专利名称：灭蚊制剂的制备方法及灭蚊制剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水污染防治技术，具体涉及采用微生物防治水体昆虫污染的技术，更具体地说，涉及一种采用苏云金芽孢杆菌以色列亚种制备防治摇蚊幼虫的灭蚊制剂的方法及应用该灭蚊制剂消除水体中摇蚊幼虫污染的方法。
背景技术：
摇蚊科(Chironomidae)与大蚊科、蚊科、蠓科、蚋科等一起，同属于双翅目(Diptera)长角亚目(Nematocera)，属完全变态昆虫，整个生长发育过程包括卵、幼虫、蛹和成虫四个阶段。其幼虫又名红虫或血虫，活虫体呈圆筒形，分节，鲜红色。摇蚊没有叮咬人畜的行为，广泛分布于池塘、沟渠、湖泊、水库等水体的淤泥中。摇蚊科幼虫为一种十分重要的底栖动物，以水底与池壁的各种有机物和藻类等为食，摇蚊幼虫在水体沉积物中的活动影响沉积物的性质，对于水环境的生物学和物理性质产生不可忽视的影响。另外，摇蚊也是各种病原体的携带者，可携带伤寒杆菌和副伤寒多种病菌，少数种类可诱发人类哮喘等过敏变态反应疾病。目前，世界上已知摇蚊科种类已达3000余种，广泛分布于俄罗斯，朝鲜，日本，黎巴嫩，欧洲，北美洲和我国。
在城市水库水源中常有大量摇蚊孳生，其虫卵和幼虫随原水进入城市的供水处理工艺设施，由于原水中丰富的藻类等有机营养物质和沉淀池的适宜生存环境而造成摇蚊及其幼虫在供水设施孳生繁殖。其幼虫(俗称红虫)经常穿透砂滤层进入管网，不仅影响水质感官指标，并有传播疾病的潜在危险。
对城市水源和供水系统的红虫防治一直是国内外供水界的一大技术难题，主要原因是红虫繁殖迅速，对环境的耐受力较强，很难与氯接触而被灭活，一般的物理防治方法和化学药剂也无法在水源和供水系统中使用，因而长期以来缺乏行之有效的治理手段。
在对城市水源的昆虫防治中，选择并合理使用无公害药剂十分重要。相比于化学杀虫剂，微生物防治可以高效、低毒、安全地防治水源及水处理过程中的摇蚊幼虫污染，具有特殊优点和广泛的应用前景。用于蚊虫防治的微生物菌株苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp.Iaraelensis，简称Bti)，其伴孢晶体对双翅目昆虫具有专一毒杀作用，在昆虫特有的强碱性中肠环境下溶解并释放出毒性片段，作用于昆虫中肠上皮细胞组织，引起微绒毛区域肿胀、内质网膜空泡形成，伴随核糖体丧失和对线粒体的各种损伤，引发蚊虫的迅速死亡。晶体蛋白对双翅目蚊虫具有特异毒效，对其他包括鱼类、两栖类、鸟类和哺乳动物无毒无害，Bti的灭蚊实践在美国、法国、前苏联、我国、印尼、埃及和西非进行多年，大量的毒理学试验和在世界各国的应用证实它们对环境和其他生物的良好安全性。
Bti一直运用于噬血蚊虫的杀灭，虽然对摇蚊幼虫具有一定毒效(国外已有研究证实)，但从未应用于摇蚊科昆虫防治。经过对国内外相关专利的检索，也未发现有将其应用于水环境尤其是供水系统中摇蚊幼虫的内容。
发明内容
本发明要解决的一个技术问题在于，提供一种摇蚊幼虫杀灭制剂的制备方法，所制备的灭蚊制剂能有效杀灭红虫，并且安全无毒，不产生水体化学污染。用本方法制备的制剂能适用于不同的水体进行灭蚊防治；本发明要解决的另一个技术问题在于，提供一种将上述灭蚊制剂在不同水体杀灭摇蚊幼虫的应用方法。
