1个核普酸或核苷酸类似物以内。如果核酸酶包含内切核酸酶活性，则所述寡核香酸类似物优选在所述内切核酸酶的限制位点附近包含至少一个疏水性核苷酸。降低温度(执行标准的亲合性测量)时，大多数可用的实时PCR仪器都需要一定量的时间来读取信号强度。这一时间通常长的足够允许扩增子(通常具有比探针对其耙序列的亲合温度更高的亲合温度)重新退火，千扰了亲合性测量。但是在实时PCR测量过程中，测量条件为正常，所以扩增子的重新退火在很大程度上不会发生。因此本发明优选的实施方案还提供使用核酸酶抗性探针快速确定例如实时扩增反应中的最佳读数温度范围的方法，所述方法包含如下步骤b)提供包含信号对的核酸酶抗性寡核苷酸或寡核苷酸类似物，其中所述寡核苷酸或寡核苷酸类似物能够与所述靶序列和/或突变体序列杂交；和c)将所述混合物变性，然后快速冷却至设定温度(起点高于亲合温度)，和d)测量信号对的信号，和e)通过重复步骤c)至e)，同时遂渐降低步骤c)中的温度，直至该温度降低至低于亲合温度而确定包含信号对的所述核酸类似物的亲合力f)产生供以后测量的温度(例如在所述乾核酸的扩增反应过程中)，该温度低于得到的靶核酸的退火温度和/或高于得到的突变体序列的退火温度。优选地，所述寡核苷酸或寡核苷酸类似物具有对DNA聚合酶的核酸酶活性，例如对Taq聚合酶的抗性。优选地，能够与輩巴序列和/或突变体序列杂交的所述寡核苷酸或寡核苷酸类似物和所述耙序列和/或所述突变体序列同源互补。如果所述包含信号对的核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸类似物还包含至少一个本发明所述疏水性分子，如至少一个疏水性核苷酸，则更加优选。所述至少一个疏水性核苷酸优选位于上文所述的核酸酶抗性寡核芬酸类似物内。另一优选方法是当测量起点低于亲合温度时，则在重复步骤c)至e)的过程中逐渐升高温度。同样优选的还有在扩增反应过程中存在所述包含信号对的核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的方法。更加优选的实施方案是扩增反应在包含所述核酸酶抗性的寡核普酸或寡核苷酸类似物的同一容器中进行，并且上述方法也使用该容器，无需在扩增和确定退火温度之间打开该容器(封闭管反应)。同样优选达到设定温度至读取信号之间经过的时间足够长使相对较小的包含信号对的核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与其靶退火，但又不足长以允许全长扩增子(可以显著千扰测量)重新退火。这意味着，当达到步骤c)中选择的温度时，步骤d)中进行测量之前经过的时间是1秒，》口2秒-，侈J^口3秒、，6口4秒、，食!H口5牙少，3口6秒'，合J如7秒'，戈口8详少，合寸如9秒，如10秒，例如11秒，如12秒，例如13秒，如14秒，例如15秒，例如最多l秒，如最多2秒，例如最多3秒，如最多4秒，例如最多5秒，如最多6秒，例如最多7秒，如最多8秒，例如最多9秒，如最多10秒，例如最多11秒，如最多12秒，例如最多13秒，如最多14秒，例如最多15秒，如介于1和15秒，例如介于3和20秒。本领域技术人员很容易通过观察所述包含信号对的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的信号的变化(由退火温度的变化造成的)找到探针的亲合温度。因为当寡核苷酸类似物未与乾序列杂交时，信号对的两部分一般是靠近的，而当寡核苷酸类似物与其乾序列杂交时，信号对的两部分不会靠近，所以取决于寡核苷酸类似物是否与靶序列杂交，信号对产生的信号将会存在差异。在以后的测量中，例如在实时PCR反应中，用作所述包含信号对的核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸类似物测量点的温度可以是比使用上述方法得到的所述核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与靶序列的退火温度低例如TC，如2°C，例如3°C，4口4°C,例如5°C，如6°C，例如7°c，如8。c，例如9。c，如io。c，例如大于io。c，如介于rc和io。c，例如至少3。C。在以后的实时PCR反应中，用作所述包含信号对的核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸类似物测量点的温度可以是比使用上述方法得到的与突变体序列的退火温度高例如rc，如2°C，例如3°C，如41:，例如5°C,如6"C，例如7。C，如8。C,例如9。C,如10。C，例如大于10。C，如介于1。C和1(TC，例如至少3。C。在以后使用所述包含信号对的核酸酶抗性的寡核香酸或寡核苷酸类似物的基因型特异性实时PCR反应中，用作测量点的温度可以是，例如低于使用上述方法得到的与完全互补靶的退火温度并高于使用上述方法得到的与突变体序列的退火温度。上述方法的优点是解决了在形成形成更慢但更稳定的双链体扩增子之前探针与乾序列退火的竟争问题。但是上述方法可能不总是优选的。因此，取决于可用仪器的灵活性、稳健性和升温速度，可优选使用熔解温度用于确定以后测量的最佳测量温度。熔解温度和亲合温度是探针用来检测耙序列、确定实验中的测量温度的重要特征。因此本发明优选的实施方案还提供使用核酸酶抗性探针快速确定扩增反应的最佳读数温度范围的方法，所述方法包含如下步骤a)提供包含乾序列和/或突变体序列的核酸或核酸类似物混合物；和b)提供引物组和包含信号对的核酸酶抗性寡核普酸或寡核苷酸类似物(4笨针)，其中所述引物和所述探针能够与所述靶序列和/或突变体序列杂交；和c)将所述引物和探针与所述核酸和/或核酸类似物混合物在允许所述引物与所述核酸和/或核酸类似物杂交的条件下孵育；和d)使用所述杂交的靶序列作为才莫板，用核苷酸或核普酸类似物或寡核苷酸或寡核苷酸类似物对所述引物的3'端进行延伸；和e)将所述探针与其靶序列杂交，并测量信号强度(例如在与引物杂交的温度相同的温度下)，和f)测量信号强度时，按照一定的幅度逐渐增加温度，直至达到所需的延伸温度，和g)完成延伸反应，将形成的扩增子变性，然后重复步骤c)至g)直至发生所需的扩增h)确定探针的熔解温度。优选地，所述寡核香酸或寡核苷酸类似物具有对DNA聚合酶的核酸酶活性，例如对Taq聚合酶的抗性。优选地，能够与輩巴序列和/或突变体序列杂交的所述寡核苷酸或寡核苷酸类似物和所述靶序列和/或所述突变体序列同源互补。如果所述包含信号对的核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸类似物还包含至少一个本发明所述疏水性分子，如至少一个疏水性核苷酸，则更加优选。所述至少一个疏水性核芬酸优选位于上文所述的核酸酶抗性寡核苷酸类似物内。优选达到探针杂交温度和第一次读取信号之间经过的时间足够长使相对较小的所述包含信号对的核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与其靶退火，但又不足长以允许扩增子(显著干扰测量)重新退火。接下来的温度增加和测量应尽快执行，以最大限度地减少扩增子的重新退火。优选当达到步骤e)中选择的温度时，进行测量之前经过的时间是1秒、，^口2牙少，仿:i口3禾少，i口4秒、，侈'如5秒、，3口6秒'，侈':i口7秒、，》o8秒、，例如9秒，如10秒，例如11秒，如12秒，例如13秒，如14秒，例如15秒，例如最多l秒，如最多2秒，例如最多3秒，如最多4秒，例如最多5秒，如最多6秒，例如最多7秒，如最多8秒，例如最多9秒，如最多10秒，例如最多11秒，如最多12秒，例如最多13秒，如最多14秒，例如最多15秒，如介于1和15秒，例如介于3和20秒。步骤f)中每次测量信号强度优选的温度上升为，例如rc，如2i:，例如3。C，如4。C，例如5。C，如6。C，例如7。C,如8。C，例如9。C，如介于rc和icrc。本领域技术人员很容易通过观察所述探针的信号的变化(由增加温度造成的)得到探针的熔解温度。在以后的实时PCR反应中，用作所述包含信号对的核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸类似物测量点的温度可以是比使用上述方法得到的靶序列的熔解温度低例如o.rc,如o.2。c，例如o.5。c，如rc,例如1.5。c如2°C，例如3"C，如4。C，例如5。C,如6。C，例如7。C，如8。C，例如9。C，如介于O.TC和l(TC，例如至少3°C。在以后的实时PCR反应中，用作所述包含信号对的核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸类似物测量点的温度可以是比使用上述方法得到的突变体序列的退火温度高例如PC,如2。C，例如3。C，如4。C,例如5。C,如6°C，例如7°C,如8°C，例如9°C，如介于1。C和10°C，例如至少3°C。在以后使用所述包含信号对的核酸酶抗性的寡核香酸或寡核苷酸类似物的基因型特异性实时PCR反应中，用作测量点的温度可以是，例如低于使用上述方法得到的完全互补靶的熔解温度并高于使用上述方法得到的突变体序列的熔解温度。如果聚合酶具有外切核酸酶活性，则不可以对不是核酸酶抗性的寡核苷酸使用上述方法或者至少上述方法是不优选的。那样的话探针将被降解，在所述温度范围内，信号强度将没有或仅有很小变化。上述方法的优点在于提供了在扩增反应使用的条件下，每个循环在不同温度下的数据。因此本领域技术人员容易检索有关探针和扩增反应二者的行为的信息，从而轻松快速地执行设置的优化。核酸酶抗性探针或封闭核酸酶活性的分析的另一个好处是探针的测量温度无需与扩增反应的退火温度或延伸温度相关。此外，还可以在扩增过程中使用两个或多个不同的测量温度。当分析中存在多于一个探针时，使用两个或多个测量温度尤其有利。这样就可以在各自的优化温度下读取多个探针。疏水性基团本发明涉及包含疏水性核苷酸的寡核苷酸类似物，其中所述疏水性核苷酸具有通用结构X-Y-Q其中Q是疏水性分子。本发明所述疏水性分子具有疏水性并且不参与沃森-克里克氬键合。因此，本发明所述疏水性分子不是天然存在的核碱基。疏水性指物质排斥水或不能够完全溶于水的倾向。疏水性物质容易溶解于许多非极性溶剂，如辛醇，但在极性溶剂水中仅有少量溶解。一种确性的对比(也称为分配)有关。有机-水分配(P)描述了水中溶解的有机污染物在水相和不混溶的有机相之间的平衡分布。在将近100年的时间里，这两个相就是辛醇-水分配系数，这种疏水性测量方法也广泛用于描述有机物在天然水中的行为。疏水性越大，物质分配至疏水性有机相的倾向就越大。因此分配系数就是两个接触而不混溶的相之间的平衡浓度的筒单比值，即P-[有机相]/[水相]这一简单关系假定不存在显著的溶剂相互作用(溶剂是连续介质)、溶质-溶质相互作用(活度系数与浓度无关)或任何其它作用。在辛醇/水两相系统中，化学物在辛醇相中的浓度与其在水相中的浓度的比值也被称为K。w值。P=Kow=[辛醇相中浓度]/[水相中浓度〗K。w值不含单位，通常使用低溶质浓度(以便溶质本身不会影响分布)在室温下测量。正辛醇是两亲性物质，兼有疏水性和亲水性部分(分别为正烷基和醇基团)。这意味着它可以通过氢键合与亲水性物质相互作用，和通过范德华力与疏水性物质相互作用。Kow值的范围为10-3至107(logKow为-3至7)，但是大多数测量的logK。w都小于5，原因是高于此值时，化合物分配将非常强，而难于测量水相浓度(但是更高的值可以通过测量或计算获得)。K。w并不是化学物在辛醇和水中的溶解度的比值，因为这两个相不构成单纯的双元系统。特别是水在正辛醇中具有可观的溶解度，生成了新的更亲水的相。达到平衡时，有机相含有2.3mol/L的水，而水相含有4.5xl(T3mol/L的辛醇。控制非极性和轻度极性化合物的辛醇-水分配系数的主要因素显然是该化合物的疏水性，而不是正辛醇溶解度，所以有才几相的准确性质相对不重要。一般优选本发明所述疏水性分子的Kow至少为1。用于研究分配的其它系统包括[水]/[环己烷]、[水]/[氯仿]和其它。分配系数是加成性组成属性，即，对于给定分子，分配系数可视为其组成部分的加成函数。这M于事实对于不同化合物来说，将-CH3基团从一个环境转移的能量学是相对恒定的。这使得基于计算机的分配预测成为可能。非极性部分几乎都不能与水分子相互作用，因此非极性部分附近的水分子重定向自身以最大限度地增加它们之间的氬键合。这导致水分子排序并降低系统的熵，但是如下文所述，这不总是起作用的仅有的力量。当两个非极性部分或表面彼此靠近时，这些被限制的水分子就4皮挤出并游离进入大体积的水相。因此，疏水性相互作用可以视为从水相排出和熵最大化的过程。范德华相互作用也被认为参与非极性表面之间的相互作用。虽然非极性分子的平均偶极矩可为零，但是在给定瞬间，由于电子和质子的瞬时位置，偶极矩为非零。此偶极可以诱发附近中性分子的偶极矩。然后这两个偶极可以互相吸引。可以通过下列程序确定分配将相关化学物加入辛醇和水混合物，根据Kow的预期值调整所述化合物的体积比。1.在任何单相中，系统中溶质的浓度应少于0.01mol/L。2.必须使用非常纯净的辛醇和水。3.轻轻摇动系统(通常位于分液漏斗或相似设备中)直至达到平衡(0.5小时至3天)。然后离心所述系统以分离两相和破坏任何乳状液。4.然后通过适当的技术分析所述两个相以确定溶质浓度。如果可能，对两个相都进行分析以实现质量平衡。也可以使用其它技术，例如可以将溶质在HPLC中的保留时间与疏水性关联起来(例如Sahu&Pandit(2003)o/丄&.cfeAe/.7fec/2"o/.26:135-146)。如果实驺、没计适当，保留时间的log值与K^的log值线性相关。此外，还使用计算机算法计算化合物的预期值(例如ALOGPS2.1h加:〃146.107.217.178/lab/alogps/starthtmK另请参见下文)。疏水性效应是非极性分子在存在水溶液时容易自我结合的属性。在最极端的情形下，油将聚集在一起而不能与水混i^;去污剂形成的胶束和双层(如在肥皂泡中)是疏水性效应的另一戏剧性结果。蛋白质折叠、蛋白质-蛋白质相互作用、核酸结构和蛋白质-小分子相互作用场合中也通常描述此效应。在蛋白质折叠情形下，它用于解释为什么许多蛋白质具有由疏水性氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨睃基团一起组成的疏水性核；通常是围绕中央疏水性轴形成的巻曲螺旋结构。疏水性相互作用是蛋白质折叠，以最大限度地减少与溶剂接触的非极性(疏水性)表面面积的主要驱动力。这使折叠减少了约3-4倍。非常清楚，疏水性效应是液态水特殊属性，最大可能是强的氩^T建合和水的小体积组合的结果。疏水性效应不仅仅是熵效应，而是熵和焓(随温度变化显著)共同的贡献。疏水性相互作用的基础在于极性水分子和非极性分子之间缺乏强的有利的相互作用。这有效地导致了非极性分子间相互作用的增加。焓对疏水性相互作用的贡献在20。C左右(即室温)约为0，而熵的贡献在140。C左右变为0。在比室温高出许多的温度下，非极性基团周围的水分子的有序性逐渐降低。随着温度的降低，疏水性相互作用的强度也降低。这是与H-键相反的效应，H-键在较低温度下变得更强。可通过将溶液温度降低至接近零度而将疏水性效应消减至一定程度；在此温度下，水"更喜欢"处于有序结构，而此疏水性片(patch)产生的有序结构也不再是能量上不利的。在低于室温的温度下，苯在水中的溶解度增加就完美地证明了这一点。疏水性通常用目标基团从水溶液迁移至非极性溶剂(通常为辛醇)的自由能(G迁移)来测量。一般而言，G迁移值和疏水性的其它测量值之间有很好的相关性。AG迁移=-RTlnPlnP值大于0表示化合物在有机相的浓度大于在水相的浓度。在本发明中，优选的疏水性分子无论是通过实验确定还是通过使用计算机程序计算(ALOGPS2.1,VirtualComputationalChemistryLaboratory,可在h加:〃146.107.217.178/lab/alo印s/starthtml在线获得或从下列网址下载标准版http:〃146107.217.178/forms/downprogform.html,AlogPs2.1的描述参见Tetko和Tanchuk(2002)/.C/^亂/"/CowpW.42:1136-1145和Tetko和Tanchuk(2001)C/2e附./"/Co附/組5"c/.,41:1407-1421)，logP值均大于0的疏水性分子(不考虑主链单体单元或连接体，但是考虑与所述连接体或主链单体单元连接位置处的甲基)。有关如何计算本发明所述logP值的详细信息，另请参见下文的实施例。因此，确定的所述logP值是代替包含曱基的连接体的疏水性分子的logP值。因此，对于任何给定的具有X-Y-Q结构的疏水性核苷酸，logP值是通过用甲基取代主链单体单元(X)和连接体(Y)，然后确定logP值来确定的。在本发明中，疏水性分子的logP计算值(不考虑主链单体单元或连4妄体，但是考虑寡核苷酸或寡核普酸类似物连接位置处的甲基)优选为，例如大于0，如大于0.5，例如大于0.75，如大于l，例如大于1.25，如大于1.5，例如大于1.75，如大于2例如大于2.5，如大于3，例如大于4，如大于5。本发明所述疏水性分子优选不参与沃森-克里克氩键合。在一个实施方案中，所述疏水性分子基本上不参与，如不参与与其它核碱基的特异性氬键合。此外，优选所述疏水性分子不是信号对的组成部分。疏水性效应在如此广泛的温度范围存在，这对本发明是一个很大的优点。它意味着对于在水溶液中进行的普通分析，在任何给定温度下，未结合探针的背景信号都将得到改进，如在2(TC至95。C范围内的温度下。因此本发明优选的实施方案提供本发明所述的包含至少一个疏水性分子(如疏水性核苷酸)和信号对的寡核苷酸类似物(例如无茎信标)，在介于2(TC和95匸之间的任何温度下，其背景信号都较相应的不包含所述疏水性基团的核酸有改进。本发明所述疏水性分子任选地通过连接体共价连接至核苷酸、核苷酸类似物或其自身的主链单体单元。一般而言，所述疏水性分子可共价连接至连接体，而该连接体共价连接至主链单体单元。包含本发明所述疏水性分子的核苷酸可以插入寡核苷酸或寡核普酸类似物的任何位置。本发明所述核苷酸应插入包含其它核苷酸或核脊酸类似物的寡核苷酸或寡核苷酸在本发明的一个优选实施方案中，所述疏水性分子不直接共价连接至包含天然存在的核碱基的核苷酸类似物的核苷酸。因此，在此实施方案中，连接体Y优选不包含核碱基，并且主链单体单元也不包含核碱基。本发明所述疏水性分子应向包含它们的寡核苷酸类似物(例如无茎探针)引入改进的信噪比和任选地一个或多个下列特征如改进的核酸酶抗性和/或增强的亲合性，但是其它特征，如序列识别、核酸酶敏感性、对緩冲液溶液离子强度的依赖性和/或Mg^依赖性，可以通过构成该寡核苷酸类似物(例如无茎信标)的其它(非疏水性)核苷酸确定。本发明的主要目标是提供包含疏水性分子的线性探针(无茎信标)，其信噪比要好于相应的不含所述疏水性分子的线性探针。当所述探针未与靶序列结合时，所述疏水性分子应有利于探针的两半进行更近的相互作用，进而有利于信号对的两个部分进行更近的相互作用。