朊病毒蛋白活性降低的转基因有蹄类动物及其用途的制作方法

专利名称：朊病毒蛋白活性降低的转基因有蹄类动物及其用途的制作方法
背景技术：
总体而言，本发明的特征在于克隆的转基因有蹄类动物(例如牛)，其中朊病毒蛋白(PrP)的活性通过一个或多个遗传工程化的突变被降低。由于这种朊病毒活性降低的转基因牛对朊病毒相关疾病例如牛海绵状脑病(BSE，也称作疯牛病)具有抗性，因此它们是农产品和药品如人的治疗性抗体的更安全和更优选的来源。
自从1986年英国发现首例BSE以来，这种传染性疾病已经传播到世界的其他地区，例如日本。这种疾病的危害已经对农业和制药业产生极大的影响，限制了牛产品在这些产业中的使用。
基于十多年来的研究，朊病毒已经被确定是这种传染性疾病的真正诱因。朊病毒蛋白活性降低的动物具有期望的对朊病毒蛋白相关感染的抗性，因此，是人们所期待的。
迄今，在容易进行同源重组的鼠胚胎干(ES)细胞中使用常规的基因打靶方法，已经创造了朊病毒蛋白活性降低的转基因小鼠。但是，对有蹄类动物例如牛的ES细胞进行分离、培养和遗传修饰是困难的。
由于朊病毒蛋白基因在胎儿成纤维细胞中的表达非常活跃，在朊病毒蛋白敲除的一代绵羊中，用无启动子的敲除(KO)载体转染胎儿成纤维细胞(Denning等，Nature Biotech.，19559-562，2001)。通过使用这种类型载体，由于敲除载体中的无启动子的抗药性基因(例如抗新霉素或抗嘌呤霉素基因)仅当被整合到活跃表达的基因座位上时被表达，因此，可以使用适当的药物例如G418或嘌呤霉素来选择同源打靶的克隆。
然而，通过核移植这些半合子打靶的绵羊成纤维细胞仅获得一只活羔羊，并且该羔羊在出生后约12天便死亡了。与具有无限长寿命的鼠ES细胞不同，机体成纤维细胞的寿命是有限的，由于进行严格的药物筛选来选择期望的敲除细胞时需要培养细胞的时间长，使得体细胞基因打靶十分困难。此外，总的来说，机体成纤维细胞中发生同源重组的频率比鼠ES细胞要低约10-100倍。这些与机体成纤维细胞相关的限制以及常规的核移植方法的低成功率使得制备具有期望的点特异性突变的活家畜是困难的。
已经在牛中进行了通过基因打靶来降低朊病毒蛋白活性的尝试。据我们所知，还未报导成功地生产在朊病毒基因座上具有突变的转基因牛，这可能是由于缺乏合适的敲除载体和/或核移植方法。因此，需要改进的敲除载体来有效地突变有蹄类动物细胞(例如牛细胞)中的朊病毒基因座位。此外，用于从这些遗传修饰的供体细胞来生产转基因有蹄类动物(例如牛)的改进方法也是期望的。
发明概述本发明的特征在于设计敲除载体，使用该载体，可以在供体细胞例如胎儿机体成纤维细胞中在有蹄类动物(例如牛)的朊病毒基因座位上实现高频率的半合子和纯合子打靶整合(所谓的同源重组)。本发明的特征还在于在本文描述的任何核移植方法中用遗传修饰的供体制备在朊病毒基因座位上具有半合子或纯合子突变的活的小牛。这些牛可以被用于制备药品和农产品，例如人用的治疗性人抗体。
本发明的方法是采用多种技术，例如(i)在此描述的朊病毒基因敲除细胞，(ii)哺乳动物克隆方法如核移植或PCT公开WO02/051997中描述的染色体移植，和(iii)将人工染色体(HAC)例如δHAC导入有蹄类动物(PCT公开WO02/70648；Kuroiwa等，Nature Biotechnol.20889-894，2002)来实现的。在哺乳动物克隆方法中，朊病毒敲除的有蹄类细胞被用作供体遗传物质的来源，产生朊病毒敲除(半合子或纯合子)的后代。
朊病毒敲除的有蹄类动物还具有其他的有用特征，例如产生人的抗体。可以采用上述技术的组合来生产这种有蹄类动物。例如，可以通过杂交朊病毒敲除的有蹄类动物和如PCT公开WO02/70648中描述的生产人抗体的有蹄类动物来生成朊病毒敲除的并产生人抗体的牛。无论是否进行有蹄类动物的繁育，连续操作胎儿成纤维细胞也可以被用于生产这种有蹄类动物。牛胎儿成纤维细胞的连续操作包括重复如下步骤(i)遗传操作有蹄类动物(例如牛)的成纤维细胞，(ii)使用这种细胞进行哺乳动物克隆，(iii)胎儿生成，和(iv)分离遗传修饰的胎儿成纤维细胞。例如，可以连续地操作朊病毒敲除的成纤维细胞来保留HAC，并灭活内源性Ig基因。
生成的单克隆或多克隆异种抗体具有各种用途；例如，被用作预防或治疗病原微生物例如细菌或病毒感染的组合物的成分。
转基因有蹄类动物和有蹄类动物细胞一个方面，本发明提供一种有蹄类动物(例如牛)或有蹄类动物细胞(例如牛细胞)，其在内源性朊病毒核酸的一个或两个等位基因上具有非天然发生的突变(例如起始ATC密码子后的突变，例如在该密码子的10、20、50或100个核苷酸内的突变)。优选地，该突变降低或基本上消除功能性朊病毒蛋白的表达。在一个优选实施方案中，功能性或全部朊病毒蛋白的表达降低了至少10、20、40、60、80、90、95或100％。突变是半合子或纯合子的。在有些实施方案中，突变包括将阳性选择标记(例如抗生素抗性基因)插入到朊病毒核酸中。优选地，阳性选择标记被可操作地连接到异种的启动子上。对于在朊病毒核酸的两个等位基因上插入抗生素抗性基因的有蹄动物或有蹄动物细胞来说，各个等位基因上可能含有相同或不同的抗生素抗性基因。在一个优选实施方案中，阴性选择标记(例如DT-A或Tk)被可操作地连接到异种的启动子上，并且存在于用来突变内源性朊病毒等位基因的载体上。该突变可能包括或不包括朊病毒核酸中的一个或多个核苷酸(例如连续的核苷酸)的删除。
在上述方面的一个优选实施方案中，有蹄类动物(例如牛)或有蹄类动物细胞(例如牛细胞)具有一个或多个转基因，并且表达mRNA或由转基因编码的蛋白质(例如抗体)。优选的有蹄类动物含有人染色体的自然排列区段(例如人染色体片段)或包含人为工程化的人染色体片段(即，相对于人基因组，该片段被重排)的人工染色体。在一些实施方案中，异种核酸包含在染色体片段中。该核酸被整合到有蹄类动物的染色体中或者在有蹄类动物细胞中保持独立于宿主染色体。在各种实施方案中，核酸被包含在染色体片段如ΔHAC或ΔΔHAC中。在其他实施方案中，异种抗体是来自其他种属的抗体，例如人的抗体。
优选的有蹄类动物和有蹄类动物细胞在一个或多个B细胞中含有一个或多个具有异种抗体基因座位(例如编码异种免疫球蛋白(Ig)基因的全部或部分的核酸，该免疫球蛋白基因发生重排并且表达至少一种异种Ig分子)。优选地，核酸具有未被重排的抗体的轻链核酸片段，其中通过一个或多个核苷酸将编码V基因片段的所有核酸片段与编码J基因片段的核酸片段分离。其他优选的核酸具有未被重排的抗体重链核酸片段，其中(i)通过一个或多个核苷酸将所有编码V基因片段的核酸片段与所有编码D基因片段的核酸片段分离和/或(ii)通过一个或多个核苷酸将所有编码D基因片段的核酸片段与所有编码J基因片段的核酸片段分离。其他优选的有蹄类动物具有一条或多条编码重排的异种免疫球蛋白(Ig)基因的全部或部分的核酸，该免疫球蛋白基因编码至少一种异种Ig分子。
在其他优选的实施方案中，异种抗体的轻链和/或重链由人核酸编码。在优选的实施方案中，重链是任何类型的重链，例如μ、γ、δ、ε或α，轻链是λ或κ轻链。在其他优选的实施方案中，编码异种免疫球蛋白链或抗体的核酸是未被重排的形式。在其他优选的实施方案中，由有蹄类动物生成一种以上异种抗体。在各种实施方案中，由有蹄类动物生成一种以上的不同异种Ig或抗体。异种抗体可以是单克隆或多克隆抗体。
在上述方面的各种实施方案中，有蹄类动物(例如牛)或有蹄类动物细胞(例如牛细胞)具有降低异种抗体表达的突变。优选地，该突变降低功能性IgM重链的表达或者基本上消除功能性IgM重链的表达。在其他优选的实施方案中，该突变降低功能性Ig轻链的表达或者基本上消除功能性Ig轻链的表达。在还有的其他优选实施方案中，该突变降低功能性IgM重链和功能性Ig轻链的表达，或者基本上消除功能性IgM重链和功能性Ig轻链的表达。优选地，有蹄类动物在编码β-(1，3)-半乳糖苷转移酶和/或J链的内源性核酸的一个或两个等位基因上具有突变。在其他优选实施方案中，有蹄类动物具有编码异种J链如人的J链的核酸。优选地，该突变降低或消除内源性β-(1，3)-半乳糖苷转移酶、半乳糖基(αl，3)半乳糖表位和/或J链的表达。优选地，有蹄类动物产生人的IgA或含有人J链的IgM分子。优选的有蹄类动物细胞(例如牛细胞)包括体细胞，例如胎儿成纤维细胞或B细胞。
本发明的特征还在于生产异种(例如人)抗体的杂交瘤。在一个方面，本发明提供由本发明的B细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤。优选地，抗体与感兴趣的抗原具有反应活性。
生产转基因有蹄类动物细胞的方法本发明的特征还在于生产在朊病毒核酸的一个或两个等位基因上具有突变的有蹄类动物细胞(例如牛细胞)的方法。这些细胞可以被用作供体细胞来生产转基因的有蹄类动物(例如牛朊病毒敲除的有蹄类动物)。优选地，该突变使得功能性朊病毒蛋白的含量降低和/或与朊病毒相关的感染或疾病例如BSE减少。
因此，在一个方面中，本发明的特征在于制备转基因有蹄类动物(例如牛)的方法。该方法包括在允许第一个载体与细胞中的内源性朊病毒核酸的第一个等位基因发生同源重组的条件下，将第一个朊病毒打靶载体导入有蹄类动物细胞中，从而将半合子突变导入细胞中。优选地，第一个载体包括具有与该细胞的内源性朊病毒核酸的第一个区域基本上相同的序列的第一个同源区域、阳性选择标记和具有与该细胞的内源性朊病毒核酸的第二个区域基本上相同的序列的第二个同源区域。在优选的实施方案中，一个同源区域至少比另一个同源区域长1、2、3、4、5、6或8kb。优选地，该方法还包括在允许第一个载体与内源性朊病毒核酸的第二个等位基因之间，在细胞内发生同源重组的条件下，将第一个载体再次导入到细胞中，从而在细胞中导入纯合子突变。在其他实施方案中，该方法还包括在允许第二个载体与内源性朊病毒核酸的第二个等位基因之间，在细胞内发生同源重组的条件下，将具有不同于第一个载体的抗生素抗性基因的第二个朊病毒基因打靶载体导入细胞中，从而在细胞中导入纯合子突变。优选地，在存在1mM亚精胺时，将第一个和/或第二个载体导入细胞中。优选的细胞包括牛胎儿成纤维细胞。
在本发明的各种实施方案中，用于突变内源性朊病毒核酸的核酸(例如，包括可操作地连接到编码可选择的标记的核酸和可选择地连接到具有与朊病毒核酸基本上相同的序列的核酸上的启动子的敲除盒)不被包含在病毒载体，例如腺病毒载体或腺伴随病毒载体中。例如，可以采用标准方法例如不涉及细胞的病毒转染的转染或脂转染，将该核酸被包含在质粒或人工染色体中，将质粒或人工染色体导入有蹄类动物细胞中。在还有另一个实施方案中，将用于突变内源性朊病毒核酸的核酸(例如包括可操作地连接到编码可选择的标记的核酸和可选择地连接到具有与朊病毒核酸基本上相同的序列的核酸上的启动子的敲除表达盒)包含在病毒载体，例如腺病毒载体或腺伴随病毒载体中。按照该实施方案，将含有病毒载体的病毒用于感染有蹄类动物细胞，使得在有蹄类细胞中插入部分或整个的病毒载体。
制备转基因有蹄类动物的方法本发明还提供用于制备在内源性朊病毒核酸中具有一个或多个突变的转基因有蹄类动物的方法。这种方法的一种包括将本发明的上述方面的任何一种细胞、来自该细胞的染色质或者来自该细胞的细胞核插入到卵母细胞中。该细胞在内源性朊病毒核酸中具有第一个突变。在使卵母细胞或胚胎发育成胎儿的条件下，将卵母细胞或者由该卵母细胞形成的胚胎移植到宿主有蹄类动物的子宫中。优选地，该胎儿发育成可存活的后代。
在优选的实施方案中，通过插入包含盒的核酸来将第一个突变导入细胞中，该盒包括被可操作地连接到编码可选择的标记的核酸上并且被可操作地连接到一条或多条具有与内源性朊病毒核酸基本上相同的序列的核酸上的启动子，该盒被整合到朊病毒核酸的一个内源性等位基因上。在其他优选的实施方案中，通过插入包含第一个盒的核酸来将突变导入细胞中，该盒包括被可操作地连接到编码第一个可选择标记的核酸上并且被可操作地连接到第一条具有与内源性朊病毒核酸基本上相同的序列的核酸上的第一个启动子，从而将第一个盒整合到朊病毒核酸的第一个内源性等位基因上，生成第一个转基因细胞。往第一个转基因细胞中插入包括第二个盒的核酸，该盒包括被可操作地连接到编码第二个可选择标记的核酸上并且被可操作地连接到第二条具有与内源性朊病毒核酸基本上相同的序列的核酸上的第二个启动子。第二个可选择的标记区别于第一个可选择的标记，并且第二个盒被整合到朊病毒核酸的第二个内源性等位基因上，生成第二个转基因细胞。
在还有其他优选的实施方案中，从胚胎、胎儿或由胎儿生成的后代中分离细胞，将其他突变导入到该细胞的朊病毒核酸或另一种核酸(例如抗体重链或轻链核酸)中。然后用生成的细胞、来自该细胞的染色质或来自该细胞的细胞核进行第二轮核移植，生成具有两个或多个突变的转基因有蹄类动物。该突变发生在一种基因的相同或不同等位基因上或者发生在不同基因上。用于第一轮或任选的第二轮核移植中的细胞编码异种抗体。在特定的实施方案中，该细胞包括一种或多种编码异种Ig基因的全部或部分的核酸，这些Ig基因能够在B细胞中发生重排并表达一种或多种异种Ig分子。在优选的实施方案中，被突变的细胞是成纤维细胞(来胎儿成纤维细胞)。优选地，被突变的内源性基因被可操作地连接到内源性启动子上，该启动子在成纤维细胞中是无活性的。在其他优选的实施方案中，被可操作地连接到突变的内源性基因上的内源性启动子的活性比可操作地连接到内源性管家基因例如GAPDH的内源性启动子的活性低80、70、60、50、40、30、20、10％。可以采用标准分析来测定启动子的活性，例如测量mRNA或由基因编码的蛋白质的水平的分析(参见，例如Ausubel等CurrentProtocols in Molecular Biology，第2卷，第11.13.1-11.13.3页，John Wiley& Sons，1995)。这种用于生产转基因有蹄类等位的方法具有使在供体细胞(即作为核移植的遗传物质来源的细胞)中不被表达的基因发生突变的优点。