提供一种摇蚊幼虫杀灭制剂的制备方法，所述制剂是一种液体剂型，所述液体制剂每毫升中苏云金芽孢杆菌以色列亚种的芽孢和伴孢晶体的含量不低于109个，其制备方法包括如下步骤1)将砂土管孢子接种到茄子瓶斜面培养(第一种培养基)，在30℃下扩大培养72小时；2)将培养菌苔加入无菌水30毫升，制成悬浮液，75℃下处理15分钟；3)发酵将悬浮液直接加入发酵缸，培养至芽孢囊破裂释放出芽孢和伴孢晶体(第二种培养基)，发酵时间40小时左右；发酵时，缸温保持在30±1℃；缸压保持在0.3-0.5kg/cm2；通气量每分钟1∶1，搅拌转速220-240rpm；4)将发酵液酸化处理(即用H2SO4调PH至4.3)，并采用板框压滤得到液体剂型的灭蚊制剂。
提供另一种针对摇蚊科幼虫的灭蚊制剂的制备方法，所述制剂是一种粉体剂型，其制备方法包括如下步骤1)将砂土管孢子接种到茄子瓶斜面培养(第一种培养基)，在30℃下扩大培养72小时；2)将培养菌苔加入无菌水30毫升，制成悬浮液，75℃下处理15分钟
3)发酵将悬浮液直接加入发酵缸，培养至芽孢囊破裂释放出芽孢和伴孢晶体(第二种培养基)，发酵时间40小时左右；发酵时，缸温保持在30±1℃；缸压保持在0.3-0.5kg/cm2；通气量每分钟1∶1，搅拌转速220--240rpm；4)将发酵液用填充剂进行吸附，采用板框压滤形成滤饼，将滤饼打浆，再加入助剂，喷雾干燥得到粉剂型灭蚊制剂。
提供另一种针对摇蚊科幼虫的灭蚊制剂的制备方法，所述制剂是一种将发酵菌液喷涂在载体上的固定化剂型，其制备方法包括如下步骤1)将砂土管孢子接种到茄子瓶斜面培养(第一种培养基)，在30℃下扩大培养72小时；2)将培养菌苔加入无菌水30毫升，制成悬浮液，75℃下处理15分钟；3)发酵将悬浮液直接加入发酵缸，培养至芽孢囊破裂释放出芽孢和伴孢晶体(第二种培养基)，发酵时间40小时左右；发酵时，缸温保持在30±1℃；缸压保持在0.3-0.5kg/cm2；通气量每分钟1∶1，搅拌转速220-240rpm；4)将发酵后的菌液均匀喷涂在无纺布载体上，每克无纺布喷涂浓度为10％的发酵菌液约0.5毫升；5)喷涂辅助固定化材料海藻酸钠溶液，每克无纺布的喷涂重量约为0.15克；6)在辅助固定化材料上再一次均匀喷涂浓度为10％的发酵菌液约0.5毫升；7)喷涂主固定化材料聚乙烯醇溶液；每克无纺布的喷涂重量为0.34克
8)自然干燥后封卷，形成固定化灭蚊制剂。
上述制备方法中的第一种培养基由下列重量比的材料构成牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，琼脂1.5-2.0％，PH值为7.0-7.2，在1.05Kg/cm2的压力和121.3℃的条件下灭菌20分钟制得。
上述制备方法中的第二种培养基由下列重量比的材料构成玉米浆2％，大豆粉2.5％，玉米淀粉2％，其他无机盐，PH值为7.2，在1.05Kg/cm2的压力和121.3℃的条件下灭菌20分钟制得。
在上述制备方法中，每克无纺布中含有海藻酸钠0.15g，聚乙烯醇0.34g，液剂产品1.2克，水5毫升。
以上三种产品中包含的苏云金芽孢杆菌以色列亚种芽孢和伴孢晶体具有如下特征芽孢呈卵圆形，直径1.0×1.5μm，对不良环境具有较强的抗性，在适宜环境下可萌发为苏云金杆菌营养体。具耐热性(可在75℃处理20分钟后存活)。
伴孢晶体是近似球形的复合蛋白质聚合物，大小不等，直径范围0.5～1.2μm，并含有葡萄糖和甘露糖等糖类成分。
伴孢晶体蛋白在昆虫中肠强碱性环境下被蛋白酶水解，成为24～25kDa的毒性多肽，产生对作用昆虫的强烈毒性。芽孢增强伴孢晶体对昆虫的毒力。
以上所述的砂土管孢子指一种菌种保藏方式，即将上述菌种放置在抽真空的灭菌沙土管中进行保存。