重要的是，未结合探针的信号对的两半要具有强烈的相互作用(在测量温度下)，原因是本发明使用的所有信号对的信号强度都依赖于所述对的两个部分之间的距离。当探针与其乾核酸结合时，探针将会展开，它的两端将被分开，但是当它未与乾核酸结合时，所述探针形成随机的巻曲螺旋，信号对的两个部分将彼此靠近。例如，FRET的效率依赖于分子间距离的逆六次方根(inversesixthpower),说明了未结合探针中信号对的两个部分靠近对获得好的信噪比的重要性。疏水性分子的存在增强了未结合探针两半的相互作用。本发明所述疏水性基团优选为能够诱导信号对的两个部分更好地相互作用，从而获得更好的探针信噪比的疏水性基团。例如，如果信号对由荧光团和猝灭剂组成，则通过降低未结合探针的背景信号即可增加信噪比。不受任何特异性理论的束缚，认为疏水性分子可以增加未结合探针中信号对两个部分的相互作用的主要原因是，本发明所述探针的另一端的疏水性分子间的疏水性相互作用试图彼此保护以防止让太多表面接触亲水性溶剂，从而增加了信号对两个部分彼此靠近的可能性。因此所述探针不仅依赖于随^L巻曲螺旋，而且有额外的力能帮助回折。使用包含信号对的探针(其中信号依赖于所述信号对的两个部分之间的距离)检测、鉴定或定量耙序列时，重要的一点就是信噪比要尽可能远离1以避免假阳性和假阴性解释。同样重要的还有多重反应中的背景信号不能太高，原因是这样会导致荧光团之间串话(cross-talk)。因此，优选实施方案提供包含本发明所述至少一个疏水性分子和信号对的寡核苷酸类似物，其中至少一个所述疏水性分子位于所述寡核苷酸或寡核苷酸类似物的半侧并能与位于所述寡核苷酸或寡核普酸类似物另一半的所述信号对的部分发生疏水性相互作用，以便当探针未结合时，所述信号对的两个部分之间的相互作用强于相应的不包含所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸类似物。本发明另一个更加优选的实施方案提供包含信号对和在所述寡核苷酸类似物的两侧各有至少一个疏水性分子的寡核香酸类似物，其中所述疏水性分子能够彼此发生疏水性相互作用，以便当探针未结合时，所述信号对的两个部分之间的相互作用强于相应的不包含所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸类似物。信号对两个部分之间的增强的相互作用也可导致信号强度高于或低于相应的不包含所述嵌入剂的寡核苷酸或寡核苷酸类似物。如果所述信号对由荧光团和猝灭剂组成，则所述两个部分之间增强的相互作用优选造成荧光降低。本发明更加优选的实施方案提供包含至少一个疏水性分子(优选为疏水性核苷酸)、荧光团和猝灭剂的寡核苷酸类似物，当所述寡核苷酸类似物/探针未与把序列结合时，其背景信号要低于相应的不含所述疏水性分子(如疏水性核香酸)的线性探针。优选地，上述实施方案特别适用于在封闭管(同质性)分析中使用所述寡核苷酸类似物的情形。本发明的另一个实施方案提供包含至少一个疏水性核苷酸和信号对的寡核苷酸类似物，其中所述信号对的部分在靠近时能够形成受激子、激发复合体、FRET复合体或电荷迁移复合体，其中当所述寡核苦酸类似物/探针未与靶序列结合时，所述寡核苷酸类似物的背景信号要高于相应的不含所述疏水性核苷酸的线性探针。优选地，上述实施方案特别适用于在封闭管(同质性)分析中使用所述寡核普酸类似物的情形。在本发明优选的实施方案中，所述寡核苷酸类似物，如无茎信标由DNA核苷酸、信号对和疏水性核苷酸组成。包含本发明所述至少一个疏水性分子(如疏水性核普酸)和信号对的寡核苷酸类似物可包含优于相应的不包含所述疏水性分子的寡核普酸或寡核苷酸类似物的特征(无论所述探针是用于外切核酸i^农赖性分析或非外切核酸H^赖性分析)。因此本发明优选的实施方案提供包含至少一个疏水性分子和信号对(探针)的寡核苷酸类似物，所述寡核苷酸类似物的信噪比要好于相应的不含所述疏水性分子的线性探针，其中所述探针用于核酸酶依赖性分析。更加优选地，所述分析依赖于聚合酶的外切核酸酶活性。对于本发明的一些应用，无茎信标必须未被例如DNA聚合酶的核酸酶活性降解或至少未有任何程度显著的降解。因此在本发明的一些实施方案中，优选提供包含至少一个疏水性分子和信号对的寡核苷酸类似物，其中所述寡核苷酸类似物的核酸酶稳定性高于相应的不包含所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的核酸酶稳定性。分子探针的主要挑战之一就是如何能够辨别差异小至一个核苷酸的非常相似的靶。一般而言，揭:针越短，一个错配对亲合性的影响越大，因此就越容易靶向完全互补靼而不是错配的乾。高亲合性DNA类似物、小沟结合物、MGB和嵌入剂之前已用于生产可以比相应的基于DNA的探针短的荧光探针。因此本发明优选的实施方案提供包含至少一个疏水性分子(如疏水性核苷酸)和信号对的寡核苷酸类似物，其中所述寡核普酸类似物和靶序列(如DNA序列)的杂种的熔解温度与相应的不包含所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸类似物和乾序列(如DNA序列)的杂种的熔解温度相同，或咼于后者o原则上讲，任何引入的探针信噪比能够显著好于(更加远离值l)相应的不含所述疏水性分子(如疏水性核苷酸)的线性探针的疏水性分子(如疏水性核苷酸)都可以用于本发明。这意味着，在一个实施方案中，所述疏水性分子可以是嵌入剂、小沟结合物和以前已经用于与探针结合的其它分子。但是产生的信噪比不能显著好于(更加远离值l)相应的不含所述疏水性脂肪酸、类固醇、小沟结合物和嵌入剂都是可以用于本发明的疏水性分子，特别是具有如上文所述的logP值的此类脂肪酸、类固醇、小沟结合物和嵌入剂。但是，本发明优选的疏水性分子是能够和本发明所述寡核苷酸类似物与其靶序列杂交形成的双链体相互作用而不扰动所述双链体(与所述疏水性分子不存在于所述寡核苷酸或寡核普酸类似物时相比)的疏水性基团。本发明所述的疏水性分子优选包含至少一个环系统，如5或6元环结构。所形成的环可以是芳环或非芳环种类。优选地，所述环系统由C、S、N和/或0组成，优选地，所述环系统的大部分成员为C。可独立取代所述环系统的各个位置。更优选地，本发明所述疏水性基团是嵌入剂和小沟结合物。本发明所述的疏水性基团最优选是嵌入剂。嵌入剂本发明所述术语嵌入剂涵盖包含至少一个能够与核酸的核碱基共堆叠的基本上平面接合的系统的任何分子部分。优选地，本发明所述嵌入剂基本上由至少一个能够与核酸或核酸类似物的核碱基共堆叠的基本上平面才妄合的系统组成。嵌入剂包含至少一个兀(phi)电子系统，依据本发明，该7t电子系统可以与其它包含TI电子系统的分子相互作用。这些相互作用可以对所述嵌入剂的疏水性相互作用起正或负贡献。Hunter和Sanders(1990)丄爿wC/2ew.Soc.112:5525-5534，推荐了两个兀电子系统可以彼此正向相互作用的一系列不同的取向和条件。优选地，所述嵌入剂包含选自聚芳烃(polyaromate)和杂聚芳烃(heteropolyaromate)的化学基团，更优选地，所述嵌入剂基本上由聚芳烃或杂聚芳烃组成。最优选地，所述嵌入剂选自聚芳烃和杂聚芳烃。本发明所述聚芳烃或杂聚芳烃可由任何合适数量的环组成，如1，例如2，如3，例如4，如5，例如6，如7,例如8,如大于8。此外，聚芳烃或杂聚芳烃可被选自由羟基、溴、氟、氯、碘、巯基、硫、氰基、烷基硫、杂环、芳基、杂芳基、氛基、烷氧羰基(carboalkoyl)、烷基、烯基、炔基、硝基、氨基、烷氧基、羰基和酰氨基组成的组的一个或多个取代。当本发明所述寡核苷酸类似物与互补靶杂交时，信号对的两个部分(例如荧光团和猝灭剂)在空间距离上是分开的，以允许所述荧光团发焚光。本发明所述寡核苷酸类似物包含至少一个包含疏水性分子如平面(杂)芳基嵌入剂的疏水性核苷酸，当所述嵌入剂不能嵌入互补双链体的减基对时，它们彼此发生疏水性相互作用或与所述信号对的任一部分发生疏水性相互作用。这样它们就可以促进所述疏水性分子的疏水性部分和信号对之间的相互作用和最大限度地减少与緩沖液中的水的接触。因此，如果混合物中没有互补靶或互补靶少于寡核苷酸类似物(如无茎信标)，依据本发明，未结合的寡核苷酸类似物(探针)的疏水性分子(例如嵌入剂)将促进所述探针的两端互相靠近，从而增强对未结合的寡核芬酸类似物(如无茎信标)的荧光团的猝灭。与传统的基于DNA的分子信标不同，此回折机制与序列无关，因此无须设计自我互补的茎结构以适当地猝灭所述分子。两个芳香系统之间相互作用的强度可通过上述疏水性相互作用以及电子分布、密度、取向、距离和接合系统的大小确定。因此，本发明所述疏水性分子可以是优选选自以下组成的组的嵌入剂菲咯啉、吩唤、菲啶、蒽醌、芘、蒽、环烷(napthene)、菲、茵、篇(chrysene)、萘并苯(naphtacene)、吖啶酮类、苯并蒽类、均二苯代乙烯类、草酰吡啶咔唑类、叠氮苯类、卟啉类、补骨脂素类，和^皮选自由羟基、溴、氟、氯、碘、巯基、硫、氰基、烷基硫、杂环、芳基、杂芳基、羧基、烷氧羰基、烷基、烯基、炔基、硝基、氨基、烷氧基和/或酰氨基组成的组的一个或多个取代的任何上述嵌入剂。优选地，所述嵌入剂选自由菲咯啉、吩溱、菲啶、蒽醌、芘、蒽、环烷、菲、茴、篇、萘并苯、吖啶酮类、苯并蒽类、均二苯代乙烯类、草酰吡啶咔唑类、叠氮苯类、卟啉类和补骨脂素类组成的组。更优选地，所述嵌入剂选自由菲咯啉、吩。秦、菲啶、蒽醌、芘、蒽、环烷、菲、茵、篇、萘并苯、吖啶酮类、苯并蒽类、均二苯代乙烯类、草酰吡啶咔唑类、叠氮苯类、卟啉类和补骨脂素类组成的组。在优选的实施方案中，所述嵌入剂选自由菲咯啉、吩*、菲啶、蒽醌、芘、蒽、菲、篇、萘并苯、苯并蒽类、均二苯代乙烯类和卟啉类组成的组。在另一个优选的实施方案中，所述疏水性基团包含芘或吡啶并[3',2':4，5]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4(lH)-酮或7,9-二甲基-吡啶并[3',2',4,5]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4(3H)-酮。所述疏水性基团也可由芘或吡啶并[3',2':4,5]瘗吩并[3,2-d]嘧咬-4(lH)-酮，或7,9-二甲基-吡啶并[3'，2',4,5]噻吩并[3,2-d]嘧咬-4(3H)-酮组成。更优选地，所述嵌入剂可选自包含如下文所示的结构之一的嵌入剂组<formula>formulaseeoriginaldocumentpage63</formula>6H-吲哚并[2,3-b]喹喔啉会啉1H-茚苯并噻唑<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>OMeMe,MeO'、、,OMe+N屮XXXIV二苯并[a,g]会"秦，2,3,10,11-四曱氧基-8-甲基-NH2一N^~/xxxvk泛喹酮，3,8-二M-5-[3-(二乙基甲基铵基)丙基]國6-苯基-ON0XXXVIlH-苯并[de]异喹啉隱l,3(2H)-二酮Y、NXXXV迈、J.吡啶并[3,2-a:2',3'-c]吩溱XXXIX\喹啉，4-[(3-乙基-2(3H)-苯并噁唑亚基)曱基]-l-曱基-f、^々NXL1+H2N'吖啶，6-氨基-3,10-亚M-lO-曱基-'瑪二氢國3画66吖啶，9-tt-10-曱基-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>^---\喹淋，l-甲基-4-[(3-甲基-2(3H)-苯并遂唑亚<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>1,3,6,8(2H,7H)-芘四酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>苯并[lmnp,8]菲咯啉<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>2H-l-苯并吡喃-2-酮XLVI咕吨，9-苯基-吡咬并[3',2':4,5]遂吩并[3,2-d]嘧啶-4(lH)-酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>富瓦烯以及任选地但是并不是如此优选的，其衍生物。更优选地，所述嵌入剂可选自由上述编号为v、xii、xiv、xv、xvii、xxiii、xxvi、xxviii、xlvii、li和lii的嵌入剂结构以及其衍生物组成的嵌入剂组，优选选自由上述编号为v、xii、xiv、xv、xvii、xxiii、xxvi、xxvm、xlvii、Li和Lii的嵌入剂结构组成的嵌入剂组。最优选地，所述嵌入剂选自上述编号为xn、xiv、xvn、xxin、li以及其衍生物的嵌入剂结构组，优选选自上述编号为xii、xiv、xvii、xxm和li的嵌入剂结构组。上述实例列表不应以任何方式视为限制，而仅是为了提供包含嵌入剂的疏水性分子的可能结构的实例。此外，在每个嵌入剂上进行一个或多个化学基团取代以获得修饰的结构也包括在本发明内。在本发明的一个实施方案中，所述嵌入剂可以是国际专利申请WO03/052132在"intercalator"(嵌入剂)一节(第46页第10行-第54页第13行)中描述的任何嵌入剂。68小沟结合物虽然在本发明其它实施方案中，所述疏水性分子优选不是小沟结合物，但是在一个特异性实施方案中，所述疏水性分子可以是小沟结合物。所述小沟结合物优选是具有如上文所示的logP值的疏水性分子。小沟结合物是与双链体DNA在小沟结合的一类潜在的寡核香酸或寡核苷酸类似物修饰剂。小沟结合物是采用"新月状，，的，可以与双螺旋中两个磷酸-糖主链之间形成的深窄空间(叫做小沟)紧密结合，置换水分子和在所述小沟中形成紧密的原子接触的长的扁平分子。它们通过氢键和/或疏水性相互作用稳定于所述小沟中。上文的先前技术一节简要解释了Kutyavin和同事如何将MGB分子接合至探针的3'-端并将其用于5'-核酸酶PCR分析和非核酸酶依赖性分析(其中所述MGB连接至探针的5'-端)。所有这些出版物均未讨论通过未结合探针的疏水性相互作用降低背景信号。因此，即使MGB在本领域为公知，在本发明之前，并不知道处于寡核苷酸类似物内正确组合和位置的所述MGB的疏水性可以用于通过增加信号对两个部分之间的相互作用而改进信噪比。因此本发明优选的实施方案提供包含至少一个小沟结合物和信号对的寡核苷酸类似物，其中所述小沟结合物位于所述寡核苷酸或寡核苷酸类似物的一端，并且当未与靶序列结合时，该小沟结合物与所迷寡核苷酸类似物另一半的部分具有疏水性相互作用。特别是，优选包含小沟结合物的疏水性核苷酸不是位于寡核苷酸类似物5'端或3'端的第一个核苷酸或核苷酸类似物，而是在其内部。本发明更加优选的实施方案提供的寡核香酸类似物包含信号对和位于所述寡核苷酸类似物一端的至少一个小沟结合物和另一个位于所述寡核苷酸类似物另一半的本发明所述疏水性分子，所以当所述寡核苷酸类似物未与靶序列结合时，所述小沟结合物和所述疏水性分子对彼此具有疏水性相互作用，使所述信号对的两个部分之间更好地相互作用。主链单体单元依据本发明，核苷酸或核苦酸类似物的主链单体单元是参与掺入核酸或核酸类似物的主链的核苷酸的部分。主链单体单元(x)优选共价连接至连接体(Y)，而连接体(Y)共价连接至疏水性分子。可以采用任何合适的主链单体单元将疏水性核苷酸掺入本发明所述寡核苷酸类似物。也可以使用任何类型的连接体连接所述主链单体单元和所述疏水性分子。此外，所述主链单体单元可包含一个或多个离去基团、保护基团和/或反应基团，这些基团可以在合成包含所述主链单体单元的寡核苷酸或寡核普酸类似物的过程中或合成之后以任何方式除去或变化。主链单体单元可以是任何合适的主链单体单元。例如，在本发明的一个实施方案中，主链单体单元可选自由以下组成的组DNA、RNA、PNA、HNA、画A、ANA、LNA、CNA、CeNA、TNA、(2'國NH)國TNA、(3'画NH)國TNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、(3-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、双环-DNA、6-^J^-双环-DNA、5-表-双环-DNA、a-双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA、双环[3.2.1]-DNA、双环[4.3.0]酰胺-DNA、P-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃来苏糖基-NA、2'-R-RNA、a-L-RNA或a-D-RNA、P-D-RNA和其混合物和其杂种的主链单体单元，以及其磷原子修饰，如但不限于硫代磷酸酯、曱基磷酸化物、亚磷酰胺、二^5克代磷酸酯、硒代磷酸酯、磷酸三酯和硼代磷酸酯。此外，不含磷的化合物也可用于与核苷酸连接，如但不限于甲亚氨基甲基、乙酸曱酯、硫代乙酸甲酯和包含酰胺的连接基团。特别是核酸和核酸类似物可包含一个或多个本发明所述疏水性核普酸。下文描述了本发明使用的核普酸和核苷酸类似物的一系列不同的主链单体单元和它们如何通过连接至所述主链单体单元的一个或两个位置的连接体与核碱基连接<formula>formulaseeoriginaldocumentpage71</formula>一些类似物的寡聚体实例环己烷基-NA(CNA)一些类似物的寡聚体实例<formula>formulaseeoriginaldocumentpage73</formula>a-L-核糖-LWA相应类似物的核酸的一段Ref:RajwaD淑,V，K.etal.Ch加.Coramun.，1999,1395-13诉,Ref:叫、va鹏hLV.Ketal.Angew'Ch啦IntBd,，2000，1656-1659.Re^W咖gG，；etal.Tetrabftdron,7707*2724.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage75</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage76</formula>2'修饰的寡聚体的通用结构A碱基<formula>formulaseeoriginaldocumentpage76</formula>据我们所知尚未合成或公开的修饰的实例:上文显示的一些主链单体单元已偶联至本发明所述疏水性分子，而其它主链单体单元可以具有连接至核苷酸的疏水性分子。可以在任何可用原子，如核碱基、主链或连接所述核碱基和主链的连接体(如果存在)的原子处连接所述疏水性分子。所述疏水性分子也可以置换所述核碱基或偶联至其自身的任何类型的主链单体单元。在优选实施方案中，主链单体单元不包含核碱基，如天然存在的核碱基。连接体也优选不包含核碱基，如天然存在的核碱基。当主链单体单元包含核糖基团时，在一个实施方案中，所述疏水性分子优选通过连接体共价连接至核糖基团。因此在此实施方案中，所述疏水性分子优选不通过连接体(Y)共价连接至主链的磷酸基团。LNA(锁核酸)的主链单体单元是空间受限的DNA主链单体单元，其包含限制DNA主链单体单元通常的构象自由的分子内桥。