优选地，用于生产转基因有蹄类动物的细胞在编码β-(1，3)-半乳糖苷转移酶和/或J链的内源性核酸的一个或两个等位基因上具有突变。在其他优选的实施方案中，该细胞具有编码异种J链，例如人J链的核酸，或者编码异种抗体的核酸。优选地，异种核酸编码异种Ig基因的全部或部分，该基因能够在B细胞中发生重排并编码一种以上异种Ig分子。在其他优选的实施方案中，该抗体是多克隆抗体。在还有其他优选的实施方案中，免疫球蛋白链或抗体被表达在血清和/或乳汁中。
本发明人先前已经公开了各种用于克隆哺乳动物(例如有蹄类动物如牛)的改进方法，用于克隆在朊病毒核酸上具有一个或多个突变的哺乳动物(参见，美国专利公开2002-0046722 A1和PCT公开W002/051997)。在一些这些方法中，用再编程培养基(reprogrammingmedia)(例如细胞提取物)培养被透化处理的细胞以允许往细胞中加入或者从细胞中去除各种因子，然后重新封闭被透化处理的细胞的质膜以包含期望的因子并恢复细胞膜的完整性。这些方法中的一些还包括将供体核(例如供体细胞中的被分离的细胞核)浓缩为染色质，以释放细胞核成分例如可以促进对于将核移植胚胎发育为活的后代来说是不期望的基因转录的转录因子。如果需要，任何这些方法的步骤可以重复一次或多次或者可以顺序地进行不同的再编程方法来增加再编程的程度，使克隆胎儿具有更大的存活力。
用于生产转基因有蹄类动物(例如牛)的一种方法包括，在允许从被透化处理的细胞的细胞核、染色质或染色体中去除成分(例如细胞核或细胞质成分，例如转录因子)或往细胞核、染色质或染色体中加入成分的条件下，用再编程培养基(例如细胞提取物)培养任何本发明的上述方面的被透化处理的细胞(例如在内源性朊病毒核酸中具有一个或多个突变的细胞)，从而生成再编程的细胞。将再编程的细胞插入到去核的卵母细胞中，并且在使卵母细胞或胚胎发育成胎儿的条件下，将生成的卵母细胞或由该卵母细胞形成的胚胎转移到宿主有蹄类动物的子宫中。在优选的实施方案中，在允许形成染色质的条件下，将被透化处理的细胞与如下的一种或多种接触在存在或缺乏抗-NuMA抗体时的有丝分裂提取物、去垢剂和/或盐溶液，或者蛋白激酶溶液。在还有另一个优选的实施方案中，被透化处理的细胞与间期再编程培养基(例如间期细胞提取物)培养。在还有另一个优选的实施方案中，被透化处理的细胞中的细胞核仍然是膜的结合，并且细胞核中的染色体在用间期再编程培养基培养过程中不发生浓缩。在某些实施方案中，在再编程培养基中培养被透化处理的细胞不会引起DNA复制或者仅引起该细胞的少于50、40、30、20、10或5％的DNA复制。在其他实施方案中，在再编程培养基中培养被透化处理的细胞，在至少60、70、80、90、95或100％的细胞中引起DNA复制。在各种实施方案中，通过用蛋白酶例如胰岛素、去垢剂例如地高辛或者细菌毒素例如链球菌溶血素O培养完整细胞来生成被透化处理的细胞。在优选实施方案中，不在允许再编程细胞的膜在插入到卵母细胞之前再封闭的条件下培养再编程细胞。在还有另一个实施方案中，在允许再编程细胞的膜在插入到卵母细胞之前再封闭的条件下培养再编程细胞。在其他优选实施方案中，重构的卵母细胞或者生成的胚胎以比具有相同数量和来自相同物种的对照卵母细胞或对照胚胎所表达的相应水平高至少5倍的水平表达核纤层蛋白A、核纤层蛋白C或NuMA蛋白。
在另一个方面，本发明提供用于生产转基因有蹄类动物(例如牛)的另一种方法。这种方法包括(a)在允许染色质形成而不引起DNA复制的条件下培养来自本发明的细胞的供体核(例如在内源性朊病毒核酸中具有一个或多个突变的细胞核)，(b)将染色质插入到去核的卵母细胞中，从而形成核移植卵母细胞和(c)在允许核移植卵母细胞或胚胎发育为胎儿的条件下，将核移植卵母细胞或由核移植卵母细胞形成的胚胎转移到宿主有蹄类动物的子宫中。在优选实施方案中，在允许往细胞核或生成的染色质中加入或去除细胞核或细胞质成分例如转录因子、阻抑蛋白或染色质重塑蛋白的条件下，用再编程培养基(例如细胞提取物)培养供体核。优选地，在允许染色质形成的条件下，将供体核与一种或多种如下物质接触在存在或缺乏抗-NuMA抗体时的有丝分裂提取物、去垢剂和/或盐溶液，或者蛋白激酶溶液。重构的卵母细胞或者生成的胚胎以比具有相同数量的细胞并且来自相同物种的对照卵母细胞或对照胚胎所表达的相应水平高至少5倍的水平表达核纤层蛋白A、核纤层蛋白C或NuMA蛋白。优选地，该细胞核具有少于四套的同源染色体(即，具有少于两对完整的染色单体)。
生产嵌合有蹄类动物的优选方法其他的优选的有蹄类动物是使用来自两种或多种胚胎的细胞制备的嵌合有蹄类动物。例如，可以将来自核移植胚胎(例如通过将细胞、细胞核或染色质插入到去核的卵母细胞中形成的胚胎)的细胞与来自体外受精的、天然的或者孤雌生殖激活的胚胎的细胞结合。优选地，大部分来自核移植胚胎的细胞及其后代被结合到生成的嵌合胚胎的胎儿组织中。至少部分来自第二种胚胎的细胞及其后代被优选地结合到胎盘组织中，并且增强生成的嵌合胚胎的存活能力。在优选的实施方案中，核移植胚胎在内源性朊病毒核酸中具有突变，并且具有编码异种抗体的核酸。
因此，在一个方面，本发明提供通过将本发明的细胞、细胞核或染色质(例如，在内源性朊病毒核酸中具有突变并且可选择地具有一种或多种编码异种抗体的核酸的细胞、细胞核或染色质)插入卵母细胞来制备转基因有蹄类动物的方法，从而生成第一种胚胎。来自第一种胚胎的一个或多个细胞与来自第二种胚胎的一个或多个细胞接触，从而形成第三种胚胎。第二种胚胎是体外受精的胚胎、天然发生的胚胎或孤雌生殖激活的胚胎。在允许第三种胚胎发育成胎儿的条件下将第三种胚胎移植到宿主有蹄类动物的子宫中。
在另一个相关方面，本发明提供还有另一种生产转基因有蹄类动物(例如牛)的方法。这种方法包括在允许从被透化处理的细胞的细胞核、染色质或染色体中去除一种因子或者由再编程培养基往细胞核、染色质或染色体中加入一种因子的条件下，在再编程培养基(例如细胞提取物)中培养本发明的被透化处理的细胞(例如在内源性朊病毒核酸中具有突变并且任选地具有一种或多种编码异种抗体的核酸的细胞)，从而形成再编程细胞。将再编程细胞插入到去核的卵母细胞中，从而形成第一种胚胎。来自第一种胚胎的一个或多个细胞与来自体外受精的、天然的或孤雌生殖激活的第二种胚胎的一个或多个细胞接触，生成第三种胚胎。在允许第三种胚胎发育成胎儿的条件下将第三种胚胎移植到宿主有蹄类动物的子宫中。
在优选的实施方案中，在允许细胞核或细胞质成分例如转录因子被加入到或者从细胞核或生成的染色质中去除的条件下，用再编程培养基(例如细胞提取物)培养被透化处理的细胞。在其他优选实施方案中，在允许染色质形成的条件下，使被透化处理的细胞与如下一种或多种接触在存在或缺乏抗-NuMA抗体时的有丝分裂提取物、去垢剂和/或盐溶液，或者蛋白激酶溶液。在还有另一个优选实施方案中，将被透化处理的细胞用间期再编程培养基(例如间期细胞提取物)培养。在还有另一个优选实施方案中，被透化处理的细胞中的细胞核仍然是膜结合的，并且细胞核中的染色体在用间期再编程培养基培养过程中不发生浓缩。在某些实施方案中，在再编程培养基中培养被透化处理的细胞不会引起DNA复制或者仅引起该细胞的少于50、40、30、20、10或5％的DNA复制。在其他实施方案中，在再编程培养基中培养被透化处理的细胞，在至少60、70、80、90、95或100％的细胞中引起DNA复制。在各种实施方案中，通过用蛋白酶例如胰岛素、去垢剂例如地高辛或者细菌毒素例如链球菌溶血素O培养完整细胞来生成被透化处理的细胞。在优选实施方案中，不在允许再编程细胞的膜在插入到卵母细胞之前再封闭的条件下培养再编程细胞。在还有另一个实施方案中，在允许再编程细胞的膜在插入到卵母细胞之前再封闭的条件下培养再编程细胞。
在还有另一个实施方案中，通过在允许染色质形成的条件下，用再编程培养基(例如细胞提取物)培养来自本发明的细胞的供体核(例如在内源性朊病毒核酸中具有突变并且任选地具有一种或多种编码异种抗体的核酸的细胞核)，并将染色质插入到去核的卵母细胞中，从而形成第一种胚胎。来自第一种胚胎的一个或多个细胞与来自体外受精的、天然的或孤雌生殖激活的第二种胚胎的一个或多个细胞接触，生成第三种胚胎。在允许第三种胚胎发育成胎儿的条件下将第三种胚胎移植到宿主有蹄类动物的子宫中。在优选的实施方案中，通过在允许染色质形成而不引起DNA复制的条件下，将具有少于四套同源染色体的供体核与再编程培养基接触来形成染色质。优选地，在允许染色质形成的条件下，使供体核与如下的一种或多种接触在存在或缺乏抗-NuMA抗体时的有丝分裂提取物、去垢剂和/或盐溶液，或者蛋白激酶溶液。
在任何上述涉及用来自两种胚胎的细胞生产有蹄类动物的方面的优选实施方案中，至少第一种胚胎和第二种胚胎之一是致密胚胎(compaction embryo)。在另一个实施方案中，第一种胚胎和第二种胚胎处于不同细胞阶段。第一种胚胎和用于生产第二种胚胎的供体细胞可以来自相同物种或者来自不同种属或物种。优选地，胎儿的滋养外胚层或胎盘组织的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、95或100％的细胞来源于第二种胚胎，或者胎儿的内细胞团或胎儿组织中的至少30、40、50、60、70、80、90、95或100％的细胞来源于第一种胚胎。在其他优选实施方案中，第一种胚胎或第三种胚胎以比具有相同数量和来自相同物种的对照胚胎所表达的相应水平高至少5倍的水平表达核纤层蛋白A、核纤层蛋白C或NuMA蛋白。
在任何上述涉及用来自两种胚胎的细胞生产有蹄类动物的方面的优选实施方案中，在使来自各种胚胎的细胞接触之前，去除第一种胚胎或第二种胚胎的透明带的部分或全部。在一个实施方案中，在溶液中或固体支持物上将来自第一种胚胎和第二种胚胎的细胞相邻放置来使它们接触。在另一个实施方案中，用标准技术将来自第一种胚胎的细胞注射到第二种胚胎中。可以将该细胞注射到第二种胚胎的任何地方，例如透明带和胚胎本身之间的胚胎周边。天然的胚胎包括采用标准方法从怀孕和有蹄类动物(例如牛)中以手术或非手术立式获取的胚胎。体外受精胚胎包括采用标准方法生产的胞质内精子注射胚胎。可以预期，来自两种以上胚胎的细胞(例如来自三、四、五、六种或更多种胚胎的细胞)可以被结合在一起来形成用于制备克隆的有蹄类动物的嵌合胚胎。
生产有蹄类动物的优选实施方案在任何上述方面的优选实施方案中，通过富集或消耗一种成分，例如DNA转甲基酶、组蛋白去乙酰酶、组蛋白、精蛋白、核纤层蛋白、转录因子激活剂或阻抑蛋白，来修饰再编程培养基(例如细胞提取物)。在其他优选实施方案中，在卵母细胞或嵌合胚胎中，细胞核内NuMA或AKAP95蛋白的表达水平比细胞质中的高至少2、5、10或20倍。在还有其他实施方案中，卵母细胞或嵌合胚胎中的至少30、40、50、60、70、80、90或100％的AKAP95蛋白用含有0.1％Triton X-100、1mg/ml DnaseI，以及100mM或300mM的NaCl的溶液来提取。优选地，在被插入到去核的卵母细胞之前，从再编程培养基(例如提取物)中纯化染色质。在另一个优选的实施方案中，将染色质插入到去核的卵母细胞包括，在允许染色质进入卵母细胞的条件下，将染色质与具有融合基因化合物的卵母细胞接触。在还有另一种优选实施方案中，胎儿发育成可存活的后代。优选地，至少1、3、5、10、20、30、40、50、60、70、80或90％的核移植卵母细胞或胚胎发育成可存活的后代。在这种方法中，在允许细胞分化的条件下培养含有染色质的卵母细胞或者再编程的细胞，并且生成的细胞之一被再克隆一次或多次。用于本方法中的供体核、受体染色质或供体细胞和卵母细胞可以是来自相同物种的或者来自不同物种或种属的。期望地，供体细胞或生成的转基因有蹄类动物表达比相应的天然的细胞或有蹄类动物少至少10、20、40、60、80、90、95或100％的功能性蛋白或总蛋白。卵母细胞是受精的或未受精的。优选地，供体核、染色质或被透化处理的细胞来自G期或G0期的细胞。此外，克隆的胚胎、胎儿或有蹄类动物的基因组DNA优选基本上与供体细胞的基因组DNA相同。还可以预期，染色质或再编程的细胞可以被插入到胚胎中来生产嵌合的胚胎、胎儿或有蹄类动物，它们含有具有与染色质或再编程细胞基本上相同的DNA的细胞与具有与胚胎中的天然发生的细胞基本上相同的DNA的细胞的混合物。还可以预期，具有核的卵母细胞可以被用于本发明的方法中。
用于本发明的任何方面的再编程培养基可以含有或不含有异种核酸。在其他优选的实施方案中，在允许载体中的核酸与染色质的基因组中相应核酸发生随机整合或同源重组的条件下，使再编程培养基中的或者在被透化处理的细胞中形成的染色质与具有编码感兴趣的基因的核酸的载体接触，使染色质的基因组发生改变。由于缺乏完整的质膜和缺乏核膜，在被透化处理的细胞中的或溶液中的染色质比天然发生的细胞更容易修饰。可以被用于生产再编程提取物的细胞的例子包括胚胎干细胞和来自大脑、血液、骨髓、胰腺、肝脏、皮肤或任何其他器官或组织的成体干细胞。其他示例性的再编程细胞提取物包括卵母细胞提取物(例如牛或海胆卵母细胞提取物)和雄性生殖细胞提取物(例如来自脊椎动物、无脊椎动物或哺乳动物例如牛的精原细胞、精母细胞、精子细胞或精子提取物)。供体或被透化处理的细胞可以是非无限增殖化的或天然的、自发的或遗传上无限增殖的。供体细胞、被透化处理的细胞、受体细胞或细胞质可以来自任何阶段来源，例如来自胚胎、胎儿、幼年或成年哺乳动物(例如有蹄类动物)。来自较早阶段来源的细胞可能接受较少的自发突变，而且在被插入到卵母细胞后可能具有较长的寿命。