将制得的液体剂型或粉体剂型灭蚊制剂应用在池塘等静水水域杀灭摇蚊幼虫，液体灭蚊剂的使用浓度为100ppm，粉剂的使用浓度为20ppm，按估计水量每天喷洒，持续15天，使用周期为30天。
将制得的固定化剂型灭蚊制剂应用在流动水域中进行水处理，沿池壁一米以上布设固定化剂型灭蚊制剂，每10天更换一次，使用周期为30天。
采用上述方法制得的灭蚊制剂进行供水环境中孳生红虫的杀灭具有如下优点经过对苏云金芽孢杆菌以色列亚种发酵得到的芽孢和伴孢晶体，对摇蚊科昆虫花翅摇蚊具有特殊毒杀作用，可安全、经济、有效地防治供水环境中孳生的红虫，解决困扰城市水处理的技术难题，所制得的菌剂适合于在水源和水处理工艺中应用，具有稳定高效的红虫杀灭效果。经测试，80ppm浓度内24小时对3龄红虫幼虫的杀灭率达到98％。采用微生物对城市水源和供水设施中孳生的摇蚊污染进行治理，符合环保、低残留的要求，具有高效、安全的特点。所提供的多种剂型适用于不同水域。
供水系统是典型的流动系统，现有的其它类型的嗜血蚊虫杀灭生物制剂只能应用于池塘、水沟等静止或水流平缓的水体。菌体固定剂型具有高效、浓缩、缓释、保持长期毒效的优点。
饮用水生产有很高的水质安全要求，为避免在水处理环境中造成细菌和杀虫蛋白污染、影响水质的有机物指标和毒理学指标，通过固定化技术，并配合混凝、消毒、过滤等水处理工艺，在应用微生物制剂进行红虫控制后能最大限度地消除微生物和杀晶体蛋白的出水残留，保证水质安全。
应用微生物灭蚊制剂后，处理出水的以下指标可达到国家饮用水安全卫生标准出厂水中细菌总数、CODMn、致突变指标(Ames试验)。
具体实施例方式
本发明采用的苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bti)是苏云金杆菌中对蚊幼虫有特异毒性的亚种，血清型为H14，其毒效特点是对鳞翅目昆虫无毒，而对双翅目昆虫(主要是蚊虫)有特异毒效。苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bti)具有以下的生物学特征营养体呈杆状，约4.2～5.8×1.2～1.3um，格兰氏反应阳性，能在多种培养基上生长。其孢子囊长卵圆形，一端形成卵形芽孢，另一端产生伴孢晶体。孢子囊到一定时间后破裂，释放出游离的伴孢晶体和孢子。
在普通肉汁蛋白胨培养基上菌落表面粗糙且隆起，暗白色，产生淡紫色素，边缘稍薄，不整齐。斜面菌苔边缘呈假根状。
在肉汤培养基中形成薄膜，易摇碎成片状下沉。
实施例一制备液体剂型的灭蚊制剂，1)将砂土管孢子接种到茄子瓶斜面培养，(第一种培养基)，在30℃下扩大培养72小时；2)将培养菌苔加入无菌水30毫升，制成悬浮液，75℃下处理15分钟；3)发酵将悬浮液直接加入发酵缸，培养至芽孢囊破裂释放出芽孢和伴孢晶体(第二种培养基)，发酵时间40小时左右；发酵时，缸温保持在30±1℃；缸压保持在0.3-0.5kg/cm2；通气量每分钟1∶1，搅拌转速220-240rpm；4)将发酵液酸化处理(即用H2SO4调PH至4.3)，并采用板框压滤得到液体剂型的灭蚊制剂。
第一种培养基由下列重量比的材料构成牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，琼脂1.5-2.0％，PH值为7.0-7.2，在1.05Kg/cm2的压力和121.3℃的条件下灭菌20分钟制得。
第二种培养基由下列重量比的材料构成玉米浆2％，大豆粉2.5％，玉米淀粉2％，其他无机盐，PH值为7.2，在1.05Kg/cm2的压力和121.3℃的条件下灭菌后制得。