LNA可以是WO99/14226(Exiqon)中描述的任何LNA分子，优选地，LNA是选自WO99/14226的摘要中描绘的分子。本发明所述LNA优选包含将2'-0位置连接至4'-C位置的曱基连接体，但是其它LNA(如其中2'氧原子被置换为氮或石危的LNA)也包含在本发明内。包含本发明所述疏水性分子的核苷酸主链单体单元优选为允许所述疏水性分子与其靼核酸相互作用的主链单体单元。在本发明的一个优选实施方案中，所述主链单体单元选自由无环主链单体单元组成的组。无环意在涵盖任何不包含环结构的主链单体单元，例如所述主链单体单元优选不包含核糖或脱氧核糖基团。因此，优选地，本发明所述疏水性核香酸的主链单体单元可选自由包含至少一个选自三价和五价磷原子(如五价磷原子)的化学基团的主链单体单元组成的组。更优选地，本发明所述主链单体单元的磷酸原子可选自由包含至少一个选自磷酸酯、磷酸二酯、磷酰胺(phosphoramidate)和亚磷酰胺(phosphoramidit)基团的化学基团的主链单体单元组成的组。特别是，优选地，本发明所述疏水性核苷酸的主链单体单元选自由包含至少一个选自磷酸、磷酸酯、磷酸二酯、磷酰胺和亚磷酰胺基团的化学基团的无环主链单体单元组成的组。优选地，所述主链单体单元能够以最多5，例如最多4个原子将所述主链单体单元的磷原子和最近的相邻磷原子隔开的方式掺入核酸或核酸类似物的磷酸主链，更优选地，5,如最多4个原子将所述主链单体单元的磷原子和最近的相邻磷原子隔开的方式掺入核酸或核酸类似物的磷酸主链，两种情况下均不包括所述磷原子自身。在本发明特别优选的实施方案中，所述疏水性核苷酸包含包含亚磷酰胺的主链单体单元，更优选地，所述主链单体单元包含三^介亚磷酰胺或五价。合适的三价亚磷酰胺是可掺入核酸和/或核酸类似物主链的三价或五价亚磷酰胺。通常来讲，所述亚磷酰胺(amidit)基团本身不可掺入核酸主链，而是亚磷酰胺(amidit)基团或亚磷酰胺(amidit)基团的部分可充当离去基团和/或保护基团。但是，优选地，所述主链单体单元包含亚磷酰胺基团，原因是此基团可促进所述主链单体单元掺入核酸主链。在本发明的一个实施方案中，所述主链单体单元可以是国际专利申请WO03/052132在"Backbonemonomerunit"(主链单体单元)一节(第24页，第27行-第43页，第14行)中描述的任何主链单体单元。连接体本发明所述疏水性核香酸的连接体是连接疏水性分子和所述疏水性核苷酸的主链单体的部分，优选地共价连接所述疏水性分子和(abdtge)主链单体单元的部分。连接体可包含一个或多个原子或原子间的键。通过上文确定的主链和疏水性分子的定义，即表明连接体是连接主链和疏水性分子的最短途径。如果疏水性分子直接连接至主链，则连接体是键。连接体通常由原子链或分支的原子链组成。链可以是饱和以及非饱和的。连接体还可以是接合或未接合键的环结构。例如，连接体可包含m个选自由C、O、S、N、P、Se、Si、Ge、Sn和Pb组成的组，优选选自由C、O、S、N和P组成的组，更优选地为C的原子的链，其中所迷链的一端连接至疏水性分子，而所述链的另一端连接至主链单体单元。在一些实施方案中，依据本发明，连接体和疏水性核苷酸的疏水性分子的总长度优选介于8和13A(参见下文)。因此，应根据特定疏水性核苷酸的疏水性分子的大小选择m。即，当嵌入剂小时，m应该相对较大，而当嵌入剂大时，m应相对專交小。但是，对于大多数用途，m将为1至7，如1至6,如1至5，如1至4的整数。如上文所述，连接体可以是非饱和链或另一个包括接合键的系统。例如，连接体可包含环的接合结构。优选地，当连接体为饱和链时，m介于1至4。当疏水性分子为芘时，m优选为1至7，如1至6,如1至5，如1至4,更优选地1至4，甚至更优选地1至3的整数，最优选地，m为2或3。当嵌入剂具有结构NSQ时，m优选介于2至6，更优选地为2。在一个实施方案中，所述连接体是氮杂烷基(azaalkyl)、氧烷基(oxaalkyl)、硫烷基(thiaalkyl)或烷基链。例如所述连接体可以是被选自由C、H、O、S、N、P、Se、Si、Ge、Sn和Pb组成的组，优选选自由C、H、O、S、N和P组成的组的一个或多个取代的烷基链。在优选实施方案中，所述连接体由无支链的烷基链组成，其中所述链的一端连接至疏水性分子，而所述链的另一端连接至主链单体单元，并且其中每个C被2个H取代。更优选地，所述无支链烷基链是1至5个原子长，如1至4个原子长，如1至3个原子长，如2至3个原子长。在另一个实施方案中，所述连接体由1至6个C原子和0至3个下列每种原子0、S、N组成。更优选地，所迷连接体由1至6个C原子和0至1个下列每种原子0、S、N组成。在优选实施方案中，所述连接体由C、0、S和N原子的链(任选地已取代)组成。优选地，所述链应由最多3个原子组成，因此包含0至3个独立选自C、0、S、N的原子(任选地已取代)。在优选实施方案中，所述连接体由C、N、S和O原子的链组成，其中所述链的一端连接至嵌入剂，而所述链的另一端连接至主链单体单元。优选地，此链包含下文所示的连接体之一，最优选地，所述连接体由下文所示的分子之一组成yCH2广CH2尸2/~CH2CH2H2C—CH2H2CJ0~/0~CH2H2C-dH2C—OininivvvivnoCHO>~~O^#=/PH2p~CH2OH2C~^HC=CH0~/OC三CvmixxxixnxmxivxvxviCHCH2广CH2jS—CH2O厂OS—CH2HaC—《H2C~SSH2C—S<O-^S~^S~^xviixvmxixxxxxixxnxxmxxiv广NHCH2,0~CH2严/~CH2HN_/s_/HNNH—CK2H2ONHH2C-NHxxvxxvixxvnxxvraxxx1尸NyHN-CH2戶/~0"-CH2严2,0~012xxxuxxxinxxxrvxxxvxxxvixxxvnxxxvm,CH2//~CH2//"0广NMe，N-CH2,O《eH2C-MMeMeN~^MeN~^O~^MeNJHNNH—CH2H2ONMeH2C-MMeXXXKXLXLIXUIXLDIXLIVXLVXLVIMeN-CH2,CH2,0~CH2「CH2^^^CKt广CHXLvnxLvraxlixlliun在优选实施方案中，所述链包含下文所示的连接体之一，更优选地，所述连4妻体由下文所示的分子之一组成CH2严2/~CH2H2C—CH2H2C~^/H2C—OH2C—O11迈vivnH2CJH2C~/H2CHC:IXLLIUI在更优选的实施方案中，所述链包含下文所示的连接体之一，更优选地，所述连4妻体由下文所示的分子之一组成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage81</formula>连"l妻体构成如上所述的疏水性核芬酸X-Y-Q式中的Y,因此X和Q不是所述连接体的组成部分。在本发明的一个实施方案中，所述连接体可以是WO03/052132在"Linker"(连接体)一节(第54页，第15行至第58页第7行)中描述的任何连接体。标i己物在本文中，术语"标记物"因此指其自身或作为;t会测系列的一部分可检测的基团。报告基团的功能部分的实例有生物素、地高辛、荧光基团(能够吸收某些波长的电磁辐射，例如光或X省线，然后将吸收的能量以更长波长的射线重新发射的基团；说明性实例为丹磺酰基(5-二甲基氨基)-l-萘磺酰)、DOXYL(N-氧基-4,4-二甲基噁唑烷)、PROXYL(N-氧基-2,2,5,5-四曱基吡咯烷)、TEMPO(N-氧基-2,2,6,6-四-曱基哌啶)、二硝基苯基、吖啶、香豆素、Cy3和Cy5(BiologicalDetectionSystems,Inc.的商标)、藻红(erytrosine)、香豆酸、伞形酮、TexasRed、罗丹明、四甲基罗丹明、Rox、7-硝基苯并-2-噁-l-二唑(NBD)、芘、荧光素、"量子点"、铕、钌、钐和其它稀土金属、放射性标记物、化学发光标记物(可通过在化学反应过程中发光进行检测的标记物)、自旋标记物(自由基(例如取代的有机硝基氧)或可通过使用电子自旋共振谱学进行检测的与生物分子结合的其它顺磁探针(例如Cu2+、Mg2+))、酶(如过氧化物酶、碱性磷酸酶、p-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶(glycoseoxidases))、抗原、抗体、半抗原(能够与抗体结合，但是自身不能启动免疫响应的类型，如肽类和类固醇激素)、穿透细胞膜的载体系统如脂肪酸残基、胆固醇的类固醇部分、维生素A、维生素D、维生素E、叶酸、特异性受体的肽，介导胞吞(endocytose)的基团、表皮生长因子(EGF)、緩激肽和血小板源生长因子(PDGF)。人们特别感兴趣的实例是生物素、荧光素、TexasRed、罗丹明、二硝基苯、地高辛、钌、铕、Cy5、Cy3等。信号对本发明的信号对定义为组合在一起能够产生依赖于物理距离、取向和/或彼此间的相互作用的可测量的变化的两个部分。优选地，信号对由组合在一起能够产生可检测的信号的两部分系统组成，其中所述可检测信号的变化依赖于所述对的所述部分之间的物理距离。依据本发明所述，所述信号对的部分和寡核苷酸类似物的疏水性核苷酸并不相同。因此，优选地，当插入本发明所述寡核苷酸类似物时，所述信号对的部分也不构成与所述疏水性核苷酸相同的结构的部分。在本发明优选的实施方案中，所述信号对的至少一个部分，更优选地所述信号对的两个部分都不和国际专利申请WO03/052132中实施例24(第199页)描述的嵌入假核苷酸Y或实施例14(第184页)描述的嵌入假核苷酸Y相同。同样优选地，当插入寡核香酸类似物时，所述信号对的部分不构成与国际专利申请WO03/052132中实施例24(第199页)描述的嵌入假核苷酸Y或实施例14(第184页)描述的嵌入^f叚核苷酸Y相同的结构的组成部分。产生的信号可以是任何性质，例如所述信号可以是系统荧光或电阻的变化。在优选实施方案中，所述信号对能够根据所述对的部分之间的距离产生荧光变化。本发明信号对将根据所述信号对连接的探针与乾序列杂交与否产生信号变化。因此优选地，所述信号对在寡核苷酸类似物中的位置应能使所述信号对的所述部分之间的距离随着所述寡核苦酸类似物与靶序列的杂交而增加。优选地，本发明所述信号对由位于本发明所述寡核苷酸类似物相反的两端的两个部分组成。更优选地，在本发明实施方案中，所述信号对的至少一个部分位于本发明所述寡核苷酸类似物的一端，而另一部分位于所述寡核普酸类似物的另一半。更优选地，本发明信号对的两个部分位于或靠近本发明所述寡核苷酸类似物相反的两端。优选地，所述信号对的一个部分位于5'端6,如5，例如4,如3,例如2,如1个核苷酸或核苷酸类似物以内。在优选实施方案中，所述信号对的部分作为悬挂端被置于5'端。更优选地，所述信号对的部分位于寡核苷酸类似物的5'端的二分之一内。更优选地，所述信号对的部分位于寡核苷酸类似物的5'端的三分之一内。更优选地，所述信号对的部分位于寡核苷酸类似物的5'端的四分之一内。因此，优选的距5'端的最大距离可依赖于寡核苷酸类似物的长度。优选地，所述信号对的另一部分位于3'端6，如5、例如4、如3,例如2，如1个核苷酸或核苷酸类似物以内。在优选实施方案中，所述信号对的部分作为悬挂端被置于3'端。更优选地，所述信号对的部分位于寡核苷酸类似物的3'端的二分之一内。更优选地，所述信号对的部分位于寡核苷酸类似物的3'端的三分之一内。更优选地，所述信号对的部分位于寡核苷酸类似物的3'端的四分之一内。因此，优选的距3'端的最大距离可依赖于寡核苷酸类似物的长度。优选地，所述信号对的两个部分均位于上文所示位置。优选使用光谱属性(如荧光)来检测杂交，例如当执行例如定量PCR方法的实时检测时。因此，优选地，所述信号对能够根据所述对的部分之间的距离产生光谘属性，如荧光属性的变化。荧光基团可以是任何能够发荧光的基团，例如(但不限于)，所述焚光基团可选自由以下组成的组荧光素、FITC、罗丹明、丽丝胺罗丹明、罗丹明123、香豆素、CY-2、CY國3、CY3.5、CY-5、CY5.5、FAM、VIC、LIZ、NED、PET、Alexa染料、GFP、YFP、BFP、YO-YO、HEX、JOE、NanoOrange、尼罗红、OliGreen、OregonGreen、Picogreen、RadiantRed、RiboGreen、ROX、R國藻红蛋白、SYPRO橙、SYPRO红、SYPRORuby、TAMRA、TexasRed、XRITC、碘化吡啶、吖咬橙、溴化乙锭、SYBRGold、SYBRGreenI和SYBRGreenII。在本发明优选实施方案中，所述信号对由两个共价连接至包含另外的至少一个疏水性分子寡核苷酸类似物的部分组成，其中所述信号对能够形成分子内受激子和/或分子内激发复合体和/或分子内FRET复合体和/或分子内电荷迁移复合体。特别地，当它们靠近时，它们能够形成分子内受激子和/或分子内激发复合体和/或分子内FRET复合体和/或分子内电荷迁移复合体。当信号对的部分相距最多100A，优选地最多75A、更优选地最多50A，甚至更优选地最多20A，例如最多10A时，即认为它们是靠近的。不受任何特异性理论的束縛，预期寡核苷酸类似物的构象是动态的，因此上述距离可视为平均值。本文提到的其它距离也涉及相似考虑。仅当两个分子的位置彼此相关，以便它们能够彼此相互作用时，分子部分才能形成受激子、激发复合体、FRET复合体或电荷迁移复合体。因此，如果有分子部分隔开两个部分，则信号对将不能形成分子内受激子、分子内激发复合体、FRET复合体或电荷迁移复合体。此外，可包含至少一个猝灭剂分子的寡核苷酸类似物也包含在本发明内。本发明所述猝灭剂分子是能够在荧光基团附近猝灭荧光的任何分子。猝灭剂可通过从荧光基团吸收能量并将该能量耗散为例如热量来行使功能。因此，所述荧光基团的信号将减弱或消失。因此，如果将荧光基团和合适的猝灭剂分子置于彼此靠近的位置，荧光基团的荧光将被猝灭。当猝灭剂和焚光基团相距最多IOOA，优选地最多75A，更优选地最多50A，甚至更优选地最多20A，例如最多10A时，即认为它们是靠近的。在本发明中，术语FRET还涵盖由荧光团和猝灭剂组成的对。因此，在本发明中，术语FRET涵盖两类信号对荧光团-猝灭剂对(其中能量从荧光团迁移至猝灭剂并以非可见的能量(像热和/或振动能)发射)和经典的FRET对(其中一部分的能量迁移至另一部分，并以光(其能量低于从一部分迁移至另一部分的能量，更长的波长)的形式发射)。猝灭剂分子的实例包括但不限于，DABCYL、DABSYLTAMRA、甲基红、BlackHolequencher-1、BlackHolequencher-2、ElleQuencher和QSY-7。但是所述猝灭剂分子一般必须根据荧光基团进行选择。除了信号对之外，本发明所述寡核苷酸类似物可在一个实施方案中包含一个或多个直接或间接可检测的标记物。虽然优选地信号对的一个部分仅包含一个部分(moiety)，但是信号对的一个部分也可由多于一个部分(moiety)组成。例如，荧光-猝灭剂信号对可由三个部分组成，其中两个部分彼此相关，以便所述部分组合在一起构成所述信号对的一个部分，而第三个部分构成另一部分。例如，荧光团部分可由US2000/6037130中描述的较短波长的收获体和较长波长的发射体构成，另一个实例是可通过WO2005/019812中描述的表面增强拉曼光i脊(SERS)检测的标记物对，其中所述猝灭剂部分是表面寻求基团和固体表面的复合体，但是也可使用其它组合。信号对的部分一般共价连接至寡核苷酸类似物。信号对的部分可单独共价连接至主链单体单元、核苷酸和/或核苷酸类似物的任何部分(例如，包括主链单体单元或核碱基)。优选地，信号对的部分单独共价连接至核苷酸或核苷酸类似物，例如至核苷酸。因此，信号对的部分可单独连接至主链单体单元的核糖部分、至主链单体单元的磷酸或至核碱基。信号对的部分可在化学或酶学合成寡核苷酸类似物之前、在合成过程中或在合成之后掺入所述核普酸和/或核苷酸类似物。也可使用任何合适的连"l妄体，如上文所述的任何连接体偶联它们。依据本发明，信号对的部分优选共价插入寡核苷酸类似物。有合适的方法供技术人员使用。荧光受激子、激发复合体、FRET和电荷迁移受激子是在电子激发状态下结合而在基态下分离的化合物的二聚体。当单独的化合物被激发时，它可以释放其激发状态，或可与同一类型的另一化合物(未被激发)结合，从而形成受激子。受激子发射的荧光的波长不同于单体荧光发射。当受激子释放其激发状态时，结合将不再有利，两个物质(species)将分离。激发复合体是受激子样的二聚体，其中所述两种化合物不同。分子内受激子是通过包含在一个分子内的两个部分，例如同一分子内85的2个聚芳基形成的。相似地，分子内激发复合体是通过包含在一个分子内的两个部分，例如通过2个不同的聚芳基形成的。荧光共振能量转移(FRET)是两个电子激发状态的染料分子间的距离依赖性相互作用，其中激发从供体分子迁移至受体分子而不发射光子。FRET依赖于分子间距离的6次方根，使其可以在与生物大分子的直径相当的距离应用。优选地，供体和受体必须靠近(通常介于10至100A，如介于10至75A,例如介于10至50A，如介于10至20A)，才能发生FRET。此外，受体的吸收光谱必须与供体的荧光发射光镨重叠。进一步优选地，供体和受体跃迁偶极矩取向必须大致平行。在本发明所述的一些方法中，FRET对用于第一个染料发射的荧光被第二个染料吸收，而仅在红外区发射的情况。这称为荧光团和猝灭剂对。非FRET荧光团-猝灭剂对也已有介绍(US2000/6150097)，涵盖不具有显著大的光镨重叠来解释该猝灭剂猝灭程度的猝灭剂对荧光团的猝灭。此非FRET猝灭机制和对也包括在本发明中。电荷迁移复合体是两个分子间或分子内部分(称为电子供体和电子受体)之间的电荷迁移包括微弱的协同作用的化学复合体。此两个部分可在跃迁过程中表现出可观测的电荷迁移吸收带。实例是苯酚合苯醌，其中笨酚和苯醌分子不是通过正式的化学键维持在一起，而是通过所迷化合物的芳环系统之间的电荷迁移结合在一起。FRET荧光共振能量转移(FRET)已成为分析核酸的最常用的工具之一。这是因为FRET有助于高通量自动化并且非常敏感，使其成为序列和单核苷酸多态性(SNP)分析的选择方法。此外，它对于探测DNA和RNA结构、动力学和分子间相互作用也非常有用。FRET是两个电子激发状态的染料分子间的距离依赖性相互作用，其中激发从一个部分(供体分子)迁移至另一部分(受体分子)而不发射光子。FRET的效率依赖于所述分子间间距的逆六次方根，使得供体分子和受体分子间的距离非常重要。因此，FRET是研究一系列产生分子间距变化的生物现象的重要技术。能量迁移的效率还依赖于供体和受体分子取向、供体荧光的量子产率、受体的消光系数和供体发射与受体吸收之间的光镨重叠。