用于繁育有蹄类动物的方法在任何上述用于生产有蹄类动物或有蹄类动物细胞的方法的优选实施方案中，本发明的有蹄类动物与另一种有蹄类动物(例如在抗体重链或轻链核酸上具有突变的有蹄类动物或者具有编码异种抗体的核酸的有蹄类动物)交配，来生产具有两种或多种遗传修饰的胎儿或可存活的后代。优选地，从胎儿或后代中分离一种或多种细胞，并且往分离的细胞中导入一种或多种其他遗传修饰。
生产抗体的方法本发明还提供用表达异种抗体(例如人抗体)的本发明的有蹄类动物来生产抗体的方法。一种这种方法包括将一种或多种感兴趣的抗原施用给具有编码异种抗体基因座位的核酸的本发明的有蹄类动物。基因座位中的核酸片段发生重排，导致生成特异于抗原的抗体。从有蹄类动物中回收抗体。抗体可以是单克隆的或多克隆的，并且优选对感兴趣的抗原具有反应活性。优选地，从有蹄类动物的血清或乳汁中回收抗体。
在一个方面，本发明提供另一种用于制备抗体的方法，其包括从具有编码异种抗体基因座位的核酸的本发明的有蹄类动物中回收异种抗体。基因座位中的核酸片段发生重排，导致生成特异于抗原的抗体。抗体可以是单克隆的或多克隆的，并且优选对感兴趣的抗原具有反应活性。优选地，从有蹄类动物的血清或乳汁中回收抗体。
核酸本发明还提供可用于突变有蹄类动物(例如牛)中的朊病毒基因的核酸(例如载体)。一种这种核酸具有一种盒，该盒沿5′到3′方向包括，具有与有蹄类动物的内源性朊病毒核酸的第一个区域基本上相同的序列的第一个同源区域、阳性选择标记和具有与朊病毒核酸的第二个区域基本上相同的序列的第二个同源区域。在一个实施方案中，第一个同源区域(例如小于3、2、1.5或1kb的区域)比第二个同源区域(例如至少7、8、9或10kb的区域)短，并且该盒能够被整合到该细胞的内源性朊病毒核酸中。在另一个实施方案中，第一个同源区域比第二个同源区域长。优选地，第一个和/或第二个同源区域与细胞中的内源性朊病毒核酸的将要被突变的相应区域是等基因的。
在一个相关方面，本发明提供具有盒的核酸，该盒包括具有与有蹄类动物的内源性朊病毒核酸的第一个区域基本上相同的序列的第一个同源区域、阳性选择标记、具有与朊病毒核酸的第二个区域基本上相同的序列的第二个同源区域，以及与阳性标记方向相反的阴性选择标记(例如DT-A or Tk)(例如，启动子被连接到较短的同源区域末端的阴性选择标记)。该盒能够被整合到细胞的内源性朊病毒核酸中。期望地，一个同源区域的长度至少为7、8、9或10kb，而另一个同源区域的长度少于3、2、1.5或1kb。在一些实施方案中，部分或全部阴性选择标记位于较短的同源区域内。优选地，第一个和/或第二个同源区域与细胞中的内源性朊病毒核酸的将要被突变的相应区域是等基因的。
在另一个方面，本发明提供包含本发明的核酸和亚精胺(例如0.1-10mM亚精胺)的组合物。
上述方面的优选实施方案优选地，有蹄类动物的抗血清或乳汁具有多克隆的人免疫球蛋白。优选地，抗血清或乳汁来自牛、羊、猪或公山羊。在另一个优选实施方案中，Igs定向抵抗期望的抗原。在优选的实施方案中，该抗血清被用作治疗或预防人的疾病的静脉内免疫球蛋白(IVIG)。在另一个优选的实施方案中，感兴趣的抗原被施用给有蹄类动物，并且由有蹄类动物生成定向抵抗抗原的Igs。优选地，在异种免疫球蛋白基因座位重排中生成核酸片段和与对目标抗原具有反应活性的异种抗体。优选地，抗血清和/或乳汁含有比内源性抗体高至少2、5、10、20或50倍的异种抗体，或者不含内源性抗体。如果需要，可以用来源于上述转基因有蹄类动物(例如转基因牛)的异种B细胞来生产杂交瘤和单克隆抗体。还可以预期，可以接着对从有蹄类动物中分离的异种抗体(例如人抗体)进行化学修饰，使之共价地连接到一种毒素、治疗活性化合物、酶、细胞因子、放射性标记、荧光标记或亲合标记上。如果需要，该荧光标记或放射标记可以被用于体外或体内的抗体成像。
优选地，朊病毒核酸突变减少了感染形式的朊病毒蛋白的生成。在优选实施方案中，由有蹄类动物生成的感染形式的朊病毒蛋白的含量比无突变的对照有蹄类动物产生的朊病毒蛋白的含量少80、70、60、50、40、30、20、10或5％。优选地，未产生感染性朊病毒蛋白。
在优选实施方案中，突变是插入来自其他动物(例如不同的有蹄类动物种类或品种)的朊病毒核酸(例如编码区)的部分或全部。优选地，该异种朊病毒核酸替代内源性朊病毒核酸的部分或全部。在优选实施方案中，异种朊病毒核酸来自对朊病毒感染的抵抗性提高的种类或品种，例如抗瘙痒症的绵羊。优选地，具有突变的有蹄类动物感染朊病毒的比例比无突变的有蹄类动物感染朊病毒的比例低80、70、60、50、40、30、20、10或5％。
优选的有蹄类动物和供体细胞有蹄类动物包括奇蹄目(Perissodactyla)和偶蹄目(Artiodactyla)的成员，例如牛属(Bos)的任何成员。其他优选的有蹄类动物包括绵羊、大角绵羊、山羊、美洲野牛、羚羊、牛、马、驴、骡、鹿、麋鹿、北美驯鹿、水牛、骆驼、美洲驼、羊驼、猪和象。
优选的供体细胞包括分化的细胞例如上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质细胞、造血细胞、黑素瘤细胞、软骨细胞、B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和肌肉细胞；未分化的细胞例如胚胎细胞(例如干细胞和胚胎生殖细胞)。在另一个优选的实施方案中，该细胞来自雌性生殖系统，例如乳腺、卵巢、粒层细胞或输卵管细胞。其他优选细胞包括胎儿细胞和胎盘细胞。优选细胞还包括那些来自任何器官，例如膀胱、大脑、食道、输卵管、心脏、肠道、胆囊、肾脏、肝脏、肺、卵巢、胰腺、前列腺、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、尿管、尿道和子宫的细胞。优选地，供体细胞、供体核、供体染色质、或重构的卵母细胞不是四倍体。
在还有另一个优选的实施方案中，细胞核、透化处理的细胞或染色体来自转基因细胞或有蹄类动物或者含有不存在于供体细胞或不存在于天然细胞中的突变。优选地，转基因供体核和供体细胞在克隆有蹄类动物中编码使之对疾病或寄生虫的抗性提高的蛋白质。可选择地，供体核或供体细胞被工程化，使得克隆的有蹄类动物生成重组产物，例如在牛的尿液、血液或乳汁中生产人蛋白。例如，通过插入在尿血小板溶素(uroplakin)启动子控制下编码人蛋白的多核苷酸序列，在牛的尿液中表达蛋白质。可以在克隆牛的乳汁中生成的治疗性蛋白质包括人凝血因子例如因子I-X III的任何一种(Voet和Voet，Biochemistry，John Wiley & Sons，纽约，1990)。这些异源蛋白质可以在催乳素启动子或者适合在牛乳汁中表达的任何其他启动子的控制下表达。可以用标准的纯化方法来纯化来自这些和其他组织或液体的重组蛋白质(参见，例如Ausubel等，同上文)。
定义如在此所用的，“人工染色体”是指哺乳动物染色体或其片段，其具有人工修饰，例如增加一个可选择标记、增加克隆位点、删除一种或多个核苷酸、取代一个或多个核苷酸等。“人类人工染色体”或“HAC”是指来源于一个或多个人染色体的人工染色体。人工染色体可以独立于宿主细胞的内源性染色体地被维持在宿主细胞中。在这种情况下，HAC被稳定地复制并且与内源性染色体相分离。可替代地，HAC被转移到或插入到宿主细胞的内源性染色体中。两种或多种人工染色体可以同时或顺序地被插入到宿主细胞中。例如，可以导入来源于人染色体#14(包含Ig重链基因)、人染色体#2(包含Igκ链基因)和人染色体#22(包含Igλ链基因)的人工染色体。可选择地，可以导入包含异种Ig重链和Ig轻链基因的人工染色体，例如ΔHAC或ΔΔHAC。优选地，重链基因座位和轻链基因座位位于不同的染色体臂上(即位于着丝粒的不同侧面上)。在还有其他优选的实施方案中，整个HAC的大小小于或约等于10、9、8或7Mb。
“预先排列或未重排形式的核酸”是指未发生V(D)J重组的核酸。在优选实施方案中，通过一种或多种核酸，将编码抗体轻链的V基因片段的全部核酸片段与编码J基因片段的所有核酸片段分开。优选地，通过一种或多种核酸，将编码抗体重链的V基因片段的全部核酸片段与编码D基因片段的所有核酸片段分开，和/或通过一种或多种核酸，将编码D基因片段的全部核酸片段与编码J基因片段的所有核酸片段分开。优选地，未被重排形式的核酸基本上是人的。在其他优选实施方案中，该核酸与来自人的天然核酸的相应区域至少有70、80、90、95或100％相同。
“降低内源性抗体的含量和/或活性”是指降低由B细胞或B细胞群体生成的内源性、功能性抗体的含量，如2003年5月19日申请的U.S.S.N.10/441,503中所描述的。内源性抗体的这种降低可能是由于每个B细胞产生的内源性抗体含量下降、有功能的内源性B细胞数量下降或者它们组合。优选地，由B细胞分泌或者在表达或分泌内源性抗体的B淋巴细胞表面表达的内源性抗体的含量降低至少25、50、75、90或95％。在另一个优选的实施方案中，在来自受体哺乳动物的样本例如血液样本中的内源性B细胞的数量减少了至少25、50、75、90或95％。
“双功能抗体”是指包括共价地结合到不同抗体或抗体的不同片段上的抗体或抗体片段的抗体。在一个优选的实施方案中，抗体或片段结合到在同一抗原上显现的不同表位上。其他优选的双功能抗体结合到两种不同的抗原上，例如结合到抗体的轻链和抗体重链上。标准的分子生物学技术例如那些在此描述的技术被用于可操作地连接两个核酸，使得融合核酸编码一种双功能抗体。
“片段”是指具有连续的氨基酸区域的多肽，该连续的氨基酸区域与本发明的抗体的相应区域相同但是比全长序列短。基于标准分析，例如在此描述的那些，该片段能够如同相应抗体那样结合相同的抗原。优选地，该片段与抗原的结合至少为相应抗体与抗原的结合的20、40、60、80或90％。
“纯化的”是指从与之天然相伴随的其他组分中分开。典型地，当不含与之天然相伴随的蛋白质、抗体和天然存在的有机分子，当一种成分在重量上占至少50％时，该成分基本上是纯的。优选地，该成分在重量上至少为75％，更优选至少为90％，和最优选至少为99％纯的。可以通过化学合成、从天然来源分离该成分，或者在重组的不会自然生成该成分的宿主细胞中生成该成分来获得基本上纯的成分。本领域技术人员可以采用标准方法例如由Ausubel等(同上文)描述的那些方法，来纯化蛋白质、载体和细胞器。该成分优选比原始材料纯至少2、5或10倍，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、柱层析、光密度、HPLC分析或蛋白质印迹分析(Ausubel等，同上文)来测定。优选的纯化方法包括免疫沉淀、柱层析如免疫亲合层析、磁珠免疫亲合纯化和用与平板结合的抗体淘选。
“染色质”是指不止一条的未被膜包被的染色体。优选地，染色质含有细胞的所有染色体。可以通过将细胞核暴露到本文描述的有丝分裂再编程培养基(例如有丝分裂提取物)中，来形成含有浓缩的染色体的人工诱导的染色质。可选地，可以将细胞核暴露于如下之一来生成含有去浓缩或部分浓缩染色体的人工诱导的染色质，如本文描述的含有抗-NuMA抗体的有丝分裂提取物、去垢剂和/或盐溶液，或者蛋白激酶溶液。染色质可能含有相互之间不是体接触的离散染色体，或者可能含有两条或多条体接触的染色体。
如果需要，可以采用标准方法，通过测定DNA染料DAPI的着色程度来检测染色体的浓缩程度。当染色体浓缩时，该染色程度增加。因此，染色体的着色程度与间期的浓缩染色体(指定为0％浓缩)和有丝分裂期的最浓缩的染色体(指定为100％浓缩)的着色程度比较。基于这种比较，可以确定最大浓缩的比例。优选的浓缩的染色质为至少50、60、70、80、90或100％浓缩。优选的去浓缩或部分浓缩的染色质为少于50、40、30、20或10％浓缩。
“细胞核”是指含有细胞的大部分或全部DNA的膜限制细胞器。DNA以去浓缩的形式被包装到染色体中。优选地，包被DNA的膜包括一层或两层脂质或者具有核蛋白。
“具有至少四套同源染色体的细胞核”是指具有至少4n的DNA浓度的细胞核，其中“n”是存在于特定种属或种类的哺乳动物中的正常单倍染色体组。这种细胞核不具有四份各种基因或基因座位。优选地，细胞核是双倍的，因此具有两套同源染色体，但是少于两对完整的染色单体。
“原核”是指由有丝分裂或者核移植原核产生的单倍体细胞核。雌原核是卵母细胞或卵子与雄原核融合之前的细胞核。雄原核是受精时进入卵母细胞或卵子后但是与雌原核融合之前的精子细胞核。核移植原核是在将供体细胞、细胞核或染色质导入卵母细胞后形成的原核(例如双倍体原核)。核移植原核具有少于四套的同源染色体。
“供体细胞”是指细胞核或染色质所源于的细胞或者被透化处理的细胞。
“透化处理”是指在质膜上形成孔或者部分或完全去除质膜。
“再编程培养基”是指允许从细胞、细胞核、染色质或染色体中去除一种成分或者将来自溶液的成分加入细胞、细胞核、染色质或染色体的溶液。优选地，成分的添加或去除提高或降低了供体细胞、染色质或细胞核或含有再编程化的染色质或细胞核的细胞中的mRNA或蛋白质的表达水平。在另一个实施方案中，在再编程培养基中培养被透化处理的细胞、染色质或细胞核改变了被透化处理的细胞或含有再编程化染色质或者与供体细胞表型相关的细胞核的细胞的表型。在还有另一个实施方案中，在再编程培养基中培养被透化处理的细胞、染色质或细胞核，使得被透化处理的细胞或含有再编程染色质或细胞核的细胞获得或丧失与供体细胞相关的活性。