发酵缸的容量为15吨；缸内投料60％；将液体剂型应用于池塘等静水水域中的摇蚊幼虫治理时，使用浓度为100ppm，按估计水量每天喷洒，持续15天，使用周期为30天。
实施例二制备粉剂型灭蚊制剂的方法，在实施例一中的发酵步骤完成后采用如下步骤制备粉剂将发酵液用填充剂碳酸钙进行吸附，采用板框压滤形成滤饼，将滤饼打浆，再加入助剂碳酸钙，喷雾干燥得到粉剂型灭蚊制剂。
将制得的粉体剂型灭蚊制剂应用于池塘等静水水域的摇蚊幼虫治理时，使用浓度为20ppm，按估计水量每天喷洒，持续15天，使用周期为30天。
实施例三在实施例一中的发酵步骤完成后采用如下步骤可制得固定型灭蚊制剂将发酵后的菌液均匀喷涂在无纺布载体上，每克无纺布喷涂浓度为10％的液剂0.5毫升；在菌液表面喷涂辅助固定化材料海藻酸钠溶液，每克无纺布的喷涂0.15克；在辅助固定化材料上再一次均匀喷涂浓度为10％的发酵菌液0.5mL；在菌液表面喷涂主固定化材料聚乙烯醇(PVA)溶液，每克无纺布的喷涂重量0.34克；自然干燥后封卷得到固定在载体上的灭蚊制剂。
在每克无纺布中含有海藻酸钠0.15克，聚乙烯醇0.34克，液剂产品1.2克，水5毫升。
制得的固定化剂型灭蚊制剂应用在流动水域摇蚊幼虫治理，可沿池壁一米以上布设固定化剂型灭蚊制剂，每10天更换一次，使用周期为30天。
固定化材料不影响Bti对蚊幼虫毒力效果，使用的固定化材料不影响水质安全。其生产方法和工艺方便简便快捷，适宜大规模生产；在有效使用期限内能有效固定于水厂沉淀池的池壁和斜板等处，适宜在水厂沉淀池应用；易于保存；对花翅摇蚊幼虫24小时致死率达到98％；具有缓释杀虫晶体能力，其有效使用期限为15天。
用于水处理环境时，须依照氯离子浓度、光照、混凝剂等水处理因素制定最佳投药周期和频率，确定投放量、投放点等，保证沉淀池红虫的杀灭率，并采用相关安全控制应用技术，包括定期进行生物制剂的清除或回收、调整混凝强度、过滤截留能力和加氯消毒等相关水处理工艺参数等手段。
权利要求
1.一种采用苏云金芽孢杆菌以色列亚种制备摇蚊幼虫杀灭制剂的方法，所述制剂为液体剂型，所述液体制剂每毫升中苏云金芽孢杆菌以色列亚种的芽孢和伴孢晶体的含量不低于109个，其制备方法包括如下步骤1)将砂土管孢子接种到茄子瓶斜面培养，在瓶中放入第一种培养基，在30℃下扩大培养72小时；2)将培养菌苔加入无菌水30mL，制成悬浮液，在75℃下处理15分钟；3)发酵将悬浮液直接加入发酵缸，培养至芽孢囊破裂释放出芽孢和伴孢晶体，在缸中放入第二种培养基，发酵时间40小时左右；发酵时，缸温保持在30±1℃；缸压保持在0.3-0.5kg/cm2；通气量每分钟1∶1，搅拌转速220-240rpm；4)将发酵液酸化处理，用H2SO4调PH至4.3，并采用板框压滤得到液体剂型的灭蚊制剂。
2.一种采用苏云金芽孢杆菌以色列亚种制备摇蚊幼虫杀灭制剂的制备方法，所述剂型为粉体剂型，其制备方法包括如下步骤1)将砂土管孢子接种到第一种培养基，30℃下在茄子瓶斜面扩大培养72小时；2)将培养菌苔加入无菌水30mL，制成悬浮液，75℃下处理15分钟；3)发酵将悬浮液直接加入发酵缸，在第二种培养基中培养至芽孢囊破裂释放出芽孢和伴孢晶体，发酵时间40小时左右；发酵时，缸温保持在30±1℃；缸压保持在0.3-0.5kg/cm2；通气量每分钟1∶1，搅拌转速220-240rpm；4)将发酵液用填充剂进行吸附，采用板框压滤形成滤饼，将滤饼打浆，再加入助剂，喷雾干燥得到粉剂型灭蚊制剂。