优选地，本发明所述荧光团-猝灭剂信号对包括但不限于荧光基团幹灭剂FAMTAMRATETTAMRA罗丹明TAMRA香豆素DABCYLEDANSDABCYL荧光素DABCYLLuciferYellowDABCYLEosinDABCYLTAMRADABCYLCy3Blackberryquencher650TAMRABlackberryquencher650TexasRedBlackberryquencher650Cy5Blackberryquencher650Cy5.5Blackberryquencher650ROXBlackberryquencher650AlexaFluor350QSY35AlexaFluor488QSY35AlexaFluor546(JSY35AlexaFluor350DabcylAlexaFluor488DabcylAlexaFluor546DabcylAlexaFluor546QSY7和QSY9AlexaFluor488QSY7和QSY9AlexaFluor555QSY7和QSY9AlexaFluor568QSY21AlexaFluor594QSY21AlexaFluor647QSY21AlexaFluor350BHQ-0PacificBlueBHQ-0MarinaBlueBHQ-0吖啶BHQ-0EdansBH(H香豆素BHQ陽lCy2BHQ陽l丹碌酰BHQ-1Alexa488BHQ-1FAMBHQ-1OregonGreenBHQ-1罗丹明纟录-XBHQ-1TETBHQ-1Alexa532BHQ-1VICBHQ-1HEXBHQ-1CALflourOrange560BHQ-1Alexa546BHQ-2TAMRABHQ-2罗丹明红-XBHQ-2CALflourRed590BHQ-2Cy3.5BHQ-2ROXBHQ-2Akxa568BHQ-2CALflourRed610BHQ-288Alexa594BHQ-2CALflourRed635BHQ-2Pulsar650BHQ-2Alexa647BHQ-2Quasar670BHQ-2Cy5BHQ-3Cy5.5BHQ-3优选地，本发明所述经典FRET信号对包括Y旦不限于:供体受体荧光素四曱基罗丹明IAEDANS荧光素EDANSDABCYL荧光素荧光素BODIPYFLBODIPYFL荧光素QSY7染料荧光素QSY9染料AlexaFluor350AlexaFluor488AlexaFluor488AlexaFluor546AlexaFluor488AlexaFluor555AlexaFluor488AlexaFluor568AlexaFluor488AlexaFluor594AlexaFluor488AlexaFluor647AlexaFluor546AlexaFluor568AlexaFluor546AlexaFluor594AlexaFluor546AlexaFluor647AlexaFluor555AlexaFluor594AlexaFluor555AlexaFluor647AlexaFluor568AlexaFluor647AlexaFluor594AlexaFluor647"BlackHoleQuencher"、"BHQ"、"Pulsar"、"Quasar"、"CALflourOrange"和"CALflourRed"是BiosearchTechnologies,Inc.的商标，OregonGreen是MolecularProbes,Inc.6々商才示，"BlackBerry"是Berry&Associates，Inc.的商标，"Cy2"、"Cy3.5"、"Cy5"和"Cy5.5"是AmershamBiosciencesLimited的商标。"TexasRed"是MolecularProbes的注册商标。"ROX"和"TAMRA"是AppliedBiosystems,Inc.的商标。特别地，本发明所述寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物可包含FRET对。供体基团可作为悬挂端被置于5'端、3'端或两端。同样优选地，至少一个受体分子连接为悬挂端。受体分子可作为悬挂端被置于5'端、3'端或两端。优选地，供体基团或受体基团作为悬挂端被置于寡核苷酸类似物的5'端。此外，如果供体基团作为悬挂端被置于5'端，优选地，受体基团位于内部或3'端。反之亦然，如果受体分子作为悬桂端被置于寡核苷酸类似物的5'端，则供体分子位于内部或3'端。因此，供体基团和受体分子的位置彼此相关(彼此相互作用)，以便当分开两个部分的序列未杂交时，受体分子能够接受儉本基团的激发或部分激发，但是当分开两个部分的序列与靶核酸杂交时，则不能接受供体基团的激发。本发明优选的实施方案提供包含信号对和至少一个疏水性分子的探针，其中所述疏水性分子有助于改进所述探针的信噪比(与相应不包含所述疏水性分子的探针相比)。因此，本发明优选的实施方案提供包含信号对和至少一个疏水性分子(如疏水性核普酸)的寡核普酸类似物(无茎信标)，其中所述无茎信标将进行自体杂交(至少部分是由于疏水性相互作用)，除非在杂交条件下接触完全互补靶。本发明更优选的实施方案提供包含荧光团、相应的醉灭剂和至少一个疏水性分子(如疏水性核香酸)的寡核苷酸类似物(无茎信标)，当探针未结合时，与相应不包含所述疏水性分子的探针的背景信号相比，所述疏水性分子有助于所述猝灭剂分子更好地猝灭所述荧光基团(更低的背景)。本发明最优选的实施方案提供包含荧光团、相应的猝灭剂和至少两个疏水性分子(如疏水性核普酸)的寡核苷酸类似物，当探针未结合时，与相应不包含所述疏水性分子的探针的背景信号相比，所述疏水性分子有助于所述猝灭剂分子更好地猝灭所述焚光基团(更低的背景)。例如，上述属性可通过选择合适的疏水性核香酸位置实现(更多详情请参见下文)。因此，本发明优选的实施方案提供包含至少两个疏水性分子(如疏水性核苷酸)和信号对的寡核苷酸类似物，其中所述信号对的光谦属性根据与乾核酸的杂交或因为把核酸的扩增而变化。在优选实施方案中，当没有或有少量乾核酸时，光谱信号低，当存在较大量的乾核酸时，信号高。当用于乾序列的扩增反应过程(例如通过PCR)时，优选地，光谱信号随所述乾核酸序列的增加而增加。因此，优选提供包含被第三序列隔开的第一序列和第二序列的寡核苷酸类似物，依据本发明，其中第一序列和第三序列各包含至少一个疏水性分子(如疏水性核苷酸)，其中所述第一序列与第二序列自体杂交时，光i^f言号低，当它们未杂交时高。下列情形也包含在本发明内所述第一序列可包含例如FRET、受激子或激发复合体等供体，而所述第二序列可包含例如FRET、受激子或激发复合体等受体，或反之亦然。优选所述供体和所述受体的位置为当所述第一序列与所述第二序列自体杂交时，可发生FRET，因此，仅当所述第一序列与所述第二序列杂交时才可^r测FRET荧光。此外，构成双链核酸和/或核酸类似物(例如DNA)的核苷酸或核苷酸类似物延伸产物的杂交或形成也可使用与所述寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物不直接相关的标记物和任选地启动所述延伸使用的寡核苷酸进行检测。在一个实施方案中，此标记物可选自但不限于由以下组成的组碘化吡啶、吖咬橙、溴化乙锭、LCGreen、SYBRGold、SYBRGreenI和SYBRGreenII。荧光基团的荧光属性可根据緩冲液条件和物理因素进行调节。例91如，温度、离子强度和pH参数可影响获得的特定荧光团的荧光信号强度。已知也影响芘受激子的荧光的具有不同化学基团的物质的实例是亲脂表面活性剂分子，参见第5,466,578号美国专利。这些作者教导，包含连接^灰链的季铵盐的阳离子表面活性剂亚群，像例如十六烷基三曱基溴化铵可以用于显著增加使用芘受激子标记的寡核苷酸端的信号。由于表面活性剂对特别是芘的二聚体(或更高阶)复合体的荧光强度的正效应可能是因为表面活性剂分子从所述二聚体置换了水分子，导致猝灭荧光，其它亲脂分子对荧光强度可具有相似的效应。标准分析緩冲液中经常使用亲脂基团和可以从嵌入剂二聚体置换水的其它分子。已显示影响荧光强度的此类分子的实例有TritonX-IOO、十二烷基硫酸钠、甘油和DMSO。信噪比本发明所述信噪比定义为所有或几乎所有本发明所述的寡核苷酸类似物都与同源互补靶核酸杂交时的信号强度(正信号)除以等量的所述寡核苷酸类似物未杂交时的信号强度(与完全互补靶核酸，背景信号)。信噪比=与同源互补靶序列结合时的信号未结合(与同源互补耙序列)时的信号信噪比=正信号/背景信号因此，背景信号是例如当不存在乾核酸时，当本发明所述包含至少一个疏水性分子和信号对的核苷酸类似物自体杂交时，或当两个本发明所述核苷酸类似物互相杂交但是未与其乾核酸杂交时。一些信号对在它们强烈相互作用(在未结合探针中)时具有低信号，在它们未强烈相互作用(在杂交探针中)时具有高信号，而其它信号对在所迷信号对的两个部分强烈相互作用时具有高信号，在未强烈相互作用时具有低信号。因此，很显然，取决于探针中使用的信号，正信号可显著高于或低于背景信号。因为信噪比为1表示无论探针杂交与否，信号都是相同的，优选地，信噪比应尽可能远离1。"信噪比显著高于或显著低于相应的不包含至少一个疏水性基团的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的信噪比"意指，如果相应的不包含所述至少一个疏水性基团的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的信噪比高于1，则包含信号对和至少一个本发明所述疏水性分子的寡核香酸类似物具有更高的信噪比，如果相应的不包含至少一个疏水性基团的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的信噪比低于1,则包含信号对和至少一个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸类似物具有更低的信噪比。更高或更低的信噪比也可描述为"信噪比距值1更远"或"与值1的差别更大"或"得到改进"。如果当寡核苷酸类似物(例如无茎信标)未与靶序列结合时，信号对的两个部分彼此猝灭(例如，如果信号对由荧光团和猝灭剂组成)，则本发明所述无茎信标的信噪比应高于相应的不包含至少一个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸类似物。如果无茎信标未与乾序列结合时信号对两个部分的信号增强(例如，如果所述信号对由两个荧光团的经典FRET对组成)，则本发明所述无茎信标的信噪比应低于相应的不包含至少一个疏水性分子的寡核普酸或寡核苷酸类似物。因此，本发明优选的实施方案提供包含信号对和至少一个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸类似物，其信噪比显著比相应的不包含所述至少一个疏水性基团的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的信噪比更远离值1。本发明更加优选的实施方案提供包含信号对和至少两个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸类似物，其信噪比显著比相应的不包含所述至少两个疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的信噪比更远离值1。在一个实施方案中，信噪比是通过确定将本发明所述寡核苷酸类似物与耙核酸在低温和高温下孵育后的信号，然后将低温下获得的信号除以在高温下获得的信号而确定的。所述低温应低于寡核香酸类似物和其靶序列的杂种的熔解温度，例如在15。C至8(TC范围内，如在15。C至50。C范围内，例如在5(TC至8(TC范围内，例如在25。C至70。C范围内，优选在15至40。C范围内，如在25至35。C范围内。所述高温应高于寡核香酸类似物和其乾序列的杂种的熔解温度，例如在50。C至95。C范围内，如在60。C至95。C范围内，例如在65。C至90。C范围内。93当使用此方式确定信噪比并且信号高于背景信号时，则信噪比优选为至少4.5、如至少5.0、例如至少5.5、如至少5.8。在优选实施方案中，信噪比按下文实施例2或实施例10中描述的方法确定。在信号低于背景信号的实施方案中，信噪比例如低于0.75，如低于0.5，例如4氐于0.25。固体支持物优选实施方案将本发明所述无茎信标偶联至固体支持物，或可选地，使用所述无茎信标检测偶联至固体支持物的核酸或核酸类似物。然后即可通过将所述固体支持物从所述混合物中分离或通过洗去未结合的材料，将与核酸或核酸类似物杂交的所述无茎信标从所述混合物中分离。取决于所需的结果，有许多不同类型的固体支持物适合用于所述方法。在一个实施方案中，固体支持物是活化的表面。活化的表面有助于寡核苷酸或寡核苷酸类似物与固体支持物的偶联。例如，固体支持物可选自由磁珠、铝珠、琼脂糖珠、琼脂糖凝胶珠(sepharosebeads)、3皮璃、塑并+表面、重金属和芯片表面(chipsurfaces)组成的组。磁珠包括包含允许使用磁铁从悬浮液中分离所述珠的磁性物质的珠。铝珠包括允许识别所述珠的标条形码的珠。但是本发明也可使用其它标码和未标码的珠。琼脂糖珠和琼脂糖凝胶珠可例如通过离心或过滤从悬浮液中分离。塑料表面包括例如微滴定板或可适合用于例如诊断的其它塑料设备。芯片表面可由任何合适的材料制成，例如玻璃、树脂、金属、覆有聚合物涂层的玻璃、覆有金属涂层的玻璃和覆有金属涂层的树脂。还可以应用SPR(表面等离子体共振)传感器板，参见第11-332595号日本专利临时公布。也可应用CCD,参见JVMdez'cA^fe1994，第22巻，第9411期，2124-2125。芯片表面包括玻璃板上的纤维素和小聚丙烯酰胺凝胶，寡核苷酸或寡核苷酸类似物可通过聚丙烯酰胺和寡核苷酸之间的共价或非共价键固定至该表面(Yershov，G.等(1996)Prac.A^/.爿cad0&4，94:4913)。芯片表面还可以是如Sosnowski，R.G.等(1997)Proc.XcaJ.WSL4，94:1119-1123所述的硅芯片。此类芯片通过包含如下步骤的程序制备将微电极阵列置于硅芯片上，在所迷微电极上形成包含链霉亲和素的琼脂糖层，和通过使琼脂糖层带正电将生物素修饰的DNA片段连接至所述琼脂糖层。此夕卜，芯片表面的制备可参见Schena，M.等(1996)Prac.A^/.乂cadt/&4，93:10614-10619，其中方法包含如下步骤用SSC(即标准氯化钠-柠檬酸緩沖溶液)制备氨基修饰的PCR产物的悬浮液，将所述悬浮液点样至载玻片，孵育点样后的栽玻片，使用硼氩化钠处理孵育后的载玻片，然后加热处理后的载玻片。此外，也可使用含有固体材料的柱子。包含疏水性分子或疏水性核香酸的核苦酸任何部分和/或偶联至其自身的主链单体单元。疏水性分子可在化学或酶学合成探针之前、在合成过程中或在合成之后掺入所述核苷酸和/或核苷酸类似物和/或主链单体单元。所述疏水性分子可以直接偶联至核香酸和/或核苷酸类似物和/或主链单体单元或通过使用任何合适的连接体。但是，如上文所述，优选地，所述疏水性分子连接至主链单体单元，任选地通过连接体，其中所述主链单体单元和所述连接体均不包含核碱基。本发明的一个方面提供包含至少一个疏水性核普酸类似物的寡核香酸类似物，其中所述疏水性核苷酸类似物具有通用结构X-Y-Q其中X是核苷酸或核苷酸类似物或能够掺入核酸或核酸类似物主链的主链单体单元，Q是本发明所述疏水性分子；和Y是连接所述核苷酸或核苦酸类似物或主链单体单元和所述疏水性分子的连接体部分。术语"掺入核酸或核酸类似物的主链"意指所述疏水性核苷酸可插入核酸和/或核酸类似物的序列。本发明更优选的方面，所述包含至少一个疏水性核苷酸类似物的寡核苦酸类似物能够通过化学方法合成。更优选地，所述包含至少一个疏水性核苷酸类似物的寡核苷酸类似物能够通过使用本领域技术人员已知的化学反应在白动化DNA合成仪上合成。本发明的许多实施方案优选提供包含至少两个疏水性核苷酸类似物的寡核苷酸类似物，其中所述疏水性核苷酸类似物具有通用结构X-Y-Q其中X是核苷酸或核苷酸类似物或能够掺入核酸或核酸类似物主链的主链单体单元，Q是本发明所述疏水性分子；和Y是连"J妻所述核苷酸或核普酸类似物或主链单体单元和所述疏水性分子的连接体部分。在本发明优选的实施方案中，本发明所述寡核普酸类似物(如无茎信标)中的插入疏水性核苷酸不显著降低与乾核酸的结合。许多此类修饰对本领域技术人员为已知。甚至更优选地，本发明疏水性核苷酸类似物由下列核苷酸构件(build)之一组成核脊酸的核糖环2'位置的修饰，如上文所述，已被显示增加了对靶核酸的亲合性(Yamana等(1991)T^ra/z^ra"/e".6347-6350)和/或连接至其自身的主链单体单元的嵌入剂(Chris-tensen等96&wwc/eZcoc她23:207-225》在优选实施方案中，主链单体单元X能够形成与寡核苷酸或寡核苷酸类似物结合的磷酸二酯或磷酸二酯类似物。在本发明的一个实施方案中，所述疏水性核苷酸可例如是国际专利申请WO03/052132在第64至115页中描述的结构1至347的任何嵌入剂假核苷酸。取决于疏水性核苷酸的性质，有不同的生产方法可供技术人员使用。例如，疏水性核普酸可按与制备国际专利申请WO03/052132在"Preparationofintercalatorpseudonucleotides"(制备嵌入剂*￡核苷酸)一节(第115页，第14行至第121页，第30行)中描述的嵌入剂假核苷酸相似的方式制备。对于所述疏水性分子不是嵌入剂的情形，技术人员将能够对所述方案进行适当的修正。包含疏水性基团的寡核普酸类似物本发明的目标是提供包含至少一个疏水性分子和信号对的寡核苷酸类似物，其中当所述寡核苷酸类似物由未与乾核酸杂交变为与乾核酸杂交或相反时，所述寡核苷酸类似物的信号的变化显著高于相应的不包含所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸类似物(由与所述寡核苷酸类似物相同的核苷酸序列组成)和所述耙核酸之间的杂种(相应的杂种)的信号的变化。在优选实施方案中，本发明寡核苷酸类似物包含n个核苷酸和/或核苷酸类似物，其中n是至少为4的整数。优选地，n至少为5，更优选地至少为6,甚至更优选地至少为7。例如n可以是4至100范围内，如5至90范围内，例如7至100范围内，如7至80范围内，例如7至60范围内，如7至40范围内，例如7至30范围内，如7至20范围内，例如15至50范围内的整数。在一个实施方案中，寡核苷酸类似物可包含l至IOO个核碱基或核威基类似物，如5至40个核威基或核威基类似物，例如5至30个核碱基或核碱基类似物，如5至25个核威基或核碱基类似物，例如5至20个核碱基或核碱基类似物。更优选地，本发明寡核苷酸类似物包含例如6至25个核碱基或核碱基类似物以及至少一个疏水性分子和信号对。97在更优选的实施方案中，本发明寡核苷酸类似物包含例如6至25个核碱基或核威基类似物以及2至6个疏水性分子和信号对。疏水性分子可置于给定寡核苷酸或寡核普酸类似物内任何需要的位置。例如，疏水性分子可置于寡核苷酸类似物的末端或疏水性分子可置于寡核苷酸类似物的内部位置。优选地，所述疏水性核香酸位于距一端最多9,如最多8，例如最多7,如最多6个核苷酸和/或核苷酸类似物的位置。优选地，信号对的任一部分分别比疏水性核苷酸更靠近5'端和3'端。因此，疏水性核普酸优选比信号对的任一部分具有更中央的位置。