示例性的再编程培养基包括不含生物分子例如蛋白质或核酸的溶液，如缓冲液。这种溶液可以用于从细胞核、染色质或染色体中去除一种或多种成分。其他优选的再编程培养基为提取物，例如来自细胞核、细胞质或者它们的结合的细胞提取物。示例性的细胞提取物包括来自卵母细胞(例如哺乳动物、脊椎动物或无脊椎动物的卵母细胞)、雄性生殖细胞(例如哺乳动物、脊椎动物或无脊椎动物的生殖细胞例如精原细胞、精母细胞、精子细胞或精子)，以及干细胞(例如成年或胚胎干细胞)的提取物。还有其他再编程培养基是加入一种或多种天然的或重组的成分(例如核酸或蛋白质例如DNA转甲基酶、组蛋白去乙酰酶、组蛋白、精蛋白、核纤层蛋白、转录因子、激活剂、阻抑蛋白、染色质重建蛋白、生长因子、白细胞介素、细胞因子或其他激素)的溶液或提取物，或者去除一种或多种成分的提取物。还有其他的再编程培养基包括去垢剂(例如0.01％-0.1％，0.1％-0.5％或0.5％-2％离子型或非离子型去垢剂，例如一种或多种如下的去垢剂SDS、TritonX-100、Triton X-114、CHAPS、脱氧胆酸钠、正辛基葡糖苷、NonidetP40、IGEPAL、Tween 20、Tween 40或Tween 80)、盐(例如，约0.1、0.15、0.25、0.5、0.75、1、1.5或2M NaCl或KCl)、多胺(例如，约1μM、10μM、100μM、1mM或10mM精胺、亚精胺、精蛋白或多聚赖氨酸)、蛋白激酶(例如，细胞周期蛋白依赖的激酶1、蛋白激酶C、蛋白激酶A、MAP激酶、钙/钙调素依赖的激酶、CK1酪蛋白激酶或CK2酪蛋白激酶)，和/或磷酸酶抑制剂(例如，约10μM、100μM、1mM、10mM、50mM、100mM的如下抑制剂中的一种或多种原钒酸钠、焦磷酸钠、氟化钠、NIPP1、抑制剂2、PNUTS、SDS22、AKAP149或者ocadaic acid)。在一些实施方案中，再编程培养基含有抗-NuMA抗体。如果需要，可以同时或连续使用多种再编程培养基来再编程供体细胞、细胞核或染色质。
“间期再编程培养基”是指诱导染色质去浓缩和核被膜形成的溶液(例如间期细胞提取物)。
“有丝分裂再编程培养基”是指诱导染色质浓缩和核被膜破裂的溶液(例如有丝分裂细胞提取物)。
“再编程细胞”是指被暴露于再编程培养基中的细胞。优选地，至少有1、5、10、20、25、50、75、100、150、200、300、或更多种mRNA或蛋白质分子在再编程细胞中被表达，这些mRNA或蛋白质在供体细胞或被透化处理的细胞中不被表达。在另一个优选的实施方案中，在再编程细胞中表达而不在供体细胞或被透化处理的细胞中表达的mRNA或蛋白质分子的数量在1到5之间、5到10之间、10到25之间、25到50之间、50到75之间、75到100之间、100到150之间、150到200之间或者200到300之间，包含端点值。优选地，至少1、5、10、20、25、50、75、100、150、200、300、或更多的mRNA或蛋白质分子在供体细胞或被透化处理的细胞中被表达，而在再编程细胞中不被表达。在另一个优选实施方案中，在供体细胞或被透化处理的细胞中表达而不在再编程细胞中表达的mRNA或蛋白质分子的数量在1到5之间、5到10之间、10到25之间、25到50之间、50到75之间、75到100之间、100到150之间、150到200之间或者200到300之间，包含端点值。在还有另一个优选的实施方案中，这些mRNA或蛋白质分子在供体细胞(例如供体或被透化的起始细胞)和再编程细胞中被表达，但是通过标准方法(参见，例如Ausubel等，同上文)测定，这些细胞中的表达水平相差至少2、5、10或20倍。
“添加一种因子”是指一种因子结合到染色质、染色体或核被膜的成分例如核膜或者核基质上。可选择地，该成分被运输到细胞核中，使得其被核被膜结合或包被。优选地，被结合到染色体上或者定位于细胞核上的成分的含量增加了至少25、50、75、100、200或500％。
“去除一种因子”是指从染色质、染色体或核被膜的成分例如核膜或核基质上解离一种因子。可选择地，该因子被运输到细胞核外，使得其不再被核被膜结合或包被。优选地，被结合到染色体上或者定位于细胞核上的因子的含量下降了至少25、50、75、100、200或500％。
“一种因子的富集或消耗”是指添加或去除原始存在于再编程培养基(例如细胞提取物)中的天然存在或重组的因子的含量的至少20、40、60、80或100％。可选择地，可以加入自然不存在于再编程培养基中的天然的或重组的因子。优选因子包括蛋白质例如DNA转甲基酶、组蛋白去乙酰酶、组蛋白、精蛋白、核纤层蛋白、转录因子、激活剂和阻抑蛋白；膜囊和细胞器。在一个优选的实施方案中，如下所述，在被添加到再编程培养基之前，该成分被纯化。可选择地，如下描述的纯化方法之一被用于从再编程培养基中去除一种不期望的因子。
“再克隆的”是指被用于第二轮克隆。特别地，来自由本发明的方法生产的胚胎、胎儿或成体的细胞在有丝分裂再编程培养基(例如有丝分裂细胞提取物)中培养，生成用于插入到去核的卵母细胞中的染色质，如上所述。可选择地，如上所述，该细胞被透化，在再编程培养基中培养，并插入到去核的卵母细胞中。进行两轮或多轮克隆，导致对供体染色质或供体细胞进行额外的再编程、从而提高在最后一轮克隆后产生可存活的后代的几率。
“可存活的后代”是指在子宫外存活的哺乳动物。优选地，自从离开母体宿主之后，该哺乳动物存活了至少1秒钟、1分钟、1小时、1天、1周、1个月、6个月、1年。该哺乳动物不需要子宫环境的循环系统来存活。
“核移植卵母细胞”或“核转移卵母细胞”是指插入或融合了供体细胞、细胞核或染色质的卵母细胞。由该卵母细胞形成的胚胎被称作“核移植”或“核转移”胚胎。
“胚胎”或“胚胎的”是指还未被植入母体宿主的子宫内膜中的正在发育的细胞质。因此，“胚胎”是指受精的卵母细胞；含有供体染色质、细胞核或再编程细胞的卵母细胞；囊胚期前的正在发育的细胞质；或任何在植入母体受体的子宫内膜之前和在形成生殖脊之前的发育阶段的其他正在发育的细胞质。胚胎可能代表多个细胞发育阶段。例如，一个细胞胚胎可以被称作合子；由卵裂的胚胎产生的固体球形细胞质可以被称作桑椹胚，而具有囊胚腔的胚胎可以被称作囊胚。“胚胎细胞”是分离自或者包含在胚胎中的细胞。
“来源于胚胎的细胞”是指由胚胎内的细胞分化产生的细胞。
“嵌合的胚胎”是指由来自两种或多种胚胎的细胞形成的胚胎。生成的胎儿或后代具有仅来源于起始胚胎之一的细胞或者来源于不只一个起始胚胎的细胞。如果需要，可以采用标准的FISH分析或者对添加到一个胚胎上的膜染色的分析，来确定结合到胎盘组织和胎儿组织中的来自各个胚胎的细胞的比例。
“嵌合的有蹄类动物”是指由来自两种或多种胚胎的细胞形成的有蹄类动物。该有蹄类动物可以具有仅来源于起始胚胎之一的细胞或者来源于不只一个起始胚胎的细胞。如果需要，可以采用标准的FISH分析或者对添加到一个胚胎上的膜染色的分析，来确定结合到胎盘组织和胎儿组织中的来自各个胚胎的细胞的比例。
“致密的前胚胎”是指致密之前的胚胎。实质上，致密前胚胎未在其卵裂球的表面表达E-钙粘着蛋白。优选的致密前胚胎表达至少比相同物种的完全致密化胚胎少3、5、10、20、30或40倍的E-钙粘着蛋白。
“致密胚胎”是指正在发生致密或致密后的胚胎。致密胚胎的卵裂球在其表面上表达E-钙粘着蛋白。可以采用抗E-钙粘着蛋白抗体用标准方法来测定这种E-钙粘着蛋白的表达。E-钙粘着蛋白增加卵裂球之间的粘着。优选的致密胚胎包括致密过程完成的胚胎。其他优选的致密胚胎表达比相同种类的致密前胚胎高至少3、5、10、20、30或40倍的E-钙粘着蛋白。
“胎儿”是指已经植入母体宿主的子宫内膜中的正在发育的细胞质。胎儿具有容易由本领域技术人员确定的特定特征例如生殖脊。“胎儿细胞”是来自或包含在胎儿中的任何细胞。
“孤雌生殖”或“孤雌生殖激活”是指其细胞核未与雄原核融合来形成合子的卵母细胞或卵子的发育。例如，未受精的卵母细胞可以被诱导分化。
“透明带”是指环绕在许多哺乳动物的卵母细胞或卵子之外的透明的、有弹性的非细胞层。
“滋养外胚层”是指在哺乳动物胚胎发育的囊胚期中环绕囊胚腔的最外细胞层。在以后的发育中，滋养外胚层形成胎盘组织的大部分或全部。
“内细胞团”是指被滋养外胚层包围的细胞。在以后的发育中，内细胞团细胞形成胎儿组织的大部分。
“特异于一种细胞类型的mRNA或蛋白质”是指以一定水平在一种细胞类型中表达的mRNA或蛋白质，该水平比所有其他细胞类型中的表达水平高至少10、20、50、75或100倍。优选地，mRNA或蛋白质仅在一种细胞类型中被表达。
“突变”是指在天然或参比核酸序列中的改变，例如插入、删除、移码突变、沉默突变、无义突变或错义突变。优选地，由核酸序列编码的氨基酸序列具有至少一个不同于天然序列的氨基酸改变。用于改变细胞、胚胎、胎儿或哺乳动物的基因组序列的DNA重组技术的例子包括将来自另一种有机体(例如人)的DNA序列插入到基因组中、缺失一条或多条DNA序列，和在靶向DNA序列中导入一个或多个碱基突变(例如定点或随机突变)。产生这些修饰的方法的例子包括逆转录病毒插入、人工染色体技术、基因插入、随机插入组织特异性启动子、同源重组、基因打靶、可转运元件和任何其他用于导入外源DNA的其他方法。所有这些方法对于分子生物学领域的技术人员来说是熟知的(参见，例如Ausubel等，同上文)。染色质、染色体和来自含有被修饰DNA的转基因细胞或者供体转基因细胞的细胞核可以被用于本发明的方法。
“无限增殖的”是指能够发生比与无限增殖细胞相同细胞类型、种属和物种的天然对照细胞或者比衍生该无限增殖细胞的供体细胞高至少25、50、75、90或95％的细胞分化。优选地，无限增殖细胞发生比对照细胞高至少2、5、10或20倍的分化。更加优选地，无限增殖细胞能够进行无限次的细胞分化。无限增殖细胞包括天然需要体内或体外突变的细胞，该突变改变其正常的生长调节过程。还有其他优选的无限增殖细胞包括被遗传修饰来表达原癌基因例如ras、myc、abl、bcl2或neu的细胞，或者已经用转化DNA或RNA病毒例如EB病毒或SV40病毒感染的细胞(Kumar等，Immunol.Lett.65153-159，1999；Knight等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 853130-3134，1988；Shammah等，J.Immunol.Methods 160-19-25，1993；Gustafsson和Hinkula，Hum.Antibodies Hybridomas 598-104，1994；Kataoka等，Differentiation 62201-211，1997；Chatelut等，Scand.J.Immunol.48659-666，1998)。还可以遗传修饰细胞来表达端粒酶基因(Roques等，Cancer Res.618405-8507，2001)。
“非无限增殖的”是指不是上述的无限增殖的。
“基因融合化合物”是指当位于邻近细胞时，提高染色质或细胞核插入到受体细胞中的概率的化合物，例如基因融合化合物可以提高染色质或细胞核对细胞质膜的亲合性。基因融合化合物还可能促进细胞核的核膜与细胞的质膜连接。
“基本上相同的”是指具有与另一条序列至少60、70、80、90或100％相同的序列。通常采用序列分析软件，以其特定的默认参数来测定序列同一性(例如Genetics Computer Group的序列分析软件包，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 UniversityAvenue，Madison，WI 53705)。该软件通过对各种取代、删除和其他修饰赋予同源程度来匹配相似的序列。
优点本发明提供大量的与生产在朊病毒基因的一个或两个等位基因上具有突变的转基因有蹄类动物(例如牛)相关的优点。例如，在此描述的朊病毒敲除载体、细胞培养方法和转染方法以令人惊奇的高频率灭活牛细胞中的朊病毒基因。大量正确打靶的供体细胞以及本发明的改进的核移植方法(例如，染色质转移和SLOT)极大地方便了低表达或不表达朊病毒蛋白的克隆转基因有蹄类动物(例如牛)的生产。这些生成的转基因有蹄类动物是农产品(例如肉类)和药品(例如由转基因有蹄类动物中的一种或多种异种核酸表达人的治疗性抗体)的期望来源。
根据如下详细描述和权利要求书，本发明的其他特征和优点是显然的。
附图简介本申请文件含有彩色附图(附图31、34A-34C、36A、36B、42A-42D、45A、46D、47A、47C、48、49B、50A-50D和51C-51E)。具有彩色附图的本专利或专利公开的拷贝的将由专利局根据要求并支付相当费用后提供。
附


图1A描述了用于生产含有Ig敲除和人类人工染色体的母牛的方法的概述。附
图1A中的时间线基于以下估计18个月用于制备Ig敲除载体和生产敲除细胞，2个月用于由所述敲除细胞生成胎儿，9个月用于进行后续敲除，妊娠产仔需要9个月，在由小牛生产胚胎之前有12个月，6个月用于进行HAC转移。
附
图1B描述了用于生产在内源性Ig基因中含有突变以及含有ΔHAC或ΔΔHAC的母牛的方法的概述。对于
图1B中的时间线，估计每周筛选250个集落，在3个月内总共筛选3,000个集落，以便分离雄性和雌性敲除细胞。假设每1,500个菌落产生一个或多个敲除集落。纯合的敲除的有蹄类动物可以通过下述方法产生(1)在核移植之前，将第二个Ig突变引入分离的敲除细胞中，(2)在得自胚胎、胎儿(例如妊娠约60天的胎儿)或者由第一轮核移植产生的后代的细胞中引入第二个Ig突变，并且用所得到的纯合细胞作为第二轮核移植的供体细胞，或者(3)让有蹄类动物交配。在附
图1A和1B中，“同”表示纯合的；“半”表示半合子的；“H”表示重链；“L”表示轻链；“HAC”表示人类人工染色体；“HAC1”表示任何一种HAC；而“HAC2”表示第二种HAC。
附图2A包括按照本发明的μ(IgM重链)敲除构建体。附图2B为来自Holstein牛(荷兰牛)的免疫球蛋白基因座的限制性图谱。
附图3A-3B包括构建体pSTneoB和pLoxP-StneoB的示意图。分别用于制备μ敲除DNA构建体。