3.一种采用苏云金芽孢杆菌以色列亚种制备摇蚊科幼虫杀灭制剂的制备方法，所述制剂是一种发酵菌液经载体固定的固定化剂型，其制备方法包括如下步骤1)将砂土管孢子接种到第一种培养基，30℃下在茄子瓶斜面扩大培养72小时；2)将培养菌苔加入无菌水30mL，制成悬浮液，75℃下处理15分钟；3)发酵将悬浮液直接加入发酵缸，在第二种培养基中培养至芽孢囊破裂释放出芽孢和伴孢晶体，发酵时间40小时左右；发酵时，缸温保持在30±1℃；缸压保持在0.3-0.5kg/cm2；通气量每分钟1∶1，搅拌转速220-240rpm；4)将发酵后的菌液均匀喷涂在无纺布载体上，每克无纺布喷涂浓度为10％的发酵菌液约0.5毫升；5)喷涂辅助固定化材料海藻酸钠溶液，每克无纺布的喷涂重量约为0.15克；6)在辅助固定化材料上再一次均匀喷涂浓度为10％的发酵菌液约0.5毫升；7)喷涂主固定化材料聚乙烯醇溶液；每克无纺布的喷涂重量为0.34克；8)自然干燥后封卷，形成固定化的灭蚊制剂。
4.根据权利要求1或2或3所述制备方法，其特征在于，所述第一种培养基由下列重量比的材料构成牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，琼脂1.5-2.0％，PH值为7.0-7.2，在1.05Kg/cm2的压力和121.3℃的条件下灭菌20分钟制得。
5.根据权利要求1或2或3所述制备方法，其特征在于，所述第二种培养基由下列重量比的材料构成玉米浆2％，大豆粉2.5％，玉米淀粉2％，其他无机盐，PH值为7.2，在1.05Kg/cm2的压力和121.3℃的条件下灭菌后制得。
6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，每克无纺布中含有海藻酸钠0.15克，聚乙烯醇0.34克，液剂产品1.2克，水5mL。
7.将权利要求1制得的液体剂型应用在池塘等静水域中进行蚊幼虫杀灭，其特征在于，液剂的使用浓度为100ppm，按估计水量每天喷洒，持续15天，使用周期为30天。
8.将权利要求2制得的粉体剂型灭蚊制剂应用在池塘等静水域中进行进行蚊幼虫杀灭，其特征在于，粉剂的使用浓度为20ppm，按估计水量每天喷洒，持续15天，使用周期为30天。
9.将权利要求3制得的固定化剂型灭蚊制剂应用在流动水域中进行蚊幼虫杀灭，其特征在于，沿池壁一米以上布设固定化剂型灭蚊制剂，每10天更换一次，使用周期为30天。
10.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述填充剂和助剂是碳酸钙。
全文摘要
本发明公开了一种采用苏云金芽孢杆菌以色列亚种制备摇蚊幼虫杀灭制剂的制备及应用方法，其制备方法包括如下步骤将砂土管孢子接种到茄子瓶斜面培养基上扩大培养，培养物用无菌水制成悬浮种子液，将种子液加入发酵缸培养至芽孢囊破裂释放出芽孢和伴孢晶体，对发酵液进行后处理得到液剂、粉剂或固定剂型的制剂；此种制剂对花翅摇蚊具有特殊毒效，使用浓度内24小时对3龄幼虫的杀灭率达到98％。采用此种微生物制剂对城市水源和供水设施中孳生的摇蚊污染进行治理，符合环保、低残留的要求，多种剂型适用于不同特征水域，具有高效、浓缩、缓释的优点。
文档编号A01N63/02GK1515162SQ0311355
公开日2004年7月28日 申请日期2003年1月10日 优先权日2003年1月10日
发明者张金松, 周令, 雷萍, 梁明 申请人:深圳市水务(集团)有限公司