优选地，信号对的任何部分相对任何疏水性核苷酸放置，其放置方式使得至少1,例如2,如3，例如4，如5,例如大于5，如1至10，优选地1至8，如1至6，例如2至6个核苷紛核苷酸类似物将信号对的任何部分和任何疏水性核苷酸隔开。在优选实施方案(embodent)中，所迷寡核苷酸类似物包含1至5，如5至IO,如10至15，例如15至20个疏水性核苷酸。非常优选地，所述寡核芬酸类似物包含至少2,例如2至5个疏水性核香酸。寡核苷酸类似物的疏水性分子可相对彼此置于任何位置。例如它们可彼此临近，或它们之间可有1，如2,例如3,如4,例如5，如大于5个核苷酸分开所述疏水性分子。但是优选地，所有疏水性核苷酸被至少1个不是疏水性核苷酸的核普酸或核苷酸类似物分开。在所述寡核苷酸类似物包含至少2个疏水性核苷酸的实施方案中，优选它们位于所述寡核苷酸类似物相反的两半侧。因此优选一个疏水性核苷酸位于所述寡核苷酸类似物的5'端半侧内，而另一疏水性核苦酸位于所迷寡核苷酸类似物的3'端半侧内。优选地，至少两个，优选所有疏水性核苷酸位于if巨一端最多9,如最多8，例如最多7，如最多6个核苷酸和/或核苷酸类似物的位置。更优选地，至少两个疏水性核苷酸位于相反的两半侧，并且距各自最近的端最多9，如最多8，例如最多7，如最多6个核普酸和/或核苷酸类似物内。因此，优选的距端最远的距离可依赖于寡核苷酸类似物的长度。此外还优选所述信号对的任一部分位于比至少1，更优选地至少2，例如所有疏水性核苷酸更靠近5'端和3'端的位置。因此，至少1,优选地至少2，例如所有疏水性核苷酸优选具有比所述信号对的任一部分更中央的位置。在本发明非常优选的实施方案中，所述寡核苷酸类似物包含至少两个疏水性核苷酸，并且所述至少两个疏水性核苷酸对称地置于所述寡核苷酸类似物内。因此，优选地所述至少两个疏水性核苷酸位于距信号对相应的部分大致相同的距离，更优选地相同的距离。在另一个实施方案中，优选地所述至少两个疏水性核苷酸位于距寡核苷酸类似物中央大致相同的距离，更优选地相同的距离。本文中"大致相同的距离"指距离相同数量的核苷酸和/或核苷酸类似物+/-1个核苷酸或核苷酸类似物。在所述寡核苷酸类似物包含大于3个疏水性核苷酸的实施方案中，优选地，每对疏水性核苷酸位于距信号对的相应部分大致相同的距离，更优选地相同的距离，或距寡核苷酸类似物中央大致相同的距离，更优选地相同的-巨离。当所述寡核苷酸类似物包含大于一个疏水性分子时，在本发明优选的方面，至少一个所述疏水性分子的位置将确保，当所述寡核苷酸类似物由未与乾核酸杂交变为与乾核酸杂交或相反时，所述寡核苷酸类似物的信号变化显著高于相应的不包含所述疏水性分子的杂种的信号变化。更优选地，所述寡核苷酸类似物的两半侧各置有至少一个所述疏水性核苷酸类似物。在一个优选实施方案中，位于具有两部分信号对，3'和5'端分别有一个部分的寡核香酸类似物内的第一个疏水性分子被置于靠近3'-端的位置，而第二个疏水性分子^f皮置于靠近5'-端的位置，即它们可以被置于它们在所述寡核苷酸类似物各自端的任何位置，并且任选地包含一皮置于任何位置的第三个、第四个、第五个或更多疏水性分子。所述疏水性核苷酸类似物可独立位于邻近信号对的部分，例如有一个核香酸，如两个核99苷酸，例如3个核芬酸，如4个核香酸，例如5个核苷酸，如6个核苷酸，例如7个核苷酸，如8个核苷酸，例如9个核苷酸，如10个核苷酸，例如0至10个核香酸分开所迷疏水性核香酸类似物和最近的信号对的部分。更优选地，所有疏水性分子的放置方式使得，当所述寡核苷酸类似物由未与靶核酸杂交变为与靶核酸杂交或相反时，包含所迷疏水性分子的寡核苷酸类似物的信号变化显著高于相应的不包含所述疏水性分子的杂种的信号变化。因此在本发明的一个方面，疏水性分子的位置与其它疏水性分子和包含在相同寡核苷酸类似物内的信号对的部分有关。因此本发明优选的实施方案提供包含两部分信号对(其中每个部分位于所述寡核苦酸类似物的一端)和两个本发明所述疏水性分子(所述寡核普酸类似物的每半側各有一个)的寡核苷酸类似物，其中所述疏水性分子距最近的所述信号对的部分的距离等于或大致等于另一个疏水性分子距所述信号对的另一部分的距离。本发明更加优选的实施方案提供包含两部分信号对(其中每个部分位于所述寡核苷酸类似物的一端)和至少本发明所述两个疏水性分子的寡核苷酸类似物，其中所有疏水性分子的位置彼此相关，以致于当探针未结合时，所有疏水性分子将与至少一个其它疏水性分子发生疏水性相互作用，而此疏水性相互作用将使所迷信号对的两个部分靠近。例如，上述属性可通过按上文所述方式放置疏水性核苷酸实现。在本发明的一些实施方案中，优选地，至少有一个核苷酸或核苷酸类似物将疏水性核普酸类似物与同一寡核苷酸类似物序列中的所有其它疏水性核香酸类似物分开。这是因为这样一个事实，如果在寡核苷酸的小区域内的疏水性分子浓度太高，则倾向于降低与把序列的亲合性。因为一些疏水性分子(尤其是具有接合7T-电子的但是也包括其它的疏水性分子)能够通过类似FRET或非FRET的碰撞机制猝灭焚光团的荧光,所以更优选地，至少有1，例如2，如3个核苷酸或核香酸类似物将所述疏水性核苷酸与所有其它疏水性核普酸分开和与所述信号对的任何部分100分开。这样就最大限度地减少了所述疏水性分子的猝灭和亲合性的降低。寡核苷酸类似物可包含任何类型的核苷酸和/或核苷酸类似物，如上文所述的核苷酸和/或核苷酸类似物。因此，寡核苷酸类似物可包含选自由以下组成的组的一个或多个DNA、RNA、PNA、同源DNA、b-D-吡喃阿卓糖基(Al加pyranosyl)-NA、b-D-吡喃葡萄糖基-NA、b-D-Mopyranusyl-NA、HNA、丽A、ANA、LNA、CNA、CeNA、TNA、(2'-NH)-TNA、(3'-NH)-TNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、卩-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、双环-DNA、6-氨基-双环-DNA、5誦表-双环-DNA、a-双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA、双环[3.2.1]-DNA、双环[4.3.0酰胺-DNA、P-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃来苏糖基-NA、2'-R-RNA、2'-0R-RNA、a-L-RNA、a-D-RNA、卩-D-RNA的亚基和其混合物。因为疏水性分子不易溶解于水，而本发明所述杂交和/或测量将在水溶液中进行，所以可包含在无茎信标中的疏水性分子的数量存在上限。因此本发明优选的实施方案提供易溶解于分析中使用的水相緩冲液的包含至少一个本发明所述疏水性基团的寡核苷酸类似物。本发明更优选的实施方案提供其中本发明所述疏水性核苷酸的数量最多为核碱基数量的50%的寡核苷酸类似物。这意味着，对于所述寡核苷酸类^f以物中存在的每两个核威基，寡核普酸类似物中最多可以有一个本发明所述疏水性核苷酸。本发明更加优选的实施方案提供其中本发明所述疏水性基团的数量最多为所述寡核苷酸类似物核威基数量的例如5%至50%，如5%至45%，例如10%至45%,如12%至45%的寡核苷酸类似物。在水中的溶解度依赖于所述疏水性分子的疏水性。如果所述疏水性分子为芘，优选地，寡核苷酸类似物在每3个核苦^/核普酸类似物中包含最多1个疏水性核苷酸。如果所述疏水性分子的疏水性大于芘(即具有更高的logP值)，优选地，寡核苷酸类似物在每4个核苷酸/核普酸类似物中包含最多1个疏水性核苷酸。如果所述疏水性分子的疏水性小于芘(即具有更低的logP值)，优选地，寡核苷酸类似物在每2个核苷^/核苷酸类似物中包含最多1个疏水性核苷酸。但是在我们引入疏水性分子时，重要的一点是本发明的无茎信标可溶于水溶液，优选主链单体单元在插入所述无茎信标的寡核苷酸类似物后带电荷。因此在更优选的实施方案中，本发明所述寡核芬酸类似物的主链单体单元选自具有带电荷的主链的主链单体单元组，如DNA、RNA、HNA、画A、ANA、LNA、CNA、CeNA、TNA、(2'-NH)-TNA、(3'國NH)-TNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、卩-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、双环-DNA、6-^J^-双环-DNA、5-表-双环-DNA、a-双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA、双环[3.2.1]-DNA、双环[4.3.0]酰胺-DNA、P-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃来苏糖基-NA、2'-R-RNA、a-L-RNA或a-D-RNA、P-D-RNA和其混合物和其杂种，以及其磷原子修饰，尤其是让所述主链带电荷的修饰。本发明无茎信标特别适合在封闭管分析(也叫做同质性分析)中检测、鉴定和定量乾序列。这还包括不对称和竟争性PCR分析、以及包含PCR开放剂、封闭剂的分析和许多其它修饰性PCR分析。此外，由于本文提出的一些无茎信标具有核酸酶抗性，因此它们也特别适合在细胞、组织或生物体(无论存活与否)中检测、鉴定和定量乾序列。在另一个实施方案中，本发明还涉及适合检测、鉴定或定量目标乾序列的包含两个或多个支持物结合的无茎信标的阵列。无茎信标非常方便，因为它们提供了快速询问大量目标样品而无需使用另一检测系统的方法。合成核酸对耙核酸的高亲合性可大大促进检测分析，此外，对耙核酸具有高亲合性的合成核酸可用于许多其它用途，如基因打靶和核酸纯化。已显示包含疏水性基团的寡核苷酸类似物在一些情形下增加对同源互补核酸的亲合性。一些本发明所述寡核苷酸类似物的优点是，由包含至少一个疏水性分子的寡核苷酸类似物和基本互补的DNA组成的杂种(DNA杂种)的熔解温度可以显著高于由所述基本互补的DNA和与其互补的DNA组成的双链体的熔解温度。102因此，本发明所述寡核苷酸类似物可以比天然存在的核酸更高的亲合性与DNA形成杂种。熔解温度优选增加1至30°C，例如5至2CTC,如10"C至15°C，例如2。C至5°C，如5t:至l(TC，如15。C至2(TC,例如20°C至25X:,如25。C至3(TC，例如高于30。C。在本发明另一个实施方案中，包含一个或多个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸类似物可形成三链结构(三链体结构)，该三链结构由所述寡核苷酸类似物通过Hoogstein或反式Hoogstein磁基对与同源互补的核酸或核酸类似物或寡核苷酸或寡核苷酸类似物结合组成。在本发明另一个优选的实施方案中，所迷寡核苷酸类似物可增加所述三链体结构中所述Hoogstein碱基对的熔解温度。在本发明另一个更优选的实施方案中，所述寡核苷酸类似物可增加所述三链体结构中所述Hoogstein碱基对的熔解温度，此增加不依赖于特异性序列约束(restraints)，像富含嘌呤、富含嘧咬的核酸或核酸类似物双链体乾序列的存在。因此，如果所述寡核苷酸或寡核香酸类似物不含疏水性分子，则所述三链体结构中所述Hoogstein碱基对的熔解温度显著高于所述Hooogstein碱基对与所述双链体耙的熔解温度。因此，本发明所述寡核苷酸类似物可以比天然存在的核酸更高的亲合性与同源互补核酸或核酸类似物或寡核苷酸或寡核苦酸类似物形成三链体结构。熔解温度优选增加2至5(TC，如2至40。C,如2至30。C，例如5至2(TC，如1(TC至15。C，例如2。C至5。C，如5。C至1(TC，例如l(TC至15°C，如15。C至20。C，例如20。C至25。C，如25。C至30。C,例如30。C至35X:，如大于35"C。三链体形成可涉及或不涉及链侵入，链侵入是Hoogstein碱基配对的第三条链侵入靶双链体并置换部分或完整的相同链，以与互补链形成沃森-克里克碱基对的过程。这可开发用于多种用途。如果寡核苷酸类似物用于检测多态性位点，优选地，所述多态性位点位于所述寡核苷酸类似物的中央，优选位于所述寡核苷酸类似物最中央的10，如8，例如6，如4个核普酸和/或核苷酸类似物内。多重分析(MultiDlexing)检测、鉴定或定量乾序列时通常最好收到正信号。研究人员通常最爱问"样品中存在哪些基因型？"，而不是仅问"样品中存在基因型A吗？"，因此在实验中包括恰当的对照非常重要。例如，定量反应的对照可以是定量一个或多个管家基因。同样地，突变特异性^^针的对照可以是野生型特异性探针。如果可以在分析中在相同的反应容器中加入对照，则可确保对照和分析的(至少大多数)条件相同，和因此通常比运行平行实验有利。当分析中包括多于一个实验时，即被称为多重分析。探针的特异性也非常依赖于错配的性质。SantaLucia证实稳定性降低顺序存在明确的趋势"G-C">"A-T">"G.G">"G.T"2"G.A">"T.T"^"A.A，，>"T.C"2"A.C"2"C.C"，表明"G，，是最混杂的核减基，因为它形成了最强的威基对和最强的错配(SantaLucia&Hicks(2004)爿""m.iev.万zo//^s.说cww/.33:415-440)。另一方面，"C，，是最有识别力的核碱基，因为它形成了最强的威基对和在"A"之后三个最弱的错配。因此单个核苷酸的特异性顺序如下"C">"A"〉"T">"G"。如上文所述，DNA的曱基化状态在亚硫酸氢盐转化的DNA的一条链上被翻译为"C"/"T"错配，相反地，在PCR扩增转化的DNA之后，在互补链上被翻译为"G"/"A"错配，许多突变也是"C"到"T"的转变。因此，如果一个探针(例如曱基化DNA特异的)在多态性位点包含高选择性的"C"碱基，而另一探针(未甲基化DNA特异的)在多态性位点包含"A"，则这样的组合是最有识别力的。同时这是最有效的，它意味着所述的两个探针将是彼此高度同源的。适当设计的本发明所述寡核苷酸类似物与其完全互补DNA靶的结合要强于与非完全互补探针与另一遗传变异体的结合。包含疏水性分子的寡核香酸类似物对被置于一个探针中，这样如果要杂交的同源互补(但是不完全互补)探针非常适合此应用，它们将靠近另一探针的疏水性分子(参见图5)。因此本发明实施方案提供加至同一分析容器的每个均包含本发明所述至少一个疏水性分子(如疏水性核苷酸)和信号对的至少两个寡核普酸类似物，其中所述至少两个寡核苷酸类似物分别与不同的把序列互补。所104述乾序列可以是把序列和其突变体序列。本发明更加优选的实施方案提供至少两个包含本发明所述至少一个疏水性分子(如疏水性核苷酸)和信号对的寡核香酸类似物，该寡核苷酸类似物能够区分靶核酸或耙核酸类似物和至少一个已知的其突变体序列。所述靶序列和所述已知的突变体序列之间的变异可以是突变、甲基化状态、缺失、插入或相似的小变化。在本发明的一个方面，无茎信标上标记对的信号，如果在相同分析容器中使用，可以彼此区分开来，而在其它实施方案中，其它物理差异(像熔解温度或物理点样)可以用于区分寡核苷酸类似物(如无茎信标)。本发明的另一方面在一个管中使用一组共同的引物组对两个或多个寡核苷酸类似物(如无茎信标)进行多重分析。许多更新的实时PCR仪器上可以进行更高复杂性的多重分析，其中一次最多可以测量5或6个不同的荧光团。本发明所述寡核苷酸类似物(如无茎信标)的多重分析比使用大多数其它技术都更加简单，首先是因为本发明寡核香酸类似物(如无茎信标)由于缺乏"茎"区而比普通的分子信标更短，降低了非特异性杂交的风险，此外是因为在序列内加入疏水性分子会降低序列充当非特异性才莫板而允许乱真引物延伸的风险。因此本发明优选的实施方案还提供至少两个能够区分包含一个多态性位点的序列，均包含本发明所述至少一个疏水性分子(如疏水性核普酸)和信号对的寡核苷酸类似物。其中所述寡核普酸类似物参加扩增反应过程。所述扩增反应优先在"封闭管"中进行。本发明更加优选的实施方案提供能够区分把序列和所述靶序列的单点突变，均包含本发明所述至少一个疏水性分子和信号对的两个寡核苷酸类似物，其中所述寡核苷酸类似物参加扩增反应过程并和所述扩增序列相应的链同源互补。所述扩增反应优先在"封闭管"中进行。如果所述突变是甲基化差异，"C"至"T","T"至"C"，"A"至"G"或"G"至"A"转变，则最优选地，一个无茎信标在所述多态性位点包含高选择性的"C"碱基，而另一探针在所述多态性位点包含"A"。其它方法和分析条件通过杂交确定存在、鉴定和定量本发明所述靶序列和/或突变体序列的存在、鉴定和定量可通过杂交特异性信号的强度或存在与否而确定。可通过本领域公知的任何方法确定杂交程度。如果没有可检测的杂交，则杂交程度即被视为0。本发明所述寡核苷酸类似物包含可用于直接检测杂交的疏水性部分和信号对。可用作检测存在、鉴定和/或定量的探针的寡核苷酸类似物应能够与其靶核酸和/或核酸类似物发生特异性相互作用。区分靶序列和突变体序列时，熔解温度或亲合温度的差异是可以普遍使用的参数。使用此策略时，包含本发明所述至少一个疏水性分子和信号对的寡核普酸类似物提供了有效的区分工具。当所述寡核苷酸类似物中有至少一个核苷酸未杂交时，温度。本发明所述相应的靶核酸和/或核酸类似物或寡核苷酸类似物可通过用于检测杂交的寡核苷酸类似物的存在的多种方法中的任何方法进行标记。是否选择使用具有多于一个信号对的本发明所述寡核苷酸类似物可取决于需要的灵敏度、特异性以及其它因素。标记物选择取决于灵敏度、与探针接合的难易程度、稳定性要求和可用的仪器。可以预见检测探针包含DNA或RNA的情形。取决于选择的标记物，此类探针可以通过各种方式进行标记。放射性探针一般使用含有所需的放射性同位素的可商业途径获得的核苷酸制备。放射性核苦酸可通过多种方法掺入探针，如通过双链探针的切口平移；通过在存在放射性dNTP的条件下使用DNA聚合酶的Klenow片段复制具有特异性插入片段的单链M13质粒；通过在存在》欠射性dNTP的条件下使用逆转录酶从RNA模板转录cDNA;通过在存在放射性NTP的条件下使用SP6或T7RNA聚合酶从含有SP6启动子或T7启动子的载体转录RNA;包括热dNTP(hotdNTP)的普通PCR;使用末端转移酶，以放射性核苷酸对探针3'端进行加尾；或通过使用[32P]-ATP和多核苷酸激酶对探针5'端进行磷酸化。非i文射性探针通常通过间接方法进行标记。探针一般共价结合一个或多个配体分子。然后所述配体与配体抗体分子结合，所述配体抗体分子内在地可检测或共价结合至信号系统，如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化合物。配体和配体抗体可以有很大差别。如果配体具有天然配体抗体，例如生物素、曱状腺素和皮质醇，则其可以与标记的天然存在的配体抗体联合使用。可选地，任何半抗原或抗原化合物均可以和抗体组合使用。如上所述，本发明所述寡核苷酸类似物也直接接合至产生信号的化合物，例如通过与酶或荧光团接合。感兴趣的作为标记物的酶主要是水解酶(特别是磷酸酶、酯酶和糖苦酶)，或氧化还原酶(特别是过氧化物酶)。荧光化合物包括但不限于荧光素和其衍生物、罗丹明和其衍生物、丹磺酰、伞形酮等。