附图3C描述μ敲除DNA构建体。
附图3D描述在μ敲除构建体中用作第一个同源区的基因组牛μ重链基因座的1.5kb区的多核苷酸序列(SEQ ID NO47)。
附图3E描述在μ敲除构建体中用作第二同源区的基因组牛μ重链基因组的3.1kb区的多核苷酸序列(SEQ ID NO48)。在该序列中，每个“n”代表任何核苷酸或者无核苷酸。连续的“n”核苷酸区代表其多核苷酸序列尚未测定的大约0.9-1.0kb的区。
附图3F描述嘌呤霉素抗性的牛μ重链敲除构建体。
附图3G描述了牛κ轻链DNA的多核苷酸序列(SEQ ID NO60)。该序列的全部或部分被用于κ轻链敲除构建体中。此外，这种κ轻链可以用来分离用于κ轻链敲除构建体中的基因组κ轻链序列。
附图4是构建ΔHAC和ΔΔHAC的示意图。
附图5是琼脂糖凝胶的照片，表明在ΔHAC胎儿中存在编码人重链和轻链的基因组DNA。
附图6是琼脂糖凝胶的照片，表明在妊娠77天的ΔHAC胎儿(胎儿#5996)中的Cμ外显子3和4的表达。
附图7是琼脂糖凝胶照片，表明内源性牛重链在ΔHAC胎儿#5996中的重排。
附图8是琼脂糖凝胶照片，表明重排的人重链在ΔHAC胎儿#5996中的表达。
附图9是琼脂糖凝胶照片，表明来自人重链基因座的剪接恒定区在ΔHAC胎儿#5996中的表达。
附
图10是琼脂糖凝胶照片，表明重排的人重链在ΔHAC胎儿#5996中的表达。
附
图11A是来自ΔHAC胎儿#5996的重排人重链转录物的多核苷酸序列(SEQ ID NO49)。
附
图11B是该序列的一个区(“查询序列”)与人抗肺炎球菌抗体(“待测序列”)的比对(分别为SEQID NO50和51)。对于来自ΔHAC胎儿#5996的查询序列而言，仅显示与人抗肺炎球菌抗体序列的相应核苷酸不同的那些核苷酸。
附
图12A-12B描述来自ΔHAC胎儿#5996的重排人重链转录物的另外两条多核苷酸序列(SEQ ID NO52和54)及其推导出的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO53和55)。
附
图13是琼脂糖凝胶照片，证明ΔΔHAC胎儿#5580含有人重链和轻链免疫球蛋白基因座。
附
图14是琼脂糖凝胶照片，证明ΔΔHAC胎儿#5442A和5442B中含有人重链和轻链免疫球蛋白基因座。
附
图15是琼脂糖凝胶照片，表明来自人重链基因座的剪接μ恒定区在ΔΔHAC胎儿#5442A中的表达。
附
图16是琼脂糖凝胶照片，表明人重链基因座在ΔΔHAC胎儿#5868A中的重排和表达。
附
图17是琼脂糖凝胶照片，表明人Igλ基因座在ΔΔHAC胎儿#5442A和5442B中的重排和表达。
附
图18是琼脂糖凝胶照片，表明人Igλ基因座在ΔΔHAC胎儿#5442A中的重排和表达。
附
图19是琼脂糖凝胶照片，表明人Igλ基因座在ΔΔHAC胎儿#5868A中的重排和表达。
附图20描述来自ΔΔHAC胎儿#5442A的重排的人轻链转录物的多核苷酸序列以及相应的推导氨基酸序列(分别为SEQ ID NO56和57)。
附图21描述来自ΔΔHAC胎儿#5442A的另外一条重排的人轻链转录物的多核苷酸序列以及相应的推导的氨基酸序列(分别为SEQ IDNO58和59)。
附图22A-22H是ΔΔHAC胎儿#5442A(附图22A-22D)和5442B(附图22E-22H)表达人λ轻链和牛重链蛋白的FACS分析图。使得自这些胎儿的脾脏的淋巴细胞与藻红蛋白标记的抗人λ抗体(附图22C和22D)、FITC标记的抗牛IgM抗体(附图22D和22H)或者无抗体(附图22A、22B(22E和22F))反应，然后在FASCalibur细胞分类器上分析。将其中一种所述抗体标记的细胞的百分率显示在每个柱状图的下方。
附图23为α-(1，3)-半乳糖基转移酶敲除载体的示意图，所述载体用于将嘌呤霉素抗性基因和转录终止序列插入到牛细胞的内源性α-(1，3)-半乳糖基转移酶基因中。
附图24为含有外显子2、3和4，用作所述AAV打靶载体骨架的BamHI-XhoI片段的示意图。新霉素抗性标记用于通过插入到外显子4中而对所述基因座进行插入诱变。指明了用于随后验证正确打靶的PCR引物的退火位点的位置。
附图25是构建设计用于去除牛的内源性IgH序列的腺伴随病毒构建体的示意图。
附图26是琼脂糖凝胶的照片，显示正确打靶事件的各个转导克隆的PCR分析。在该试验中使用的载体示于附图24中。指示正确打靶的PCR插入以星号标记。
附图27是列出携带HAC的胚胎的妊娠率的表格。
附图28A-28J是来自注射了抗牛IgM抗体(das6)来抑制B细胞发育的试验胎儿或对照胎儿的外周血淋巴细胞的FACS分析照片。附图28A-28E是用抗牛IgM抗体来定向抵抗在B细胞表面表达的IgM分子而进行的FACS分析照片。如附图28A和附图28B所示，约19.82-26.61％来自对照胎儿的外周血淋巴细胞表达IgM。相反，7.78，％、11.80％或3.95％来自三个注射了抗牛IgM抗体的胎儿的外周血淋巴细胞表达IgM(分别为附图28C-28E)。附图28F-28J是用抗牛轻链抗体(das10)来定向抵抗在B细胞表面表达的抗体轻链分子而进行的FACS分析照片。如附图28F和附图28G所示，约12.43-29.47％来自对照胎儿的外周血淋巴细胞表达抗体轻链分子。相反，2.54％、13.77％或3.99％来自三个注射了抗牛IgM抗体的胎儿的外周血淋巴细胞表达抗体轻链分子(分别为附图28H-28J)。
附图29A-29B图示免疫检测在牛的植入子宫前的胚胎中的核被膜和和基质蛋白。附图29A是用相同抗体检查的原核期和8-细胞期的体外受精的牛胚胎的图片。附图29A中的箭头指向在原核期胚胎的雌原核中标记的抗-NuMA和抗-AKAP95。附图29A中的插图是用0.1μg/mlHoechst33342标记的DNA图片(光栅(bars)，20μm)。附图29B是对牛成纤维细胞(上排)和原核胚(下排)的免疫印迹分析。分子量标记物以kDa示于附图29B的右边。
附图30是牛供体成纤维细胞(供体细胞)、处于成熟前的染色质浓缩阶段(融合后3小时)的核移植胚胎、原核期(融合后19小时)的核移植胚胎以及如在此描述的激活的孤雌生殖原核胚的照片。使用抗核纤层蛋白B、核纤层蛋白A/C、NuMA和AKAP95抗体在注射“hpi”后3小时的成熟前染色质浓缩阶段(“PCC”)和注射后7小时(“NTPN”)监控供体细胞核的分解和新原核的装配。用10mM SrCl2孤雌生殖激活的MII期的卵母细胞，在激活处理后5小时分析形成的雌原核(“Parth.PN”)。在原核期的牛核移植胚胎的原核中装配核纤层蛋白A/C。用0.1μg/ml Hoechst 33342染色计数DNA。TRITC是指用TRITC-偶联的第二抗体进行标记(光栅，20μm)。
附图31是证明与孤雌生殖胚胎相比，AKAP95被更强烈地锚定在核移植胚胎的原核中的图。该图显示在用3％多聚甲醛固定前，用0.1％Triton X-100和1mg/ml DNA酶I以及100或300mM NaCl在室温下原位提取30分钟后，在孤雌生殖体(parthenotes)、核移植胚胎的原核和体细胞供体细胞核中标记的未被提取的核纤层蛋白B、AKAP95和DNA的相对比例。用双免疫荧光检测B型核纤层(红色)和AKAP95(绿色)的定位。量化各个频道(channel)-红色(核纤层蛋白)、蓝色(DNA)和绿色(AKAP95)的荧光标记强度。参比值(100％未被提取)表示在固定前用0.1％Triton X-100透化的胚胎或细胞中染色的B型核纤层蛋白、DNA和AKAP95的相对含量。每组约检测30个胚胎。
附图32是原核期的牛核移植胚胎的照片，该胚胎是通过成纤维细胞融合与卵母细胞激活生成的，用5μM离子霉素激活卵母细胞4分钟，然后用10μg/ml放线菌酮/2.5μg/ml细胞松弛素D激活4小时，如在(b′)中那样，用离子霉素/放线菌酮/细胞松弛素D激活，接着用10μg/ml放线菌酮再培养9个小时(b″，CHX)或者如(b′)那样在整个激活处理中与10μg/ml放射菌素D一起进行培养(b)。将抗核纤层蛋白B(兔多克隆)抗体和抗核纤层蛋白A/C(mAb)抗体用于同一种制备物。插图是用0.1μg/ml Hoechst 33342标记的DNA照片(光栅，20μm)。
附图33是有丝分裂细胞质提取物(M-S15)、有丝分裂细胞液提取物(M-S200)和卵母细胞提取物(MII-S15)中的染色质浓缩和核被膜崩解的图(n＝300-400个在3-5个重复中检测的细胞核)。
附图34A-34C是纯化的输入牛成纤维细胞核(附图34A)和在有丝分裂细胞液提取物(附图34B)和卵母细胞提取物(附图34C)中的浓缩染色质的数套免疫荧光分析图片。检测指定的核标记。用碘化丙啶(红色)来染色计数DNA(光栅，10μm)。
附图35是在常规核移植(NT)或者核注射(NI)方法以及采用本发明的方法将染色质注射到卵母细胞(CT)后在卵母细胞中获得的浓缩染色质的一系列免疫荧光分析的照片。可检测的核纤层蛋白B和A/C似乎都被溶解了(光栅，10μm)。
附图36A-36B是由染色质转移、核移植或者核注射生成的原核的一系列免疫荧光分析照片。在核移植、核注射或者染色质转移后19个小时时固定并标记胚胎。还检测对照的孤雌生殖的原核(Part.)。附图36A表示对核纤层蛋白A/C和B的分析。附图36B表示对AKAP95和NuMA的分析。核纤层蛋白A/C(绿色标记)仅出现在核移植和核注射的原核中(光栅，30μm)。
附图37是用于生产克隆的Tc小牛的方法的示意图。显示HAC构建体具有含有Igλ和IgH基因的hChr22和hChrl4区以及neo选择标记的位点。从CHO克隆，通过MMCT方法将HAC转移到胎牛成纤维细胞中。将Tc成纤维细胞与去核卵母细胞融合来进行核移植。体外培养重构的Tc胚胎到囊胚期，然后植入到受体母牛内。约妊娠60天，取出Tc胎儿；重新建立、评价成纤维细胞系，用于进一步核移植。将再克隆的Tc胚胎移植到受体中来生产Tc小牛。
附图38A-38D图示对Tc胎儿的分析。G418选择重新生产的Tc成纤维细胞系和对照的非转基因成纤维细胞(附图38A)。基因组PCRTc胎儿和对照中的IgH和Igl基因座。三个胎儿#5968(泳道1)、#6032(泳道2)和#6045(泳道3)来源于ΔHAC成纤维细胞，胎儿#5580(泳道4)来自ΔΔHAC成纤维细胞。作为对照，回收和评价非转基因胎儿(泳道N)(附图38B)。在所有Tc胎儿和阳性对照人肝脏DNA样本中(泳道P)，通过PCR都检测到IgH和Igl基因座，但是在阴性对照中未检测到(泳道N)。重排和表达人Igμ和Igλ转录物，这些转录物是通过RT-PCT从阴性对照非转基因牛的脾脏(泳道N)，克隆Tc胎儿的大脑(泳道1)、工作(泳道2)和脾脏(泳道3)以及阳性对照的人脾脏(泳道P)中扩增得到的(附图38C)。在第91天回收通过RT-PCR从克隆Tc胎儿中扩增的人Igμ和Igλ转录物的代表性核苷酸及推导的氨基酸序列(附图38D)。RT-PCR按照所描述进行(Kuroiwa等，Nature Biotech 181086-1090，2000)。对于人的Igμ转录而言，VH1/5BACK、VH3BACK和VH4BACK用作5′引物，而Cμ-2用作3′引物。对于人lgλ转录而言，Vλ1LEA1、Vλ2MIX和Vλ3MIX用作5′引物，而CλMIX用作3′引物。用TA克隆试剂盒(Invitrogen)亚克隆扩增的cDNA，并用自动测序仪(ABI3700 system)进行测序。
附图39A-39C图示分析克隆的Tc小牛的照片。四头Tc克隆小牛；来自细胞系#6045的雄性小牛(#50)和来自细胞系#5968的雌性小牛(#1064、#1065、#1066)(附图39A)。基因组OCR来自克隆Tc小牛和对照的PBLs的IgH和Igλ基因座；小牛#1064(泳道1)，#1065(泳道2)，#1066(泳道3)，#50(泳道4)，#1067(泳道5)和#1068(泳道6)(附图39B)。在所有Tc小牛和阳性对照人肝脏DNA(泳道P)中，通过基因组PCR检测到IgH和Igl基因座，但是在阴性对照的非转基因小牛中未检测到(泳道N)。FISH分析分散在细胞中的中期染色体显示单一信号，而细胞显示双重信号(附图39C)。箭头指示HAC在周围牛染色体中的定位。用地高辛配基标记的人COT-1 DNA作为探针对HAC进行着色，用抗地高辛配基的罗丹明进行检测。
附图40A-40B图示核纤层蛋白B、核纤层蛋白A/C、NuMA和AKAP95在牛胎儿成纤维细胞(附图40A)和体外培养的原核期的和8-16细胞期的牛胚胎(附图40B)中的免疫荧光分布。箭头指向在雌原核(两个原核中较小的那个)中的NuMA和AKAP95标记。插图是用0.1μg/ml Hoechst 33342标记的DNA。
附图40C图示免疫分析牛成纤维细胞(Fib)和原核胚(PN)中的核纤层蛋白B、核纤层蛋白A/C、NuMA和AKAP95。光栅，10μm(附图40A)，50μm(附图40B)。