化学发光化合物包括萤光素、AMPPD([3-(2'-螺旋金刚烷(spiroamantane))-4-甲氧基-4-(3'-磷酰氧基)-苯基-l,2-二氧杂环丁烷)和2,3_二氢酞溱二酮(dihydrophthalazinedione)，例如鲁米i若。杂交介质或提取溶液中存在的标记探针的量可以有4艮大差别。一般使用比化学计算量的乾核酸大大过量的探针以增强所述探针与靶DNA结合的速率。通过釆用本发明所述寡核苷酸类似物对某些核酸的高亲合性退火属性和/或疏水性相互作用，可不必使用大大过量的探针。通过将反应容器浸入可商业途径获得的超声仪中进行超声处理通常可以加快杂交速率。在本发明的一些实施方案中，未标记的物质或过量的标记物要在执行检测之前除去。除去通常通过将探针或把附着在固体支持物上(如上文所述)执行，然后可以很容易地进行漂洗。根据使用的特定的杂交溶液，在合适的温度下杂交适当的时间后，将连接捕获的探针(本发明所述寡核苷酸类似物):相应的靶DNA杂交复合体的支持物引入漂洗溶液，该溶液通常含有与提供的杂交溶液相似的试剂(例如氯化钠、緩冲液、有^L溶剂和去污剂)。这些试剂的浓度可以与杂交介质的相似，但是当需要更强的漂洗条件时，它们通常具有较低的浓度。支持物在漂洗溶液中保持的时间段可从几秒到几小时或更多不等。杂交或漂洗介质都可以是严格的。经过适当严格性的漂洗之后，即可根据标记物的性质检测正确的杂交复合体。无茎信标直接与标记物接合。例如如果所述标记物发焚光，可以通过首先用特定波长的光照射来^r测结合了杂交复合体底物的无茎信标。样品吸收此光，然后发射不同波长的光，后者被检测器接收(PhysicalBiochemistry(物理生物化学)，Freifelder，D.，W.H.Freeman&Co.(1982),第537-542页)。如果所述标记物具有放射性，样品暴露于X光片或磷成像屏(phosphorimagerscreen)等。如果所述标记物是酶，样品通过与所述酶的适当底物孵育进行检测。产生的信号可以是有色沉淀、有色或荧光可溶物质或生物发光或化学发光产生的光子。当所述标记物是酶时，优选地所述酶能够催化产生有色的沉淀以指示正读数，本发明所述优选酶可选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶和p-半乳糖苷酶。例如，碱性磷酸酶将使磷酸吲哚酚去磷酸化，进而参与还原反应将四唑盐转化为高度有色和不溶的甲(潛)(formazan)。杂交复合体的检测可需要产生信号的复合体与相应的耙和寡核苷酸类似物的杂种结合。通常来讲，此结合通过配体和配体抗体之间，即配体接合的探针和配体抗体接合的信号之间的相互作用发生。所述信号产生复合体的结合也很容易通过暴露于超声能量而加速。标记物还可允许间接检测所述杂交复合体。例如，如果所述标记物是半抗原或抗原，可通过使用抗体检测样品。在这些系统中，向所述抗体连接荧光或酶分子或放射性标记物会产生信号(Tijssen，P."PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays"(酶免疫分析实践和理论)，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology(生物化学和分子生物学实验技术)，Burdon，R.H.，vanKnippenberg，P.H.编，Elsevier(1985),第9-20页。)多种类型的荧光，包括受激子、激发复合体、FRET复合体和电荷迁移复合体，可以用于检测。一些感兴趣的分析是涉及附着到固体支持物的包含疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸类似物探针的杂交和基于荧光的检测分析。在这些情形中，附着的探针与相应的乾核酸或相应的革巴核酸类似物杂交，从而产生信号。然后通过严格的漂洗除去过量或未结合的核酸或核酸类似物链，并检测剩余的标记物。此方法非常适合用于基因分型点突变和表达图谱。通过熔解温度检测和区分耙核酸、乾核酸类似物和突变体序列本发明涉及包含至少一个疏水性分子和信号对的寡核苷酸类似物。在本发明的一个实施方案中，所述寡核苷酸类似物对其鞋i核酸序列的亲合性显著高于对混合物中存在的任何其它核酸序列。在本发明优选的实施方案中，检测程序依赖于温度，包括使用漂洗程序除去对所述寡核苷酸类似物的亲合性低于所述耙核酸或靶核酸类似物的核酸或核酸类似物的分析。在本发明另一个优选的实施方案中，高熔解温度指示所述混合物中存在耙核酸。在更优选的实施方案中，杂交的检测在严格的漂洗程序之后执行，正信号指示所述混合物中存在靶核酸。杂交程度的确定可通过本领域公知的任何方法执行。包含至少一个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸类似物可用于直接检测杂交。在本发明的一个实施方案中，包含本发明所述疏水性分子和信号对的几个不相同的寡核苷酸和/或寡核普酸类似物可用于同时寻找混合物中不同的耙核酸或核酸类似物，因此有助于检测与所述寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物的数目相应的多个核酸或核酸类似物。使用光错属性检测、定量和/或区分耙核酸、靶核酸类似物和突变体序本发明涉及包含至少一个疏水性分子和信号对的寡核苷酸类似物,其中所述信号对包含单体荧光和/或分子内受激子和/或分子内激发复合体和/或分子内FRET复合体和/或分子内电荷迁移复合体。在优选实施方案中，寡核香酸类似物包含的信号对的一部分位于或靠近所述寡核苷酸类似物的一端，而所述信号对的另一部分位于或靠近所述寡核苷酸类似物的另一端。此外，所述寡核苷酸类似物包含至少两个疏水性分子，所述寡核苷酸类似物的两半侧各有一个，当未与乾核酸结合时，所述疏水性分子能够促进所述信号对的相互作用显著好于由与所述寡核苷酸或寡核普酸类似物相同的核苷酸序列组成的缺乏所述疏水性基团的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的信号对的相互作用。因此包含至少两个疏水性分子的寡核苷酸类似物将比相应的不包含所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸类似物具有更高的信号或更低的背景信号。检测相应的耙核酸和/或乾核酸类似物和其突变体存在的方法
技术领域：
：本发明的一个目标是提供检测包含特异性靶序列的核酸或核酸类似物的方法，其中所述乾序列可与任何其它序列存在至少一个碱基差异，其中所述方法包含如下步骤a)提供测试突变所需的核酸和/或核酸类似物混合物；和b)提供包含至少一个疏水性分子和信号对的，能够与所述特异性序列杂交的寡核苷酸类似物；和c)将所述寡核苷酸类似物与包含核酸或核酸类似物的混合物在允许杂交的条件下孵育；和d)洗去与所述寡核香酸类似物的亲合性低于所述耙序列的序列；和e)确定所述乾序列存在与否。此外，本发明提供区分包含特异性乾序列的核酸或核酸类似物和包含突变体序列的核酸的方法。优选地，杂交、测量或分帛在高严格性条件下执行。例如溶液中的分离可通过例如电泳或层析执行。更优选地，仅当杂交在高严格性条件下执行时，包含本发明所述至少一个疏水性分子和信号对的寡核苷酸或寡核苷酸类似物才和相应的靼核酸和/或核酸类似物杂交。在另一个优选的实施方案中，包含至少一个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸类似物与所述乾核酸和/或所述乾核酸类似物互补。在另一个优选的实施方案中，包含至少一个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸类似物与所述耙核酸和/或所述靶核酸类似物的突变体互补。在另一个优选的实施方案中，包含至少一个本发明所述疏水性分子的至少两个寡核苷酸类似物分别与靶序列和其至少一个已知的突变体序列互补。在另一个优选的实施方案中，更多包含至少一个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸类似物用于区分靶核酸和/或靶核酸类似物和差异可小至一个位置的所有其它已知的核酸。例如，所述乾核酸和最相似的核酸之间的差异可以是突变、曱基化状态、缺失、插入或相似的小变化。在最优选的实施方案中，更多包含至少一个本发明所述疏水性分子的寡核苷酸类似物用于区分乾核酸和/或靶核酸类似物和其已知类型的单点突变。在优选的实施方案中，区分靶核酸和/或乾核酸类似物和其突变体是通过使用分子间受激子、激发复合体、FRET复合体和/或电荷迁移复合体执行的。使用熔解温度检测相应的把核酸和/或耙核酸类似物和其突变体存在的方法
技术领域：
：本发明的一个目标是提供检测包含特异性靶序列的核酸或核酸类似物的方法，其中所述靶序列可与任何其它序列存在至少一个核碱基差异，其中所述方法包含如下步骤a)提供测试突变所需的核酸和/或核酸类似物混合物；和b)提供包含至少一个疏水性分子和信号对的，能够与所述特异性序列杂交的无茎信标；和c)将所述无茎信标与包含核酸或核酸类似物的混合物在允许确定熔解温度和/或亲合温度的条件下孵育；和d)确定所述靶序列存在与否。在另一个优选的实施方案中，使用了两个均包含本发明所述至少一个疏水性分子和信号对的无茎信标，所述无茎信标一个是靶核酸特异性的，一个是突变体核酸特异性的。在更优选的实施方案中，所述两个无茎信标产生可以区分彼此的信号。在更优选的实施方案中，包含本发明所述至少一个疏水性分子和信号对的靶核酸特异性的寡核苷酸或寡核苷酸类似物具有高熔解温度和/或亲合温度意味着存在所述耙核酸，包含本发明所述至少一个疏水性分子和信号对的突变体核酸特异性的寡核苷酸或寡核苷酸类似物具有高熔解温度和/或亲合温度意味着存在所述突变体核酸。包括酶学步骤的检测方法
技术领域：
：本发明所述乾序列和/或突变体序列的存在、鉴定或定量可通过包括酶学步骤的方法执行。因此，在一个实施方案中，本发明涉及^r测、鉴定和/或定量靶序列和/或突变体序列的方法。本发明更优选的实施方案涉及检测、鉴定和/或定量靶序列和/或突变体序列的方法，其中所述方法包含如下步骤g)提供检测、鉴定和/或定量把序列或突变体序列需要使用的核酸和/或核酸类似物混合物；和h)提供引物组和本发明所述寡核苷酸类似物，其中所述引物和所述寡核苷酸类似物能够与所述乾序列和/或突变体序列杂交；和i)将所述引物和寡核苷酸或寡核苷酸类似物与所述核酸和/或核酸类似物混合物在允许所述引物与所述核酸和/或核酸类似物杂交的条件下孵育；和j)使用所述杂交的靶序列作为才莫板，用核苷酸或核苷酸类似物或寡核苷酸或寡核苷酸类似物对所述引物的3'端进行延伸；和k)将所述包含至少一个疏水性分子的寡核普酸或寡核苷酸类似物杂交并确定所述信号对的信号强度，和1)任选地重复步骤c)至e)。优选地，杂交在高严格性条件下执行。更优选地，仅当杂交在高严格性条件下执行时，包含至少一个本发明所述疏水性分子的寡核苦酸或寡核苷酸类似物才和相应的耙核酸和/或核酸类似物杂交。另一方面，本领域技术人员可以将所述信号对的信号强度与所述靶和/或突变体序列的存在、鉴定和/或定量联系起来。在一个实施方案中，所述方法检测靼和/或突变体序列，其中所述突变体序列与所述靶序列至少有一个核碱基差异，优选地所述突变体序列与所述把序列有1至5个核威基的差异。在更优选的实施方案中，使用了两个均包含本发明所述至少一个疏水性分子和信号对的无茎信标，所述无茎信标一个是革巴核酸特异性的，一个是突变体核酸特异性的。在本发明另一个实施方案中，本发明所述寡核苷酸或寡核苷酸类似物或核酸和/或核酸类似物可附着于固体支持物。然后通常通过高严格性条件下一个或多个漂洗步骤执行分离。一些用于扩增的酶能够降解寡核苷酸或寡核苷酸类似物，如果其在扩增过程中与耙核酸杂交。此降解可以用于检测靶核酸的存在。因此优选的实施方案提供本发明所述寡核苷酸或寡核脊酸类似物，其中所述寡核普酸或寡核苷酸类似物对扩增所用的酶的核酸酶活性敏感。但是酶学降解也会消除或降低执行终点熔解和/或亲合性测量的可能性，进而消除或降低通过此测量确认结果的能力。因此本发明更优选的实施方案提供包含本发明所述至少一个疏水性分子和信号对的寡核苷酸或寡核苷酸类似物，其中所述至少一个疏水性分子的位置将使其大大抑制所用的酶对所述寡核苷酸或寡核苷酸类似物的本发明更优选的实施方案提供包含本发明所述至少一个疏水性分子和信号对的寡核苷酸或寡核苷酸类似物，其中所述至少一个疏水性分子的位置将使其大大抑制所用的酶对所述寡核苷酸或寡核香酸类似物的酶学降解，所以与相应的不包含所述疏水性基团的寡核苷酸或寡核香酸类似物113相比时，其信噪比增强。在本发明更优选的实施方案中，所述寡核苷酸或寡核苷酸类似物合理地未^皮所述酶学步骤改变，从而可以用于进一步的验证或重新用于测量。确定輩巴核酸的量和多态性位点是否存在突变在本发明的一个实施方案中，靶和突变体序列的量是通过杂交后的包含包含至少一个疏水性分子和信号对的寡核苷酸类似物的分析的光语属性而确定的。所迷检测可以检测连接至所述寡核普酸类似物的标记物对或间接地通过检测另一标记物进4亍。本发明所述突变的存在与否可使用许多不同的分析确定。优选地，分析包括确定熔解温度或确定光镨属性或二者的混合。因此，在本发明的一个实施方案中，突变的存在与否是通过在杂交后确定包含至少一个疏水性分子的寡核苷酸类似物的光谙属性确定的。所述光谱属性可以是荧光属性，例如所述光镨属性可选自由单体荧光、受激子荧光、激发复合体荧光、FRET和电荷迁移复合体UV吸收带组成的组。也可以确定多于一个光谱属性，例如所述光谱属性可以是选自由单体荧光、受激子荧光、激发复合体荧光、FRET和电荷迁移复合体荧光的光谱属性组成的组的两个或多个，特别地所述光谱属性可以是单体荧光和受激子或激发复合体或FRET或电荷迁移荧光。如上文所述，包含至少一个疏水性分子的寡核苷酸类似物的信号对的至少两个部分的位置彼此相关，以便它们可以形成分子内受激子、分子内激发复合体、FRET或电荷迁移复合体，然后分开这两个部分的核碱基对进行碱基配对，优选造成所述两部分不能相互作用和进而形成分子内受激子、分子内激发复合体、FRET或电荷迁移复合体。所述疏水性分子应确保未与其靶序列杂交的寡核苷酸类似物中信号对的两部分间显著更好的相互作用，以形成比不存在所述疏水性分子时更强的分子内受激子、分子内激发复合体、FRET或电荷迁移复合体，以便当分开信号对的所述两个部分的核tt对进行碱基配对时，所述分子内受激子、分子内激发复合体、FRET或电荷迁移复合体的变化应显著大于不存在所述疏水性分子时。因此，当包含至少一个疏水性分子的寡核香酸类似物的信号对的两部分的位置彼此相关，以便它们可以形成分子内受激子、分子内激发复合体、FRET或电荷迁移复合体时，低的或基本上没有受激子荧光、激发复合体荧光、FRET或电荷迁移复合体UV发射带可指示不存在把核酸，而高的受激子荧光、激发复合体荧光、FRET或电荷迁移复合体UV发射带可指示存在靶核酸，或反之依然。实施例下列实施例说明了所选择的本发明实施方案，而不应视为对本发明的限制。实施例中使用了下列缩略语ODN:寡脱氧核苷酸实施例1此实施例显示了如何使用上文所述的程序ALOGPS2.1h加:〃146.107.217.178/lab/alogps/starlhtml绘制分子以计算其SMILES符号(notation)和ALOGP值。通过使用ACD/Labs8.00Release查看分子。产品版本8.17，2005年5月4日构建。疏水性分子ALOGP值的计算是在分子通常与连接体或主链单体单元连4妾(当所述分子包含在核苷酸类似物，如疏水性核普酸内时)的位置连接曱基。此处显示的连接点并非意在以任何方式进行限制。连接甲基的原因是因为当其未被完全取代时(如N-H键)，连接体或主链单体单元通常连接至高度偶极的基团。例如，如果包含所述疏水性分子的核苷酸或假核苷酸中不存在N-H键，这将带来错误的疏水性印象。天然核碱基在通常结合至主链单体单元的位点处添加甲基时的115ALOGP值H3C9-甲基-9//-噤呤-6-胺SMILES:C12=NC-NC{N)=C1N=CN2CALOGPs=>0.12OH3C甲基-l,9-二氢-6/f-噪呤-6-酮SMILES:C12=C(ISNCM1C)C{=0)NC(N)=N2ALOGPs=-0.931-曱基嘧啶-2,4(1//,3^)-二酮；SMILES:C10=O)N(C)C-CC(=O)N1ALOGPs=-0.854-氨基-1-曱基嘧咬-2(1//)-酮S亂ES:C1(。0)N(G)C=CC(N》-N1ALOGPs=-0.63Q'l,5-二甲基嘧啶-2,4(l/f,3^)-二酮SMILES:C1(=0)N(C)C=C(C)C(-0)N1ALOGPs=-0.63上述结构从左至右是曱基化的核碱基腺噤呤、胞嘧啶、鸟噤呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。从上面可以看出，所有核碱基的ALOGP值都小于0，因此不是本发明所述疏水性分子。在通常接合至连接体或主链单体单元的位点添加曱基的疏水性、芳基嵌入剂的ALOGP值。在本文显示的实施例中，甲基的位置并不重要。任何这些分子都可以是本发明所述疏水性分子<formula>formulaseeoriginaldocumentpage117</formula>从上文可以看出，接合系统越大，ALOGP值越高。在通常接合至连接体或主链单体单元的位点添加甲基的疏水性、杂芳基嵌入剂的ALOGP值。任何这些分子都可以是本发明所述疏水性分子。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage117</formula>3,7,9-三曱基吡啶并[3',2':4，5]噻吩并[3,2-^]嘧啶"4(3//)-酮l-甲基-l/^引哚ALOGPs=2.10ALOGPs=2.37<formula>formulaseeoriginaldocumentpage117</formula>2-甲基蒽-9,10-醌ALOGPs=3.268-曱基吡喃并[3，2:/]吲哚-2(8i/)-酮ALOGPs=2.10疏水性烷烃和烯烃的ALOGP值。CH3H3CGH9丙烷戊烷ALOGPs-3.39庚烷ALOGPs=4.66H3C壬烷ALOGPs-5.24、CH3H,C^^CH2丙-l-烯ALOGPs-1.68(3^-戊-1,3-二烯ALOGPs=2.65(3￡,5司-庚-1,3,5-三烯ALOGPs=3.40H3C'(3￡,5￡,7￡)-壬-1，3,5,7-四烯ALOGPs=4.02可以看出，ALOGP值随烷烃和烯烃长度的增加而增加。一些Blackhole猝灭剂(BHQ)的疏水性部分的ALOGP值和SMILES符号:BHQOSMILES:C3(N-NC2-CC(C)-C<N-NC1=COC(N(G)C)G=C1)OC2)=C(C)C=CC=C3ALOGPs=6,46H3C—ON=N、,、BHQ1SMILES:C3(N-NC2=CC(OCHi(N=NC1-CC=C(N(C)CC)OC1)C=C2C)=C(N(=0)0〉OC(C)C=G3ALOGPs-6.64119<formula>formulaseeoriginaldocumentpage120</formula>可以看出，上文所示的猝灭剂是疏水性的，并且所有显示的实例的ALOGP值都大于2。这就是为什么通过将本发明所述疏水性分子置于与所述荧光团相同的一侧可以增加位于无茎信标的相应端的荧光团和疏水性猝灭剂间的相互作用的原因。所述猝灭剂和所述疏水性分子之间的疏水性相互作用可以使所述荧光团和猝灭剂靠近一一降低背景荧光。一些荧光团的信号产生部分的ALOGP值和SMILES符号0SMIl￡S:Ct3=CC=C(0>C<C>=C10C2=C(Ci)C0)=C(C)C=C2C340C(=0>C5-GC(a)=C(CJ)C-C45ALOGPs=5.35O5'-荧光素SMILES:C13=CC=C(O)C-C1OC2-CC(0)-CC-C2C340C(=0)C5=CC-C(C(NC)=O)C=C45ALOGPs-Z48EpochRedmondRedSMILES:C13=CC=C(0)C-C10C2=CC(0)C(C)=CC2=N3ALOGPs-2,08TAMRASMILES:C13=CC-C{N(C)C)OC10C2=CC(=P4+(C)C)C(C)=CC2-C3C4=C(CaP-])=Op=CC(C(0)NC)=C4ALOOPs=-0.15可以看出，上面所示的一些荧光团是本发明所述疏水性分子，其ALOGP值大于0。通过将本发明所述疏水性分子置于与所述猝灭剂相同的一侧可以增加位于无茎信标的相应端的疏水性焚光团和猝灭剂的相互作用。所述荧光团和所述疏水性分子之间的疏水性相互作用将降低背景荧光。实施例2-低背景荧光此测量按熔解温度实验-使用96孔板在Mx3000,Stratagene实时PCR仪上进行。测量在反映普通的实时PCR反应使用的緩冲溶液的緩冲溶液中执行。所述緩沖液含有4mMMgCl2、50mMKC1、10mMTRIS-HC1、pH=8.0。1mL无茎信标(5pmol4iL)和2DNA靼序列(5pmol/^L)和22上述緩沖液。首先将所述混合物加热至95。C1分钟以变性二级结构，然后在35。C进行双链体退火，然后升温至95。C，同时测量每度的信号变化。结果显示于图2,其它详细信息(像所述无茎信标的序列)可以参见所述图的说明。从图2可以看出，与无茎DNA探针(未结合探针的荧光)相比，所述无茎信标的背景荧光显著降低，而两种探针具有相同的最大荧光(在35°C)。还可以清楚地看出，包含疏水性分子的无茎信标的背景荧光(或噪音)在整个温度范围内都较低，而基于DNA的探针在较低温度时的背景荧光较高。这可能是因为所述探针在较低温度时运动减少，造成荧光团和猝灭剂的频繁"碰撞"减少。氢盐处理的DNA样品靶。该探针在RT-PCR运行过程中优选的读数温度。C)中间，所以这种情形下，应该是62。C。因此，所述探针在读数温度具有好的信噪比非常重要。信噪比的计算如下退火时的信号(探针+匹配靶)-退火时的緩冲液信号退火时的信号(探针+错配把)-退火时的緩冲液信号在图1所示的实施例中，62"C时的信噪比应为43.2-0,2无茎DNA信噪比20/7-0'2:2.1122无茎信标信噪比5.9-0.2=实施例3-—些无茎信标的高亲合性和特异性测量按上文实施例2所述执行。结果和序列信息可以参见图3和该图的说明。所述结果显示为信号对温度的一阶导数。图3证明了具有嵌入疏水性分子插入的无茎信标可以设计用于实现比其DNA对应物更高的特异性。实施例显示所述无茎信标(SB)分别在63.7。C和49.9。C与其匹配耙和错配乾杂交，具有13.8。C的差异，而所述DNA分别在64.9。C和57.rC与其匹配靼和错配輩巴杂交，仅有7.8。C的差异。因此所述无茎信标的特异性比对輩巴序列具有相同亲合性的无茎DNA探针的特异性高77%，测量为与匹配靶与错配靶亲合性的差异。实施例4-在PCR分析过程中测试和优化引物和探针此实施例中描述的试验方案是使用能够进行多个读数(一个循环中大于4个读数)的实时PCR仪辨别两个基因型A和B。此类仪器包括此研究使用的Stratagenes实时PCR仪Mx3000P。通过使用下文描述的程序，可以测试引物是否在所选的退火温度下与才莫板作用，同时还可以单独优化两个探针的读数温度。测量本身可以用于辨别紧密相关的基因型。1.向透明(optical)PCR管中加入10nL2xPCRMastermix、1pL正向引物(IOpmol/pL)、1pL反向引物(10pmol4iL)、lpL基因型A特异性的无茎信标(5pmol&L)、1^L基因型B特异性的无茎信标(5pmol/jiL)、5nLH20和1DNA(100pG-20nG/pL)。2.如果可以，为如上文所述的每个感兴趣的靶准备两个管，一个用于基因型A，一个用于基因型B。如果无法得到这些对照，只需准备未知样品管。3.使用透明盖(如果使用通过盖测量荧光的实时PCR仪，就像大多数型号使用的那样)或仅用标准盖(如果使用通过管壁或管底读数的仪器)盖上管。4.将所述管放入实时PCR仪，并运行下列程序(如图6所示)a.如果使用热启动聚合酶，则根据制造商的说明进行活化，否则只需在95。C加热1分钟以消除二级结构；和b.活化后使用下列步骤进行45个循环i.95X:变性30秒；和ii.引物和探针(例如在50。C)退火l:OO分钟，终点或连续荧光测量5和iii.将温度增加2'C，进行终点荧光测量。使用的时间间隔应尽可能的短(取决于样品的数量和位置)；和iv.重复步骤ii直至达到约7(TC;和v.在72。延伸30秒；和5.分析数据一一在今后的实时PCR实验中使用的针对该靶的该探针的最佳荧光读数温度是所述无茎信标仅与完全互补靶杂交并且具有尽可能高的信号的温度。将得到两个探针单独的读数温度。不同温度阶段的荧光差异和此方案如何用于优化该特定靶今后的RT-PCR运行的实例可参见图8。此实施例还说明了在单个封闭管中对两个无茎信标进行多重分析。实施例5-引物和探针的测试和优化，终点确定此节介绍了如何使用终点亲合测量优化本发明所述无茎信标和辨别两个基因型A和B。此方法特别适合用于具有高升温速率的实时PCR仪，如例4口CorbettResearch的RotorgeneTM3000，AppliedBiosystems7500FastReal-TimePCRSystem和其它升温(冷却)速率》3。C/秒的快速升温实时PCR仪，但是也可用于在标准实时PCR仪上执行。此实施例中基于所述程序的测量在CorbettResearch的RotorgeneTM3000上执行。1.向透明PCR管中加入102xPCRMastermix、1正向引物(IOpmol4iL)、1nL反向引物(IOpmol/^iL)、1基因型A特异性的无茎信标(5pmol/[iL)、1nL基因型B特异性的无茎信标(5pmo!AiL)、5nLH20和1[iLDNA(100pG-20nG/pL);和2.如果可以，为如上文所述的每个感兴趣的靶准备两个管，一个用于包含基因型A的DNA,—个用于包含基因型B的DNA。如果无法得到这些对照，只需准备未知样品管；和3.使用透明盖(如果使用通过盖测量荧光的实时PCR仪，就像大多数型号使用的那样)或仅标准盖(如果使用通过管壁读数的仪器，如澳大利亚CorbettResearchPtyLtd的RotorgeneTM)盖上管；和4.将所述管放入实时PCR仪，并运行下列程序(如图7所示)a.如果使用热启动聚合酶，则根据制造商的说明进行活化，否则只需在95。C加热1分钟以消除二级结构；和b.活化后使用下列步骤进行45个扩增循环(参见注8):i.95'C变性10秒；和ii.引物和探针(例如在5(TC)退火15秒，读取终点荧光；和iii.任选地在其它一个或两个温度下读取荧光；和iv.在72。延伸20秒；和b.按下列方式进行终点亲合测试i.95'C变性15秒；和ii.在比上次退火低rC的温度下退火15秒(从72。C开始)。读取终点荧光；和iii.重复上述两个步骤27次(72。C至45。C);和5.分析数据一一在以后的实时PCR实验中使用的该耙的最佳荧光读数温度位于与完全互补靶杂交的无茎信标的荧光开始"减弱，，的温度和与错配靶杂交的无茎信标的荧光开始"减弱"的温度的中间。所得到的温度可以用作以后使用相同设置测量的读数点。亲合性测量(像此处所述的测量)是区分相似靶的非常敏感的方式。有关终点、亲合性测量如何可以用于优化相同的耙以后的RT-PCR运行和所述亲合性测量如何非常有力地辨别两个非常相似的耙的实例，可以参见图9。实施例6-检测HOXB5中单个CdG的曱基化状态设置测试以查看其是否可以区分基因HOXB5中曱基化的、未甲基化的和"杂合子"的单个CpG位点。此实施例中的测量在CorbettResearch的RotorgeneTM3000上执行。靶、引物和探针正向引物5'-lTTTGTTTAGAGGTTAAAGTTAATTTTT[SEQIDNO.11]反向引物5'-1TCAAAAAATAATTCATACTCTATAATTAC[SEQIDNO.12]未甲基化特异性探针HEX-TT1AAAAAC1C4ATTC1AAT1A-BHQ1[SEQIDNO:13]甲基化特异性探针FAM-TT1GAAT￡G1GTTT1T-BHQ1乾序列包含在预扩增的亚硫酸氬盐处理的HeLa或BL13的DNA(外侧引物5'-lGGGAGTTAGTAGGGAGGTAGT[SEQUENCEIDNO.14]和5'-lTAAAAAATCACRTACTTTTATTAACC)[SEQUENCEIDNO.15]中。测序数据已显示HeLa在感兴趣的多态性位点甲基化，而BL13则显示为未甲基化。制备36个包含乾DNA的样品，每种12个纯HeLa、纯BL13或HeLa和BL131:1的亚硫酸氬盐处理的DNA的混合物。3种样品均使用4种不同稀释度的靶稀释IO、100、1,000或100,000倍。标签1指插入的假核苷酸，即包含疏水性和嵌入分子芘的疏水性核脊酸((S)-l-(4，4'-二甲氧三苯基曱基氧(dimethoxytriphenylmetyloxy))-3-芘甲基氧-2-丙醇的亚磷酰胺)。FAM和Hex是荧光团，而BHQ1是猝灭剂。OPCR设置正向引物1|jL(10.0pmo1/^L)反向引物1(10.0pmo1/mL)探针(FAM)1[iL(12.5pmo1/pL)探针(Hex)1pL(12.5pmo1/tiL)水5nL2xMastermix，PromegalO(jLDNA才莫板1nL(参见上文的稀释信息)实时PCR设置文件使用的实时PCR设置文件的描述参见图14A。结果在实时PCR过程中使用荧光测量，除一个样品外，所有样品均得到正确指定。使用亲合性分析，所有样品均得到正确指定。一个样品无法扩增。实施例7-人Andrenogen受体核香酸2074中的SNP检测设置测试以查看所用的探针组合能否区分野生型和A—G转变突变体。此实施例中的测量在CorbettResearch的Rotorgene3000实时PCR仪上执行。靶、引物和探针[SEQIDNO,16]正向引物5'-TCCCACATCCTGCTCAAG[SEQIDNO.17]反向引物5'-ATCTCTGCCATCATTTCCG[SEQIDNO.18]F雄-T1CAAA1AGIGA1ACTG1AT画BHQ1野生型特异性探针[SEQIDNO.19]突变体特异性^:针HEX-2TCAAA2AG￡GA2ACTG2AT-BHQ1在此实验中，突变体特异性探针和野生型特异性探针一起加入到同质性分析。标签1指插入的包含疏水性、嵌入分子芘(即上文所述的编号XII)的假核苷酸或疏水性核苷酸((S)-l-(4,4'-二甲氧三苯基曱基氧)-3-芘曱基氧-2-丙醇的亚磷酰胺)。标签2指插入的假核苷酸或疏水性核苷酸(3-(1-0-(4,4'-二甲氧三苯基曱基)-2-0-(2-氰乙基二异丙基酰氨亚磚酸盐)-1,2-丁二醇)-4-仏(7,9-二甲基-311-吡啶并[3',2':4,5]噻吩并[3,2-(1]嘧啶-4-酮)的亚磷酰胺)(包含嵌入疏水性基团，即上文所述的编号XXVI)。FAM和Hex是荧光团，而BHQ1是猝灭剂。模板各2个样品，cDNA提取自LNC叩(突变体)和/或THP(野生型)(总共6个样品)。OPCR设置正向引物1nL(10.0pmol/|oL)反向引物1tiL(10.0pmo1/mL)探针(FAM)1nL(12.5pmo1/^L)探针(Hex)1pL(12.5pmo1/tiL)水5nL2xMastermix，Promega10DNA模板1实时PCR设置文件使用的实时PCR设置文件的描述参见图14B。结果在55'C,野生型特异性探针与野生型靶和突变体靶均结合，而突变体特异性探针与其靶特异性杂交。在61。C，可以调节野生型的阈值，以便仅获得野生型探针的特异性信号，而突变体特异性探针工作良好。在65'C，野生型特异性探针仅与其特异性靶结合，而突变体特异性探针不再结合。FAM信道的终点亲合性测量显示，野生型特异性探针仅与THPcDNA杂交而不与LNCap杂交的窗口约为5度(61至66。C)。128HEX信道的终点亲合性测量显示，使用突变体特异性探针非常容易区分与完全互补靶和单核香酸错配靶的结合，在55。C以上有至少l(TC的窗o。结论使用所述探针组合能够检测人Andrenogen受体核苷酸2074中发现的A—G转变。FAM-标记的探针在61至66。C窗口内是特异的，而HEX标记的探针在55至63。C之间的温度下具有特异性。再次显示了如本文所述的终点亲合性研究可以用于特异性检测核酸的非常小的变化。所述方法为同质性方法，其可以在最佳扩增条件下执行扩增，然后执行亲合性测量。实施例8实时PCR和疏水性核苷酸的定位引言此实施例说明荧光信号强度与疏水性核普酸的定位有关。材料<table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table>[SEQIDNO:20〗Bgalprob—01:5'國Fam1ACCGACCCAGCGCCClB,國3'[SEQE)NO:21]5'國CGGTTACGATGCGCCCATCTACAC國3'隱CAGCACCATCACCGCGAGGC誦:Bgalprob一02:5'國FamA1CCGACCCAGCGCC1CBHQl-3'[SEQIDNO:22]Bgalprob—03:5'國FamAC1CGACCCAGCGC1CCBHQ1-3'1=结构为X-Y-q的疏水性核苷酸，其中X是通过磷酸二酯键连接寡聚体的主链单体单元并具有结构-0-CH2-CH2-0-，Y是-CH2-0-CH2-连接体，q是r-芘。引物(Primere)[SEQIDNO:23]Bgal—S函l—F:[SEQIDNO:24]Bgal—S画l—R:结果/结论从图IO可以看出，紧邻信号对的IPN的定位显著降低了荧光信号。但是只要有一个核苷酸位于所述信号对和第一个疏水性核苦酸之间就显著改善了信号，之间有两个核苷酸产生更高的信号。因此本发明优选的实施方案不会让疏水性核脊酸最紧邻(荧光团部分)信号对。实施例9靶的终点加入和检测引言此实施例"^兌明了向把核酸增加:i笨针如何可以用于检测所述乾核酸的材料和方法首先使用指定的引物和mastermix扩增耙核酸<table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table>2xPromegaMastermix10.00mL_水4.00tiLpCHl10卩-gal野生型模板(Pubmedid595693)2.00mL可变的总体积/反应20.00-然后对所述混合物执行下文所示的扩增设置文件:循环循环点保持@95。C,2分钟，0秒循环(50个重复)步骤1@94X:，保持10秒步骤2@6(TC,保持30秒，循环A([Green][1][1])所需执行所述扩增设置文件之后，将2,00^iL下列探针加入其各自的扩增反应(下表的编号11不添加探针)。5'國FamA1CCGACCCAGCGCC1CBHQ1-3'Bgalprob—02[SEQIDNO:26]Bgalprob—03:[SEQIDNO:27]Bgalprob—05:[SEQIDNO:28]Bgalprob—ref:-FamAC1CGACCCAGCGC1CCBHQ1画3'-FamACCG1ACCCAGC1GCCCBHQ1-5'國FamACCGACCCAGCGCCCBHQ1-3'1=结构为X-Y-Q的疏水性核苷酸，其中X是通过磷酸二酯键连接寡聚体的主链单体单元并具有结构-0-CH2-CH2-0-,Y是-CH2-0-CH2-连接体，Q是l'-芘。最后使用图ll底部显示的设置文件执行亲合性测量。结果和结论131从图11显然可以看出，使用显示的亲合性测量设置文件，所有显示的探针均可以用于輩巴核酸的终点检测。同样清楚的是，包含疏水性核苷酸的无茎信标比基于DNA的探针具有更高的靶核酸亲合性和更高的荧光信号强度。其它在相似的反应中比较下列探针[SEQIDNO:29]Bgalprob_01:5'陽Fam1ACCGACCCAGCGCCClBHQl-3'[SEQIDNO:30]Bgalprob—05:5'-FamACCG1ACCCAGC1GCCCBHQ1画3'[SEQIDNO:31]Bgalprob—ref:5'誦FamACCGACCCAGCGCCCBHQ1-3'1=结构为X-Y-Q的疏水性核普酸，其中X是通过磷酸二酯键连接寡聚体的主链单体单元并具有结构-0-CH2-CH2-0-,Y是-CH2-0-CH2-连接体，Q是l'-芘。从图12可以看出，紧邻信号对的疏水性核苷酸的定位也显著降低了此类测量的荧光信号。实施例10无茎探针对单链塞聚体靶的亲合性引言此实施例说明了包含疏水性修饰的无茎信标比不包含所述疏水性修饰的探针具有更高的对完全互补乾序列的亲合性，其中所述疏水性修饰具有X-Y-Q结构，其中X是通过磷酸二酯键连接寡聚体的主链单体单元并具有结构-0-CH2-CH2-0-，Y是-CH2-0-CH2-连接体，Q是l'-芘。材料和方法测试了下列探针[SEQIDNO:32]Bgalprob—1:[SEQIDNO:33]Bgalprob—2[SEQIDNO:34]Bgalprob—5:[SEQIDNO:35]Bgalprob一6:[SEQIDNO:36]Bgalprob—7:[SEQIDNO:37]Bgalprob—ref:寡聚体靶序列Bgal_WT—tar:设置文件-Fam1ACCGACCCAGCGCCCIBHQ1-3'-FamAlCCGACCCAGCGCC1CBHQ1-3'-FamACCGIACCCAGCIGCCCBHQ1-3'-FamACCGAlCCCAGlCGCCCBHQ1.-FamACCGACICCAIGCGCCCBHQ1-3''-FamACCGACCCAGCGCCCBHQ1-3'-AACGGGCGCTGGGTCGGTTAC-3'循环保持@94^:，i分钟,o秒熔解(25_90°C),第一步保持秒，下一步保持5秒，熔解A([Green][1]m)混合物寡聚体靶2.00jiL1腦ol/mLP-gal探针—1至—8和—ref2.00jjL1nmol/mL緩冲液(280mMNaCl，20mMNa2HP0410.00nL水6.00结果和结论从图13可以看出，与相应的DNA相比，所有无茎信标均具有相似或更高的对互补寡聚核苷酸靶的亲合性。此外，还可以计算出此实施例中提到的所有无茎信标(探针一l除外)具有与不含疏水性修饰的DNA探针相似或更高的信噪比(25度时的信号除以90度时的信号)。信噪比:<table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table>权利要求1.