附图41A-41D图解牛Nt胚胎中的核被膜、NuMA和AKAP95的动力学。用特定抗体(TRITC)，在PCC和PN阶段监控供体成纤维细胞的细胞核的分解以及新原核的装配(附图41A)。同时检测用相似的激活程序生成的孤雌生殖原核(Part.PN)。给出了用各种抗体标记的胚胎的百分数(±SD)(n约为20个胚胎/组，三个重复)。将受体卵母细胞用5μM离子霉素激活4分钟，然后用10μg/ml CHX/2.5μg/ml细胞松弛素D激活4小时(b)，如(b)中那样用离子霉素/CHX/细胞松弛素D激活，接着用10μg/mlCHX培养9个小时(b’)，或者在整个激活处理中如(b)中那样以及用5μg/ml Act D进行激活(b″)(附图41B)。将DNA(B中的插图)用Hoechst 33342标记。光栅，10μm。附图41C是相对于未处理(-)的NT胚胎(100％荧光；n＝30个胚胎/组，三个重复)，CHX和ActD处理的NT胚胎中的核纤层蛋白A/C和B以及NuMA的平均±SD免疫荧光强度的柱形图。附图41D是NT胚胎的原核中的AKAP95的细胞核内缔合的柱形图。在固定前，用0.1％Triton X-100/1mg/ml DNA酶I/300 Mm NaCl提取PN阶段的孤雌生殖体(Part.)和NT胚胎(NT)以及供体成纤维细胞(Fib)。通过免疫荧光检测核纤层蛋白B和AKAP95，并用Hoechst 33342染色DNA。数据表示为相对于未被提取的孤雌生殖胚胎或NT胚胎或体细胞中的荧光(100％荧光，n约30个胚胎/组，三个重复)，核纤层蛋白B、DNA和AKAP95的平均±SD荧光标记强度。光栅，10μm。
附图42A-42D证明CT生产缺乏核纤层蛋白A/C和NuMA的胚胎。通过在牛成纤维细胞的细胞核中进行免疫荧光检测来监控核纤层蛋白A/C和B、NuMA以及AKAP95的重新分布，该牛成纤维细胞的细胞核在有丝分裂的牛成纤维细胞的提取物中培养(Chaudhary等，J.Cell Biol.122295-306，1993)(附图42A)。用0.1μg/ml碘化丙啶标记DNA。给出表现为特定标记解离(标记不见)的细胞核的比例(在三个重复中n＞200个细胞核/标记)。通过CT、NT、NI或者孤雌生殖来生产PN胚胎并且在激活后的14个小时，通过免疫荧光检测核纤层蛋白A/C和B、NuMA以及AKAP95的分布(Poccia等，Trends Biochem.Sci.17223-227，1992和Chaudhary等，J.Cell Biol.122295-306，1993)(附图42B)。用Hoechst 33342标记DNA。在CT、NI或孤雌生殖的胚胎中特定标记的平均±SD免疫荧光强度相对于PN阶段的NT胚胎中的荧光强度(NT，100％荧光；n＝15-20个胚胎/标记，三个重复)(附图42C)。在用Triton X-100/DNA酶I/NaCl提取后，Pn阶段的NT和CT胚胎中的核纤层蛋白B、DNA和AKAP95的免疫标记强度(附图42D)。数值表示为分别相对于未被提取的原核期NT和CT胚胎的平均±SD荧光强度(n约15个胚胎/标记/处理，三个重复)。光栅，10μm(附图42A)，20μm(附图42B)。
附图43A-43B图示体外供体细胞核分解和TBP在由CT产生的重构的原核中的定位的改变。在免疫荧光分析供体成纤维细胞(Fib)、PCC阶段的浓缩染色质(NT PCC)和有丝分裂提取物中浓缩的供体染色体(MS 15 CC)、NT原核(NT PN)和CT原核(CT PN)后，在附图43B中比较TBP在NT和CT过程中的动力学。用Hoechst 33342标记DNA。光栅，20μm。各个阶段的TBP/AKAP95和TBP/DNA荧光强度示于附图43A和孤雌生殖的原核(Part.PN)(附图43B)中。给出每组10-13个胚胎中的平均±SD荧光强度。
附图44A是含有新霉素抗性基因的本发明朊病毒蛋白敲除载体的示意图(pBPrP(H)KOneo载体)。该示意示如何鉴定正确打靶的克隆。
附图44B是含有嘌呤霉素抗性基因的本发明朊病毒蛋白敲除载体的示意图(pBPrP(H)KOpuro载体)以及鉴定正确打靶的克隆的方法。
附图44C是列出在不同的牛成纤维细胞系中，本发明的朊病毒蛋白敲除载体在朊病毒蛋白基因座上的同源重组频率的表格。
附图45A图示来自NT和SLOT胚胎的原核中的核纤层蛋白B、核纤层蛋白A/C、NuMA、AKAP95和DNA的水平的照片。
附图45B是来自附图45A的荧光强度的图表。.
附图46A-46D描述在NT后的成纤维细胞的细胞核的动力学。附图46A显示核纤层蛋白B、核纤层蛋白A/C和TBP在牛成纤维细胞和IVP原核(PN)和8-16阶段的牛胚胎中的免疫荧光分布。插图是用Hoechst 33342标记的DNA。光栅(左边)10μm，(右边)50μm。附图46B是核纤层蛋白B、核纤层蛋白A/C和TBP在胎儿成纤维细胞和原核胚胎中的免疫印迹图片。附图46C是核纤层蛋白B、核纤层蛋白A/C和TBP在PCC和原核(NT-PN)阶段的NT胚胎中的免疫荧光分析。光栅，10μm。附图46D是特定蛋白质在IVP胚胎的雄性(MPN)和雌性(FPN)原核以及NT胚胎的原核(NT-PN)中的免疫标记强度的柱形图。数据表示为抗体荧光与Hoechst 33342(DNA)荧光的平均±SD比率。在(A，C，D)的3-5个重复中对每个标记分析20个以上胚胎。
附图47A-47C图示NT胚胎中的原核的特征。附图47A是在用1％Triton X-100/1mg/ml DNA酶I/300mM NaCl进行原位提取后，TBP和DNA(Hoechst 33342)在原核IVP和NT胚胎和在成纤维细胞中的免疫标记强度(平均数±SD)的柱形图。标记强度用相对于未被提取的胚胎的标记强度来表示(n＝30胚胎或细胞/组)。附图47B是图示在NT胚胎中标记的表达的照片，该胚胎如本文描述(b)或者在存在10μg/ml CHX或(b″)5μg/ml ActD时被激活(n＝30胚胎/组，2-3个重复)。插图为DNA。光栅，10μm。附图47C为特定蛋白质的免疫标记强度的比例(平均数±SD)的柱形图，与如附图47B中激活的胚胎中的Hoechst 33342(DNA)的荧光相比(n＝15-20胚胎/处理/标记)。
附图48图解SLOT程序。步骤一，用500ng/ml SLO可逆地透化供体成纤维细胞30分钟。步骤二，洗涤被透化处理的细胞，并在含有ATP再生体系的有丝分裂提取物中培养，使得染色体浓缩并促进去除细胞核组分(箭头)。步骤三，去除提取物，任选地在具有2mM CaCl2的培养基中再封闭细胞2小时。步骤四，将细胞融合到去核的卵母细胞中。步骤五，如NT一样激活卵母细胞，使得原核形成并发育。
附图49A-49C显示在有丝分裂提取物中诱导体细胞的细胞核崩解。附图49A证明有丝分裂提取物不会导致凋亡。完整的牛成纤维细胞(泳道1)、用5μg/ml洛克达唑处理20小时凋亡的成纤维细胞(泳道2)，或者将暴露于有丝分裂提取物(泳道3)或间期提取物(泳道4)1小时的SLO-透化处理的成纤维细胞用抗-PARP抗体进行免疫印迹(上组)。在0.8％琼脂糖中进行电泳并用溴化乙锭染色来评价DNA降解。附图49B是被透化处理的成纤维细胞在含有(+ATP)或者不含(-ATP)ATP-再生体系的有丝分裂提取物中培养45分钟后，对核纤层蛋白B、核纤层蛋白A/C、TBP和AKAP95的免疫荧光分析的图片。光栅，10μm。在4个重复中，1000多个被分析的细胞显示出如所示的稳定标记。附图49C是免疫印迹分析间期成纤维细胞(泳道1)、用1μg/ml洛克达唑同步化为有丝分裂期的成纤维细胞(泳道2)、从暴露于含有或者不含ATP-再生体系的有丝分裂提取物(泳道3、4)或者暴露于间期提取物的被透化成纤维细胞分离的染色质，以及暴露于有丝分裂提取物的整个透化成纤维细胞(泳道6)的图片。用特定蛋白的抗体对斑点进行探查。组蛋白H24作为凝胶中的蛋白加载对照。
附图50A-50D说明SLOT胚胎的细胞核的特征。附图50A图示通过如所述SLOT或NT将染色质导入卵母细胞后30分钟内的形态学(箭头)。虚线描绘了卵母细胞的细胞质。右边一组显示SLOT和NT胚胎中的供体染色质的放大图。光栅，20μm。附图50B图示核纤层蛋白B、核纤层蛋白A/C和TBP在通过NT或SLOT生产的原核期(上两组)和8-16-细胞期(下两组)的胚胎中的分布。光栅，20μm。(n＝20-30胚胎/标记，三个重复)。附图50C为对于在NT或SLOT胚胎的原核中指定的蛋白质，免疫标记强度与Hoechst 33342(DNA)荧光强度的比例(平均数±SD)的柱形图(n约20胚胎/标记，3个重复)。附图50D是相对于未被提取的胚胎，在用0.1％Triton X-100/1mg/ml DNA酶I/300mM NaCl提取后在原核NT和SLOT胚胎中的TBP的免疫标记强度(平均数±SD)和DNA(Hoechst 33342)的柱形图。(n＝15胚胎/组，2个重复)。
附图51A-51 E图示对SLOT和NT克隆的发育和形态学评价。附图51A是有关NT和SLOT克隆的体外发育的比例的柱形图。在特定妊娠时间进行超声波检查来评价妊娠率。还给出了小牛出生率和出生后(post-partum)24小时的小牛成活率。移植59个SLOT胚胎和211个NT胚胎后，分别获得12头小牛和23头小牛，存活8周以上。通过Fisher提取物试验计算P值。附图51B是5-6周龄的SLOT克隆(Simintal×Angus的杂交同一雌性)的照片。附图51C是在出生24小时内，单个SLOT和NT小牛和胎盘的分值的图表。附图51D是单个SLOT和NT克隆的出生重量的图表。在附图51C和51D中，在SLOT(圆点)或者NT(方形)克隆中，一种颜色代表同一个体的小牛分值、胎盘分值和出生重。附图51E是SLOT和NT克隆的小牛分值、胎盘分值和出生重量的箱形图形分析(box plot analysis)。
发明详述本发明部分基于采用在此描述的方法以令人惊奇的高频率灭活牛朊病毒基因座。大量正确打靶的朊病毒敲除细胞极大地方便了朊病毒敲除的有蹄类动物(例如牛)的生产。此外，本发明提供了提高核移植效率的改进方法，以进一步简化朊病毒敲除有蹄类动物的生产。这些生成的转基因有蹄类动物是农产品(例如肉类)和药品(例如由转基因有蹄类动物中的一种或多种异种核酸编码的人的治疗性抗体)的期望来源。
用于在供体牛细胞中灭活朊病毒基因座的敲除载体部分地基于登载的Genbank中的牛朊病毒蛋白基因座的序列(AJ298878)。用于构建敲除载体的朊病毒蛋白基因的基因组序列的来源与被遗传修饰的成纤维细胞种类的来源匹配。特别地，牛的朊病毒蛋白基因的基因组序列用于构建用于在牛来源的成纤维细胞中进行有效打靶的敲除载体。敲除载体含有两个与朊病毒基因座同源的区域，这两个基因座在朊病毒基因座中是连续的，敲除载体被设计来在朊病毒基因座中插入转录终止(STOP)序列以及侧翼有两个loxP位点的抗药基因。一种可替代的方案是，在敲除载体中使用两个不连续的同源区，以便删除两个同源区之间的内源性朊病毒蛋白基因区。为了降低朊病毒蛋白的活性，将序列恰好插入到外显子3的起始ATG密码子的后面。为了在基因座上进行有效的同源重组，一个同源区域比其他的同源区域长。特别地，3′区的长度为8.3kb，比1.1kb的5′同源区长得多。为了集中同源重组体，将阴性选择标记例如DT-A基因以与朊病毒蛋白基因相反的方向连接到短的5′同源区上。在转染前，用适当的限制性酶线性化敲除载体，使得基本的质粒载体如pBluescript的pUC可以被连接到阴性选择标记的末端上。此外，在加入到成纤维细胞之前，用含有1mM亚精胺的HBS(Hepes缓冲生理盐水)处理线性化的敲除载体，来增强同源重组。
可以将多胺和任何其他化合物添加到打靶载体中，以提高同源重组的效率。优选的多胺浓度为0.1-10mM；最优选地，浓度为1mM。多胺可选自，例如，亚精胺、精胺、尸胺和腐胺。优选多胺是亚精胺。其他化合物选自能够形成连接DNA磷酸残基的离子键的化合物，例如，多聚L-赖氨酸或多聚L-精氨酸。
通过安插阴性选择标记使之不暴露在线性化的打靶载体的末端，来提高同源重组效率。优选地，阴性选择标记的功能单位的5′和3′末端分别位于远离线性化的打靶载体的5′和3′末端的至少1Kb之处，优选至少2Kb处。通常，同源基因座序列位于阴性选择标记的5′和3′端，使得阴性选择标记距离线性化的打靶载体末端足够远。在线性化的打靶载体中，阴性选择标记的另一侧被设计来保留至少1Kb、优选2Kb的额外序列。例如，打靶载体中的pUC载体序列可以被用作这种额外序列。
在一种特定方法中，Holstein牛来源的敲除载体被电转化到Holstein牛的胎儿成纤维细胞中，并且获得半合子打靶克隆的频率令人惊奇地高于50％。大量的正确打靶克隆对于有效地制备健康胎儿和小牛来说是充足的。为了制备纯合打靶的胎儿和小牛，将分离自半合子打靶胎儿的半合子敲除成纤维细胞用相同的敲除载体或具有不同的抗生素抗性基因的敲除载体电穿孔来突变朊病毒基因座的残存的等位基因。可替代地，通过交配雄性的和雌性的半合子敲除牛来生产纯合子的敲除小牛。
生产表达异种抗体的有蹄类动物的方法将人免疫球蛋白基因座导入具有纯合的朊病毒蛋白敲除基因型的牛的成纤维细胞中，以生产人抗体的纯合朊病毒蛋白敲除牛(朊病毒蛋白KO/hAb牛)，如合适的方法包括，例如将含有重链和轻链免疫球蛋白基因的人类人工染色体(HAC)插入到有蹄类动物中或者将人类B细胞或B细胞前体插入到胎儿期或出生后的有蹄类动物中(例如，免疫缺陷或免疫抑制有蹄类动物)(参见，例如PCT公开WO01/35735和W002/074938)。
可以用常规方法来将期望的核酸插入到用于生产表达异种抗体的转基因有蹄类动物的供体细胞中，期望的基因中含有生产特定物种(例如人)的抗体的基因(优选整个基因座)。优选地，使用人类人工染色体，例如公开在PCT公开W097/07671和WOOO/10383中的那些。这些人类人工染色体还被公开在已授权的日本专利JP 30300092中。这些公开物的每一篇在此完全引入作为参考。此外，人类人工染色体或者含有和表达人类免疫球蛋白基因的转基因的构建方法被描述在Shen等，Hum.Mol.Genet.61375-1382(1997)；Kuroiwa等，NatureBiotechnol.181086-1090(2000)；Loupert等，Chromosome 107255-259(1998)；PCT公开WO00/10383、WO98/24893、WO96/33735、WO97/13852、WO98/24884和WO97/07671；以及美国专利5,877,397、5,874,299、5,814,318、5,789,650、5,770,429、5,661,016、5,633,425、5,625,126、5,569,825和5,545,806中，每一篇在此完全引入作为参考。还可以用人类人工染色体将异种抗体基因导入到野生型动物细胞中；这是采用上述方法来实现的。通过如在此描述的微细胞融合，将人工染色体导入到动物细胞中，特别是胎儿成纤维细胞中。
作为使用人类人工染色体的替代，可以使用YAC载体、BAC载体或者粘粒载体将编码免疫球蛋白的核酸整合到染色体中。采用已知的方法，例如电穿孔、脂转染、用包含YAC载体的酵母原生质球融合等，将包含异种Ig基因的载体(被描述在，例如PCT公开WO98/24893、WO96/33735、WO97/13852和WO98/24884，以及美国专利5,849,992和5,827,690中)导入到胎儿成纤维细胞中。此外，包含异种Ig基因的载体被打靶到胎儿成纤维细胞的内源性Ig基因座上，导致同时导入异种Ig基因并且破坏内源性Ig基因。
还可以如Lonberg等的专利(同上文)中所述，实施编码异种免疫球蛋白基因的核酸的整合。在用于将异种免疫球蛋白基因插入到宿主有蹄类动物的染色体中的“敲入”构建体中，一个或多个免疫球蛋白基因以及抗生素抗性基因被可操作地连接到启动子上，该启动子在构建体所转染的细胞类型中是有活性的。例如，组成活性的、诱导型的、或者组织特异性的启动子被用于激活被整合的抗生素抗性基因的转录，使得可以根据产生的抗生素抗性来选择被转染的细胞。可替代地，可以使用敲入构建体，其中含有Ig基因和抗生素抗性基因的敲入盒未被可操作地连接到启动子上。在这种情况下，基于在内源性启动子的调控下所产生的抗生素抗性标记的表达，来选择敲入盒中整合了内源性启动子的下游的细胞。这些所选择的细胞被用于在此描述的核移植程序，以生产含有被整合到宿主染色体中的异种免疫球蛋白基因的转基因有蹄类动物。
采用类似的方法学，可能制备和插入含有用于表达不同物种例如其中狗、猫、其他有蹄类动物、非人的灵长类的Ig的基因。如上所述，也是本领域所知晓的，不同种物种的免疫球蛋白基因在不同物种之间具有实质上的序列同源性。
一旦证实，被插入的人工染色体，例如人类人工染色体被稳定地插入到细胞系中，例如牛胎儿成纤维细胞，将该细胞系用作核移植的供体。这可以通过PCR方法来确定。生成的转基因小牛包含稳定导入的核酸，例如人类人工染色体。在获得稳定整合了核酸(例如，人类人工染色体)的小牛后，对该动物进行检测，确定它们是否表达对免疫和亲和力成熟响应的人Ig基因。
用于降低还表达异种抗体的有蹄类动物中的内源性抗体生产的方法还可以对上述整个方案进行改进。例如，在插入异种核酸之前或之后，在供体细胞中灭活一种或多种内源性Ig基因，来降低生成的转基因有蹄类动物所表达的内源性抗体的含量。此外，将保留了异种Ig基因的动物与内源性Ig基因被灭活的动物交配。用于连续操作供体细胞(例如牛成纤维性能)的示例性方案在下文描述。
首先，生产纯合的朊病毒蛋白敲除的胎儿成纤维细胞。然后，通过基因打靶生产半合子的牛免疫球蛋白重链(BIgH)敲除的成纤维细胞，用核移植方法(例如SLOT或染色质转移)生产胎儿。通过第二轮基因打靶，生产纯合的BIgH敲除的成纤维细胞，然后用核移植方法生产胎儿。通过基因打靶生产半合子的牛免疫球蛋白轻链(BIgL)敲除的成纤维细胞，接着通过核移植生产胎儿。通过两轮基因打靶来生产纯合的BIgL敲除的成纤维细胞，并通过核移植来生产胎儿。然后，将人类免疫球蛋白基因座导入上述具有纯合的朊病毒蛋白/BIgH/BIgL敲除的基因型的连续敲除成纤维细胞中，通过核移植方法来生产胎儿和小牛。
用于生产本发明的有蹄类动物的示例性方法用于生产有蹄类动物的优选方法包括在将供体遗传物质插入到受体卵母细胞来形成转基因的有蹄类动物之前重构该遗传物质，所生产的有蹄类动物在内源性朊病毒核酸上具有突变并且可选择地具有一个和多个编码异种抗体的核酸。重构是指任何提高生成的核移植卵母细胞的发育能力的形态学变化，这种变化改善了所得的核移植卵母细胞相对于通过将整个细胞或完整的核移植入受体卵母细胞而衍生物的卵母细胞的发育。再编程是通过在再编程培养基(例如，有丝分裂提取物、去垢剂和/或盐溶液，或者蛋白激酶溶液)中培养在内源性朊病毒核酸中具有突变以及任选地具有一个或多个编码异种抗体的核酸的细胞核来进行的，导致核被膜分解以及可能导致染色质的浓缩。这种核被膜分解以及染色质浓缩使得转录调控的蛋白的释放而结合到染色体上，这将促进卵母细胞、胚胎或胎儿发育所不期望要的基因转录。可以通过在染色质转移到受体卵母细胞之前将其纯化，以去除其他的调控蛋白。可选择地，从染色体上释放的特定调控蛋白可以被免疫消耗或者从再编程培养基(例如，细胞提取物)中去除，以防止它们重新结合到染色体上。在核移植后，在染色质解聚和在卵母细胞中形成核被膜的过程中，来自卵母细胞细胞质的新蛋白可能被结合到染色体上。这些蛋白质促进基因转录，允许卵母细胞发育成可存活的后代。
另一种可用于生产转基因有蹄类动物的克隆方法包括通过在再编程培养基(例如，细胞提取物)中培养被透化处理的细胞(即，在内源性朊病毒核酸中具有突变和任选地具有一个或多个编码异种抗体的核酸的细胞)以往该细胞中加入或者从中去除因子，来再编程该细胞。被透化处理的细胞的质膜优选被再封闭以包裹期望的因子并保留细胞膜的完整性。然后，将再编程的细胞转移到受体卵母细胞中，以生产克隆哺乳动物。这种克隆方法已经被用于生产不含异种免疫球蛋白核酸的胎儿，其存活了60天以上。初步研究结果表明，采用这种方法生产的胎儿的40-60天的胎儿存活率(7/10；70％)高于常规的核移植胎儿(8/16；50％)。可以预期，在内源性朊病毒核酸中具有突变和/或具有一个或多个编码异种抗体的核酸的胎儿也具有类似的结果。
在一种可替代的方法中，生产嵌合的胚胎，其中胎盘组织大部分来自一种遗传来源，而胎儿组织大部分来自另一种遗传来源。这种嵌合的胚胎较少发生胎盘畸形，从而可能提高存活率。在一种这种方法中，来自体外受精的胚胎或者天然胚胎的细胞与来自内源性朊病毒核酸中具有突变和任选地具有一个或多个编码异种抗体的核酸的胚胎的细胞接触，所述胚胎用常规核移植方法或者任何在此描述的其他克隆方法来生产。例如，来自体外受精的胚胎的细胞可以被注射到核移植胚胎的外周(例如，在透明带和胚胎本身之间)。这种方法用于生产不含有异种抗体基因的嵌合胚胎，与对照核移植胚胎的25％的存活率，其在40天时具有67％的存活率相比。可以预期，来自核移植胚胎的细胞也具有类似的结果，该核移植的胚胎在内源性朊病毒核酸中具有突变和/或具有一个或多个编码异种抗体的核酸。在一种可替代的方法中，在允许来自各个胚胎的细胞相互识别以生产单一的嵌合胚胎的条件下，用来自致密前的核移植胚胎的细胞培养来自致密前的体外受精胚胎或者天然胚胎的细胞(Wells和Powell，Cloning 29-22，2000)。在这两种方法中，来自体外受精的胚胎或者天然胚胎的细胞优先结合到胎盘中，而来自核移植方法的细胞优先结合到胎儿组织中。
本发明之前的技术状态虽然已经在小鼠中表达了人的Ig，但是由于抗体的基因结构、抗体生成机制和B细胞功能方面的差异，人的Ig是否会在牛或其他有蹄类动物中发生细微的重排和表达是不可预期的。特别地，与小鼠不同，牛和绵羊的免疫生理学与人类不同(Lucier等，J.Immunol.1615438，1998；Parng等，J.Immunol.1575478，1996；和Butler，Rev.Sci.Tech.1743，2000)。例如，与人类和小鼠中的基因重排相比，牛和绵羊中的抗体基因多样性更加依赖于基因转换。此外，在人类和小鼠中，B细胞最初定位在骨髓中，而在牛和绵羊中，B细胞定位在回肠派尔淋巴集结。因此，在本发明之前，可能难以，并非不可能，预期免疫球蛋白重排和人免疫球蛋白基因座的多样化是否发生在牛(或者其他有蹄类动物)的B细胞系中。此外，也难以预期在缺乏其内源性Ig时或者受人的抗体的干扰时，牛是否能够存活，即产生正常的免疫功能。例如，尚不确定表达人Ig的牛B细胞在牛体内是否能够正确迁移到回肠派尔淋巴集结中，这在人体内是不会发生的。此外，不清楚人的Fc受体功能在牛系统中是否是正常的，Fc受体介导补体活化、诱导细胞因子释放和抗原去除。由于不确定人的Ig是否将被功能性地表达，或者被以足够量表达以产生足够的免疫反应，因此难以预期这种有蹄类动物是否能够存活。此外，不确定人类染色体是否被稳定地维持在转基因有蹄类动物中。
虽然已经在上面描述了用于本发明的方法，所有的技术将在下文被更详细地说明。这些实施例被提供来阐明本发明，而不被解释为限定本发明。特别地，虽然这些实施例集中于转基因牛，但是所描述的方法可以用于生产和试验任何转基因有蹄类动物。
实施例1朊病毒蛋白活性降低的转基因有蹄类动物通过顺序的同源重组来生产其中PrP基因座的两个等位基因都被突变的牛成纤维细胞克隆。通过在恰好在外显子3的起始ATG密码子后插入新霉素或嘌呤霉素基因(neo或puro，如实施例3所描述)以及转录终止盒(STOP)，将用于生产PrP纯合敲除细胞的DNA构建体用来防止功能性的全长PrP mRNA的转录。因此，生成的未成熟的PrP转录物缺乏功能性编码区。首先，将含有neo基因的DNA构建体(即PrPKOneo载体)电穿孔到牛成纤维细胞系中，然后分离新霉素抗性克隆。根据PCR分析，在一些克隆中，在外显子3中发生同源重组。因此，生成了PrP基因座中的一个等位基因被突变的牛成纤维细胞。从半纯合的突变(半-PrPKO)的成纤维细胞中，产生了其中三个PrP基因座中的一个等位基因被突变的胎儿，并且重新建立半合子的成纤维细胞系。然后，将另一种含有puro基因的DNA构建体(即PrPKOpuro载体)第二次电穿孔到半合子-PrPKO成纤维细胞中，然后分离嘌呤霉素抗性克隆。根据PCR分析，在一些克隆中，在残存的等位基因的外显子3中以约5％的比例发生同源重组。通过这种方式，产生了其中PrP基因座中的两个等位基因都被突变的牛成纤维细胞克隆(纯合PrPKO)。
从被同源突变(纯合-PrPKO)的成纤维细胞中生产10个胎儿，其中PrP基因座的两个等位基因都被突变，并重新建立纯合-PrPKO成纤维细胞系。在这些纯合-PrPKO成纤维细胞中，通过RT-PCR分析确定完全缺乏PrP表达。还可以通过结合同一敲除载体和用较高浓度抗生素选择纯合敲除细胞来生产纯合-PrPKO成纤维细胞。通过核移植，从纯合-PrPKO成纤维细胞生产纯合-PrPKO小牛。
这些方法在下文被进一步描述。
朊病毒蛋白敲除载体的构建如下生产朊病毒蛋白敲除载体(附图44A)。为了分离朊病毒蛋白基因的外显子3周围的基因座DNA，用如下的引物对来PCR扩增DNA探针5′-CCA CAT AGG CAG TTG GAT CC-3′(SEQ ID NO69)and5′-ATA AGA GGC CTG CTC ATG GC-3′(SEQ ID NO70)。使用该探针，筛选牛(Holstein)基因座λ噬菌体文库，确定四个λ噬菌体的阳性克隆。用限制性作图进一步分析四个克隆中的一个克隆。将含有外显子3和1.2kb的BamHI-BglII片段的8.3kb BamHI基因座片段(3′同源臂)亚克隆到pBluescriptIISK(-)中，然后将neo和STOP表达盒插入到BamHI位点上，该位点正好在起始ATG密码子后面。将BglII位点转化成平端，在该位点中插入NotI-接头。然后将白喉毒素基因(DT-A，Gibco)添加到新生成的NotI位点上。以与新霉素抗性基因相反的方向在打靶盒中插入DT-A，以杀死其中打靶盒被随机整合到基因组中的细胞(pBPrP(H)Koneo载体)。还构建了含有puro基因的类似的敲除载体(pBPrP(H)Kopuro载体；附图44B)。可以用SrfI限制性酶(TOYOBO)来线性化这些朊病毒蛋白敲除载体，使pBluescriptIISK(-)连接到DT-A基因上。
转染/敲除程序用如下的常规电穿孔方案，进行雄性Holstein胎儿成纤维细胞系的转染。用于培养牛胎儿成纤维细胞的溶液含有500mlαMEM(Gibco，12561-049)、50ml胎牛血清(Hy-Clone#ABL13080)、5ml青霉素-链霉素(Sigma)和1ml 2-巯基乙醇(Gibco/BRL#21985-023)。在转染的前一天，将细胞植入T175组织培养瓶中，达80-100％的汇合率，通过显微镜检查确定。在转染的当天，将约107个牛成纤维细胞胰蛋白酶化，并且用αMEM溶液洗涤一次。在800μlαMEM中重悬细胞后，将已经溶解在含有1mM亚精胺的HBS(Hepes缓冲生理盐水)中的30μg pBprion蛋白质(H)KOneo载体添加到细胞悬浮液中，反复吹吸以充分混合。将细胞-DNA悬浮液转移到电穿孔试管中，在550V和50μF下进行电穿孔。此后，用添加了血清的αMEM溶液将被电穿孔的细胞加到60个24-孔平板上。培养48小时后，用含有500μg/ml的G418的培养基置换培养基，培养细胞2-3周，以选择新霉素抗性细胞。筛选后，挑取近100％汇合的所有克隆并分散到两个平板(24-孔平板)中。一个平板中的细胞用于基因座DNA提取，而另一个平板中的细胞用于核移植。从克隆中提取基因组DNA，通过PCR筛选期望的同源重组事件。典型地，分析约100个G418-克隆。