一种寡核苷酸类似物，其包含n个核苷酸和/或核苷酸类似物的连续序列和至少一个疏水性核苷酸，其中所述寡核苷酸类似物共价连接至信号对，其中所述疏水性核苷酸具有通用结构X-Y-Q其中X是核苷酸或核苷酸类似物或能够掺入核酸或核酸类似物主链的主链单体单元，Q是不参与沃森-克里克氢键合的疏水性分子；和Y是连接所述核苷酸或核苷酸类似物或主链单体单元和所述疏水性分子的连接体部分；和其中n是至少为4的整数；和其中所述至少一个疏水性核苷酸被置于距一端最多9个核苷酸和/或核苷酸类似物的位置；和其中所述信号对由两部分系统组成，其中一个部分被置于距5′端最多6个核苷酸和/或核苷酸类似物的位置，而另一个部分被置于距3′端最多6个核苷酸或核苷酸类似物的位置；其中所述信号对的所述部分与所述疏水性核苷酸不同，条件是当所述信号对的一个部分作为悬挂端被置于5′端时，则5′端的第一个核苷酸或核苷酸类似物不是疏水性核苷酸；当所述信号对的一个部分作为悬挂端被置于3′端时，则3′端的第一个核苷酸或核苷酸类似物不是疏水性核苷酸。2.如权利要求1所述的寡核香酸类似物，其中在连接至所述连接体Y的位置添加曱基时，至少一个疏水性分子Q具有的logP值大于O,如大于0.5，例如大于0.75，如大于1，例如大于1.25，如大于1.5,例如大于1.75，如大于2，例如大于2.5,如大于3，例如大于4,如大于5。3.如权利要求2所述的寡核苷酸类似物，其中所述logP值是使用计算机程序ALOGPS2.1确定的ALogP值。4.如权利要求1所述的寡核苷酸类似物，其中至少一个疏水性分子Q包含选自由碳水化合物、类固醇、聚芳烃和杂聚芳烃的链组成的组的化学基团。5.如权利要求1所述的寡核苷酸类似物，其中至少一个疏水性分子Q选自由聚芳烃和杂聚芳烃组成的组，所述聚芳烃和杂聚芳烃任选地被选自由羟基、溴、氟、氯、碘、巯基、硫、氰基、烷基硫、杂环、芳基、杂芳基、羧基、烷氧羰基、烷基、烯基、块基、硝基、氨基、烷氧基和酰氨基组成的组的一个或多个取代。6.如权利要求5所迷的寡核苷酸类似物，其中所述聚芳烃或杂聚芳烃依氺居本发明可由1，例如2，如3,例如4，如5,例如6,如7，例如8,如多于8个环组成。7.如权利要求1所述的寡核苷酸类似物，其中至少一个疏水性分子Q选自由嵌入剂和小沟结合物组成的组。8.如权利要求1所述的寡核苷酸类似物，其中至少一个疏水性分子Q选自由嵌入剂组成的组。9.如权利要求8所述的寡核普酸类似物，其中所述嵌入剂选自由以下组成的組苯、并环戊二烯、茚、萘、奧、不对称引达省、对称引达省、亚联苯基、苊、非那烯、庚搭烯、菲烷、荧蒽、菲咯啉、吩嗪、菲啶、蒽醌、芘、蒽、环烷、菲、氟烷、茵、^、萘并苯、吖啶酮类、苯并蒽类、均二苯代乙烯类、草酰吡咬,唑类、叠氮苯类、。卜啉类和补骨脂素类和其衍生物。10.如权利要求1所述的寡核苷酸类似物，其中至少一个疏水性基团Q选自由以下组成的症且<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>11.如权利要求1所述的寡核苷酸类似物，其中至少一个疏水性基团包含芘或吡啶并[3'，2':4,5]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4(lH)-酮或7,9-二曱基-吡啶并[3',2',4,5]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4(3H)-酮。12.如权利要求1所述的寡核苷酸类似物，其中所有疏水性分子Q选自根据权利要求2至10的任何疏水性分子。13.如权利要求l所述的寡核苷酸类似物，其中所有疏水性分子Q是芘或吡啶并[3',2':4,5]绻吩并[3,2-d]嘧啶-4(lH)-酮或7,9-二甲基-吡啶并[3',2',4,5]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4(3H)-酮。14.如前述任一项权利要求所述的寡核苷酸类似物，其中至少一个主链单体单元(X)选自由无环主链单体单元组成的组。15.如权利要求1至13任一项所述的寡核苷酸类似物，其中至少一个主链单体单元选自由亚磷酰胺组成的组。16.如权利要求1至13任一项所述的寡核苷酸类似物，其中至少一个主链单体单元选自由以下纟且成的纟且DNA、RNA、PNA、HNA、MNA、ANA、LNA、CNA、CeNA、TNA、(2'画NH)-TNA、(3'-呵画TNA、a誦L-核糖隱LNA、a-L-木糖-LNA、J3-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、双环-DNA、6-氨基-双环-DNA、5-表-双环-DNA、a-双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA、双环[3.2.1]-DNA、双环[4.3.0]酰胺-DNA、卩-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃来苏糖基-NA、2'-R-RNA、a-L-RNA、a-D-RNA和卩-D-RNA的主链单体单元。17.如权利要求1至16任一项所述的寡核苷酸类似物，其中一个或多个核苷酸或核苷酸类似物是DNA和/或2'-0-Me-RNA核普酸。18.如权利要求16所述的寡核苷酸类似物，其中至少一个主链单体单元还包含核碱基或核碱基类似物。19.如权利要求16所述的寡核苷酸类似物，其中至少一个连接体Y连接至最少一个主链单体单元的糖环、核碱基或磷酸二酯键。20.如权利要求1至19任一项所述的寡核苷酸类似物，其中至少一个连接体Y包含x个选自由C、O、S、N和P組成的组的原子的链。21.如权利要求20所述的寡核苷酸类似物，其中所述链被选自由C、H、O、S、N和P組成的組的一个或多个取代。22.如权利要求1至21任一项所述的寡核普酸类似物，其中所述信号对能够根据所述对的所述部分之间的物理距离改变可检测的信号。23.如权利要求22所述的寡核香酸类似物，其中所述可检测的信号是荧光。24.如权利要求1至23任一项所述的寡核普酸类似物，其中所迷信号对的所述部分能够在所述信号对的所述部分靠近时形成分子内受激子、分子内激发复合体、FRET复合体或电荷迁移复合体。25.如权利要求1至24任一项所述的寡核苷酸类似物，其中所述信号对的一个部分是荧光团，而所述信号对的另一部分是猝灭剂，其中所述荧光团和所述猝灭剂能够形成分子内FRET复合体。26.如权利要求1至25任一项所述的寡核苷酸类似物，其中所述信号对的一个部分作为悬挂端被置于5'端，而所述信号对的另一部分作为悬挂端^^置于3'端。27.如权利要求1至26任一项所述的寡核苷酸类似物，其中n是至少为7的整数。28.如权利要求1至27任一项所述的寡核苷酸类似物，其中所述寡核苷酸类似物包含1至5，如5至10，如10至15，例如15至20个疏水性核苷酸。29.如权利要求1至28任一项所迷的寡核苷酸类似物，其中所迷寡核苷酸每3个核苷酸或核普酸类似物包含最多1个疏水性核苷酸。30.如前述任一项权利要求所述的寡核苷酸类似物，其中所述寡核普酸类似物包含至少两个疏水性核苷酸。31.如权利要求30所述的寡核苷酸类似物，其中所有疏水性核苷酸被至少1个不是疏水性核普酸的核香酸或核苦酸类似物分开。32.如权利要求30至31任一项所述的寡核苷酸类似物，其中至少两个所迷疏水性核苷酸位于所述寡核苷酸类似物的相反两侧。33.如权利要求30至32任一项所述的寡核苷酸类似物，其中至少一个疏水性核苷酸位于距5'端9个核苷酸和/或核苷酸类似物以内，和至少一个疏水性核苷酸位于距3'端9个核苷酸和/或核苷酸类似物以内。34.如权利要求30至33任一项所述的寡核苷酸类似物，其中至少两个疏水性核普酸位于距所述信号对的相应部分大致相等的距离。35.如权利要求30至33任一项所述的寡核苷酸类似物，其中所述疏水性核苷酸的疏水性分子能够彼此发生疏水性相互作用，从而使所述信号对的两个部分靠近，如在100A之内，例如80A之内，如60A之内，例如40A之内，如20A之内，例如15A之内，如10A之内，例如5A之内。36.如权利要求30至35任一项所述的寡核苷酸核苷酸类似物，其中没有疏水性核苷酸距5'端的距离比距所述信号对的一个部分的距离更近，也没有疏水性核苷酸距3'端的距离比距所述信号对的另一部分的距离更近。37.如前述任一项权利要求所述的寡核苷酸类似物，其中所述寡核芬酸固定于固体支持物。38.如前述任一项权利要求所迷的寡核苷酸类似物，其中所述寡核苷酸是阵列的一个组件。39.如前述任一项权利要求所述的寡核苷酸类似物，其中所述寡核香酸类似物具有与相应的不包含疏水性核苷酸的寡核苷酸或寡核苷酸类似物相比，相同或更高的对其乾序列的亲合性。40.如前述任一项权利要求所述的寡核苷酸类似物，其中所述寡核苦酸比相应的不包含所述至少一个疏水性核苷酸的寡核苷酸或寡核苷酸类似物对核酸酶降解显著更不敏感。41.如前述任一项权利要求所述的寡核香酸，其中所述寡核苷酸可溶于水。42.如前述任一项权利要求所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸类似物内没有4个核苷酸和/或核苷酸类似物的连续序列与所述寡核苷酸类似物内另一4个核苷酸和/或核苷酸类似物的连续序列互补。43.—种确定杂交的方法，其包含如下步骤a)提供包含n个核苷酸和/或核苷酸类似物的连续序列和至少一个疏水性核苷酸的寡核苷酸类似物，其中所述寡核苷酸类似物共价连接至由两部分系统组成的信号对，其中所述疏水性核脊酸具有通用结构X誦Y画Q其中X是核苷酸或核苷酸类似物或能够掺入核酸或核酸类似物主链的主链单体单元，Q是不参与特异性沃森-克里克氢键合的疏水性分子；和Y是连接所述核普酸或核香酸类似物或主链单体单元和所述疏水性分子的连接体部分；和其中n是至少为6的整数；和其中所述信号对的两个部分的距离在所述寡核香酸类似物未与革巴序列杂交时比所述寡核苷酸类似物与靶序列杂交时更近；和b)提供可能包含所述寡核苷酸类似物的耙序列的核酸混合物；和c)将所述核酸和所述寡核苷酸类似物在允许杂交的条件下孵育；和d)通过确定所述信号对的所述部分是否靠近而检测杂交；e)从而确定杂交。44.如权利要求43所述的方法，其中所述寡核苷酸类似物是根据权利要求1至42任一项所述的寡核苷酸类似物。45.如权利要求43至44任一项所述的方法，其中当所述信号对的所述部分彼此相距在100A之内，例如80A之内，如60A之内，例如40A之内，如20A之内，例如15A之内，如10A之内，例如5A之内时，即认为它们是靠近的。46.—种在扩增过程中检测和/或定量根据权利要求1至42任一项所述的寡核苷酸类似物和靶序列之间的杂交的方法，所述方法包含如下步骤a)提供可能包含乾序列的核酸混合物；和b)提供包含扩增酶的扩增緩冲液、引物组和根据权利要求1至42任一项所述的寡核苷酸类似物，其中所述引物和所述寡核苷酸类似物能够和所述^^序列或与其互补的序列杂交，所述扩增酶能够以才莫^反指导方式延伸引物，而所述扩增緩冲液为所述扩增酶在存在引物和模板的情况下执行此延伸提供条件；和c)将所述引物和寡核苷酸类似物与所述核酸混合物在允许所述引物发生杂交的条件下孵育；和d)使用所述靶序列作为才莫^反，使用所述扩增酶延伸所述杂交引物的3'端;和e)将所述核酸、延伸产物和所述寡核苷酸类似物在允许杂交的条件下孵育；和0检测杂交和任选地定量杂交；和g)任选地重复步骤c)至f)。47.如权利要求43至46任一项所述的方法，其中多于一个根据权利要求1至42任一项所述的寡核苷酸类似物用于同时检测多于一个的靶或突变体序列。48.如权利要求46所述的方法，其中步骤d)、e)和f)的顺序更改为e)、f)和d)。49.如权利要求43至48任一项所述的方法，其中所述核酸混合物是扩增产物。50.如权利要求43至49任一项所述的方法，其中所述耙序列包含在扩增产物内。51.如权利要求43至50任一项所述的方法，其中所述方法是作为"封闭管"(同质性)反应执行的。52.如权利要求43至51任一项所述的方法，其中所述靶序列是由DNA或RNA组成的核酸。53.如权利要求52所述的方法，其中所迷DNA或RNA已经过化学或酶学处理，例如用亚硫酸氬钠处理。54.如权利要求43至45任一项所述的方法，其中所述方法用于检测无i仑存活与否的细l包或组织中的革巴序列。55.如权利要求54所述的方法，其中所迷细胞或组织中的耙序列使用原位杂交检测。56.如权利要求43至55任一项所述的方法，其中所述信号对能够根据所述对的所述部分之间的物理距离改变可检测的信号，并且杂交是通过检测所述可检测的信号的变化进行检测的。57.如权利要求43至57任一项所述的方法，其中所述信号对能够根据所述对的所述部分之间的物理距离改变可检测的信号，并且杂交是通过定量所述可检测的信号的变化进行定量的。58.如权利要求56至57任一项所述的方法，其中信号高于预定限值指示杂交。59.如权利要求56至57任一项所述的方法，其中信号低于预定限值指示杂交。60.如权利要求43至59任一项所述的方法，其中检测所述可检测的信号包含确定所述寡核普酸类似物的光语属性。61.如权利要求60所述的方法，其中所述光谱属性是焚光属性。62.如权利要求43至61任一项所述的方法，其中所述杂交检测包含确定熔解温度和/或亲合温度。63.如权利要求62所述的方法，其中熔解温度或亲合温度高于预定限值指示杂交。64.如权利要求43至63任一项所述的方法，其中杂交指示所迷才莫板中存在靶序列。65.如权利要求63所述的方法，其中高熔解温度指示与突变体序列杂交，低熔解温度指示与把序列杂交。66.如权利要求63所述的方法，其中高熔解温度指示与所述靶序列杂交，低熔解温度指示与突变体序列杂交。67.如权利要求43至66任一项所述的方法，其中所述信号对产生的可检测的信号的强度可以与存在的耙或突变体序列的量相关。68.如权利要求43至67任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸类似物在所述方法的整个过程中稳定。69.如权利要求68所述的方法，其中所述寡核苷酸类似物可以用于进一步的测量或质量控制。70.如权利要求46至69任一项所述的方法，其中所述扩增酶包含核酸酶活性。71.如权利要求70所迷的方法，其中核酸酶活性除去所迷信号对的最5'端的部分。72.如权利要求43至71任一项所述的方法，其中所迷靶序列预期包含至少一个多态性位点。73.如;f又利要求72所述的方法，其中所述寡核苷酸类似物与所述靶序列互补，并且所述至少一个多态性位点位于所述寡核苷酸类似物的中央部分。74.如权利要求72和73任一项所述的方法，其中寡核苷酸类似物与所述乾序列互补，并且所述寡核苷酸类似物在至少一个多态性位点包含A或C。75.如权利要求72所述的方法，其中提供至少两个根据权利要求1至40任一项所述的寡核苷酸类似物，其中所述寡核苷酸类似物之一与所述乾序列的一个基因型互补，所述寡核苷酸类似物的另一个与所述乾序列的另一个基因型互补。76.如权利要求75所述的方法，其中所述第一个寡核苷酸类似物还与所述第二个寡核苷酸类似物同源互补。77.如权利要求76所述的方法，其中一个寡核香酸类似物在所述多态性位点包含"C"核碱基，另一个寡核苷酸类似物在所述多态性位点包含"A"核碱基。78.如权利要求75至77任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸类似物的信号对产生可以区分彼此的可检测的信号。79.—种确定寡核苷酸类似物与靶序列的亲合温度的方法，所述方法包含执行根据权利要求43至78任一项所述的方法，其中最后一步之后执行下列步骤a)将所述混合物变性并快速冷却至高于所述亲合温度的第一个预定温度；和b)通过确定所述信号对的可检测的信号检测杂交，其中所述信号对能够根据所述对的所述部分之间的物理距离改变所述可检测的信号；和c)将所述混合物变性并快速冷却至第二个预定温度，其中所述第二个预定温度低于所述第一个预定温度，d)通过确定所述可检测的信号检测杂交，e)重复步骤3)和4)，其中所述预定温度逐渐被降低至低于所述亲合温度，f)然后确定所迷核酸类似物与所述乾序列的亲合温度。80.—种扩增靶序列的方法，所述方法包含如下步骤a)提供任选地包含所述耙序列的核酸混合物；和b)提供引物组、包含扩增酶的扩增缓冲液、和寡核苷酸或寡核苷酸类似物，其中所述引物和所述寡核苷酸或寡核普酸类似物能够与所述乾序列或其互补序列杂交，条件是当所述扩增酶包含核酸酶活性时，所述寡核普酸或寡核苷酸类似物具有核酸酶抗性；和c)将所述引物和寡核苷酸或寡核普酸类似物与所述核酸混合物在允许杂交的条件下孵育；和d)检测杂交；和e)按一定幅度逐渐增加检测杂交时的温度，直至达到所需的延伸温度，和f)完成所述延伸反应，然后将形成的扩增子变性，并重复步骤c)至f)直至发生所需的扩增。81.如权利要求79和80任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸或寡核苷酸类似物是根据权利要求1至40任一项所述的寡核苷酸类似物。82.如权利要求79至81任一项所述的方法，其中所述温度的逐渐变化是每次例如0.5。C，如rC，例如2。C，如3。C,例如4。C，如5。C，例如大于5r。83.如权利要求79至82任一项所述的方法，其中所述方法在封闭管中执行。84.如权利要求79至83任一项所述的方法，其中达到所述预定温度和检测杂交之间的时间足以让小的寡核苷酸或寡核苷酸类似物与革巴序列退火。85.如权利要求84所述的方法，其中达到所述预定温度和检测杂交之间的时间是例如1秒，如2秒，例如3秒，如4秒，例如5秒，如6秒，例如7秒，如8秒，例如9秒，如10秒，例如11秒，如12秒，例如13秒，如14秒，例如15秒，如1至15秒之间，例如3至20秒之间。86.如权利要求79至85任一项所述的方法，其中所述亲合温度用于辨别耙序列和其突变体序列。87.如权利要求79至86任一项所述的方法，其中在同一封闭管中使用两个或多个根据权利要求1至42任一项所述的寡核苷酸类似物。88.如;f又利要求87所述的寡核苷酸类似物，其中所迷寡核苷酸类似物的信号对能够产生可以区分彼此的可检测的信号。89.如权利要求87所述的寡核普酸类似物，其中至少一个寡核苷酸类似物与靶序列互补，并且至少一个寡核苷酸类似物与突变体序列互补。全文摘要本发明涉及包含信号对和至少疏水性核苷酸的新颖寡核苷酸。寡核苷酸类似物可用于检测核酸序列的状态，如存在、表达、甲基化和/或突变(特别是单点突变)，以及其中正确靶和其它靶之间的差异可小至一个核苷酸的其它序列的状态。本发明还涉及通过使用寡核苷酸类似物和容易获得的仪器检测序列差异和优化条件的新方法。特别地，本发明涉及使用包含信号对和至少一个疏水性核苷酸(如包含嵌入剂的核苷酸类似物)的寡核苷酸或寡核苷酸类似物，特异性检测靶核酸的量或检测一个与其它序列之间的差异可能小至一个核苷酸的序列。文档编号C12Q1/68GK101448957SQ200780017820公开日2009年6月3日申请日期2007年3月16日优先权日2006年3月16日发明者尤尔弗·本奇·克里斯滕森申请人:潘塔贝斯公司