筛选打靶整合如上所述，采用PUREGENE DNA分离试剂盒(Gentra Systems)，按照生产商的方案，独立地从每个24-孔中提取基因组DNA。将各个基因组DNA重悬在20μl 10mM Tris-Cl(pH 8.0)和1mM EDTA(EDTA)中。使用如下的引物对通过PCR进行筛选F7(5′-TGT CAAAGA GAC ACT CCT CAT TTG TCT TCC-3′，SEQ ID NO71)和R7(5′-TCA TAG CCG AAT AGC CTC TCC ACC C-3′，SEQ ID NO72)。一个引物的序列位于敲除载体中，而另一个引物的序列恰好位于被打靶的内源性基因座中的整合载体的外面(附图44A)。因此，仅当敲除载体通过同源重组被整合到被打靶基因座中时，才能检测到期望的PCR产物。PCR反应混合物含有17.9μl水、3μl 10X LA PCR缓冲液II(Mg2+加)、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、2μl基因组DNA和0.3μl LA Taq。通过在如下条件下温育反应混合物，进行30个PCR循环85℃3分钟，94℃1分钟，98℃10秒和68℃5分钟。PCR后，通过电泳分析反应混合物。从约50％的94个所筛选的新霉素快速克隆中生成期望大小的PCR产物(附图44B)。还通过PCR扩增另一种引物对来证实这些阳性克隆F10(5′-TGA AGA TGT CCC AGT GCT GGG GAT-3′，SEQ ID NO73)和R10(5′-GAG TTA GGG GCG GGA CTA TGG TTG C-3′，SEQ IDNO74)，生成2.7kb的预期大小的PCR产物。在另一个成纤维细胞系、雌性F1(Holstein x Jersey)细胞系中也再现了超过50％的高同源重组频率(附图44C)。因此，无论所使用的起始细胞系是什么，已经成功地通过敲除载体产生了其中朊病毒基因座的一个等位基因被突变的牛成纤维细胞系。
染色质转移半合子朊病毒敲除细胞或者来自这些细胞的细胞核可以被用于在此描述的任何核移植方法中，以生产半合子朊病毒敲除的有蹄类动物(例如，敲除的小牛)。如果需要，来自敲除胎儿或活的蹄类动物的细胞可以按如下方式使用来生产纯合朊病毒敲除细胞。在一种特定方法中，用1μg/ml洛克达唑处理成纤维细胞(例如牛初生胎儿成纤维细胞)18小时，使其在有丝分裂期中同步化，通过有丝分裂期的抖落法(shake-off)收集，在磷酸缓冲的生理盐水中洗涤两次，和在细胞溶解缓冲液(20mM Hepes，pH 8.2，5mM MgCl2，10mM EDTA，1mMDTT和蛋白酶抑制剂)中洗涤一次。将沉淀的细胞重悬在一倍体积的冰冷的细胞溶解缓冲液中，在冰上膨胀1小时，用合适的玻璃研杵进行Dounce氏匀浆。在4℃下，以15,000xg离心溶解液15分钟，等分上清液(有丝分裂提取物)，在液氮中冷冻，保存在-80℃下。使用新鲜的或冷冻的提取物。
以20hpm，将体外成熟的卵母细胞去核。将来自所选择的克隆的被转染的牛胎儿成纤维细胞用不含Ca2+/Mg2+的Hank氏平衡盐溶液(HBSS)洗涤，在约37℃的水浴中，在加入31.2 U链球菌溶血素O(SLO；Sigma)的100μl HBSS的悬浮液中培养细胞进行透化。通过膜摄取不渗透的DNA染料碘化丙锭(0.1μg/ml)来评价透化。将透化的成纤维细胞沉淀、洗涤，并在约37℃下在40μl含有ATP-生成体系的有丝分裂提取物(1mM ATP，10 mM磷酸肌酸和25μg/ml肌氨酸激酶)中温育30-45分钟。用0.1μg/ml Hoechst 33342标记等分试样，监控染色质浓缩。温育后，用500μlαMEM/10％胎牛血清(Hyclone)稀释反应混合物。将细胞融合到去核的卵母细胞中；以28hpm激活卵母细胞，体外培养胚胎到囊胚期。每头雌性受体移植两枚胚胎。通过超声波检测来监控妊娠，对受体进行C-切片来回收胎儿以生产细胞系。
第二轮转染/敲除程序如下进行半合子-PrPKO胎儿成纤维细胞系的转染，其中第一个KO载体已经被整合到“等位基因A”上。用于培养牛胎儿成纤维细胞的溶液含有500ml αMEM(Gibco，12561-049)、50ml胎牛血清(Hy-Clone#ABL13080)、5ml青霉素-链霉素(Sigma)和1ml 2-巯基乙醇(Gibco/BRL#21985-023)。在转染的前一天，将细胞植入T175组织培养瓶中，达80-100％的汇合率，通过显微镜检查确定。在转染的当天，将约107个牛成纤维细胞胰蛋白酶化，并且用αMEM溶液洗涤一次。在800μlαMEM中重悬细胞后，将已经溶解在含有1mM亚精胺的HBS(Hepes缓冲生理盐水)中的30μg KO载体{pBPrP(H)KOpuro载体}添加到细胞悬浮液中，反复吹吸以充分混合。将细胞-DNA悬浮液转移到电穿孔试管中，在550V和50μF下进行电穿孔。此后，用添加了血清的αMEM溶液将被电穿孔的细胞加到30个48-孔平板上。培养48小时后，用含有1μg/ml的嘌呤霉素的培养基置换培养基，培养细胞2-3周，以选择嘌呤霉素抗性细胞。筛选后，挑取近100％汇合的所有克隆并分散到两个平板(24-孔和48-孔平板)中。一个平板中的细胞用于基因座DNA提取，而另一个平板中的细胞用于核移植。从克隆中提取基因组DNA，通过PCR筛选期望的同源重组事件。
用于同源打靶整合的筛选如上所述，采用PUREGENE DNA分离试剂盒(Gentra Systems)，按照生产商的方案，独立地从每个24-孔中提取基因组DNA。将各个基因组DNA重悬在20μl 10mM Tris-Cl(pH8.0)和1mM EDTA(EDTA)中。使用如下的引物对通过PCR进行筛选F14；5′-TTG CTCCAC CTT CCG TCT TCT GTC-3′(SEQ ID NO3)和R14；5′-GTTGGC GCC TAC CGG TGG ATG TG-3′(SEQ ID NO4)。一个引物的序列位于KO载体中，而另一个引物的序列在被打靶的内源性基因座中恰好位于被整合载体的外面(附
图1)。因此，仅当KO载体通过同源重组被整合到被打靶基因座中时，才能检测到期望的PCR产物。PCR反应混合物含有17.9μl水、3μl 10X LA PCR缓冲液II(Mg2+加)、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、2μl基因组DNA和0.3μl LA Taq。通过在如下条件下温育反应混合物，进行30个PCR循环85℃3分钟，94℃1分钟，98℃10秒和68℃5分钟。PCR后，通过电泳分析反应混合物。筛选332个克隆，结果15个克隆(#26，86，113，116，118，173，177，213，235，250，251，266，285，318，330)具有期望的PCR产物，通过测序PCR产物来证实。
基于多态序列，在所有克隆中，KO载体被整合到PrP基因座的外显子3的“等位基因B”中。8个克隆用于核移植来生产胎儿，并且来自#285的3个胎儿(#1395，1468，1476)和来自#113的7个胎儿(#1439-1，1439-2，1487，3583，3632，3682-1，3682-2，4961)被证实是纯合的PrP KO，其中puroKO载体和neoKO载体分别被整合到“等位基因B”和“等位基因A”中。因此，成功地生产了10个牛成纤维细胞系，其中PrP基因座的两个等位基因都被KO载体突变。
表1总结了与用来源于半合子PrP KO细胞系的纯合PrP KO克隆进行染色质转移后的妊娠有关的数据。
表1
在纯合-PrP胎儿中缺乏PrP的表达的验证从一些胎儿中建立了成纤维细胞，并且用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)提取总DNA。对1μl总DNA进行第一链cDNA分析(用于RT-PCR的上标第一链分析系统(SuperScript First-Strand SynthesisSystem for RT-PCR)；Invitrogen)，接着进行RT-PCR。按照如下进行RT-PCR。所用的引物为5′-AAG AAG CGA CCA AAA CCT GG-3′和5′-GTA ACG GTG CAT GTT TTCACG-3′。PCR反应混合物含有32.5μl水、5μl 10X Ex Taq缓冲液(TAKARA)、8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、2μl第一链cDNA和0.5μl Ex Taq(TAKARA)。通过在如下条件下温育反应混合物，进行35个PCR循环85℃3分钟，94℃1分钟，98℃10秒，60℃30秒钟，和72℃1分钟。PCR后，通过电泳分析反应混合物。虽然在野生型细胞和半合子PrP KO细胞中都检测到清晰的PCR产物，但是在10种纯合的-PrP KO细胞系的任何一种中都没有阳性PCR产物。该结果证明，在纯合的-PrP KO细胞系完全缺乏PrP表达。
实施例2HAC的导入和重排用于插入HAC的方法的总结对于在朊病毒基因的一个或两个等位基因中具有突变并且表达异种抗体的有蹄类等位(例如牛)的生产，可以采用常规方法来将表达异种抗体的核酸(例如HAC)插入到细胞中。例如，可以在朊病毒基因的一个或两个等位基因被灭活之前或之后插入HAC。如果需要，细胞中的一个或多个内源性抗体基因也被突变。然后，将该细胞用于常规的核移植方法中，以生产期望的转基因有蹄类动物，在下文进行更加详细的描述。
实际上，获得了含有人类人工染色体(例如，#14fg.，#2fg.，和#22fg.)的雄性和雌性牛胎儿成纤维细胞系，并由这些细胞系生产克隆的小牛。
例如，同时或依次地插入来源于人类染色体#14(“#14fg”，包含Ig重链基因)、人类染色体#2(“#2fg”，包含Igκ链基因和人类染色体#22(“#22fg”，包含Igλ链基因)的HAC。
通过雄性#14fg动物与雌性的#2fg以及#22fg动物交配并对后代进行评价，以检测这些染色体片段的传递。如果传递是成功的，那么交配两个品系以生产含有所有三个染色体片段的细胞系。
此外，将#14fg.、#2fg.和#22fg.染色体片段插入到胎儿细胞中(例如转基因的纯合H/L胎儿细胞)来生产克隆的小牛或者将转基因HAC小牛与其他转基因小牛(例如纯合H/L小牛)进行杂交。可替代地，如下文所述或者采用任何其他染色体转移方法，插入其他HAC，例如ΔHAC或ΔΔHAC。
基本原理HAC的种系传递对于将HAC导入动物(例如Ig敲除动物)来说是有用的，并且被用于成群繁育动物。通过品系传递HAC的关键在于减数分裂过程中染色体物质不完全配对。但是，如Tomizuka等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97722，2000)所证明，已经在小鼠中成功地进行种系传递。.
附
图1A中所描述的方法包括将#14fg.插入到雄性细胞系中，而#2fg.和#22fg.分别被插入到雌性细胞系中。生成具有HAC的小牛，通过雌性和雄性都可以检测种系传递。部分生成的后代(约25％)中含有重链和轻链HAC。进一步杂交，生成含有所有三种染色体片段的小牛品系。可选择地，这些动物用于与转基因动物(例如纯合H/L动物)杂交，如先前所描述，这些转基因动物由胎儿细胞生产。
试验设计细胞从最初的细胞系筛选中获得。这些细胞是Holstein或不同于上面所用的那些细胞的细胞系。这使得可以进行杂交并且在群体中保留尽可能多的遗传多样性。然后将HAC导入细胞中并选择阳性细胞系。所选择的细胞系被用于核移植并生产小牛。从12月龄开始，收集精液和卵子，受精，并移植到受体动物中。细胞样本用于DNA标记分析和核型分析。从出生开始，采集血液样本，并分析是否存在人的Ig蛋白。
如上所指出，采用上述试验发展的方法，还可任选地将HAC转移到纯合H/L细胞系中。
额外地提供下面的实施例来进一步例证本发明。
插入HAC的示例性方法进行其他试验来证明，可以单独地或组合地通过牛宿主来生产异种(例如人)免疫球蛋白重链(μ)和λ轻链。此外，这些试验证明，人免疫球蛋白链被重排，而且获得多克隆血清。在这些方法中，采用人类人工染色体将表达免疫球蛋白的基因插入到牛成纤维细胞中。然后，成纤维细胞被用于核移植，获得胎儿，并分析抗体生产。这些方法和结果将在下文中被更加详细地描述。预期，可以从成纤维细胞中获得类似的结果，从在朊病毒基因的一个或两个等位基因中具有突变的胎儿中分离这些成纤维细胞并将它们用于下文描述的导入HAC的方法中。可替代地，将Hac导入细胞中，然后(i)用HAC在细胞的朊病毒基因中导入突变或者(ii)用具有HAC的细胞在来自所生成的克隆胎儿的细胞中导入突变。
HAC构建体用先前描述的染色体克隆系统(Kuroiwa等，Nature Biotech.181086-1090，2000)，构建人类人工染色体(HAC)。简而言之，对于ΔHAC的构建，通过端粒定向染色体切断(Kuroiwa等，Nucleic AcidRes.，263447-3448，1998)，在AP000344基因座上切断先前报导的在HCF2基因座上含有整合的loxP序列的人类染色体22片段(hChr22)。接着，通过融合在AP000344基因座处切断的含有上述hChr22片段(hCF22)的DT40细胞克隆与含有稳定的可品系传递的人最小染色体SC20载体的DT40细胞克隆(称作“R克隆”)，生成细胞杂种。在S20片段的RNR2基因座上插入loxP序列来生产SC20载体。SC20片段是来源于人类染色体14的天然片段，包括人类Ig重链基因的整个区域(Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97722，2000)。生成的DT40细胞杂种含有两种hChr片段。用Cre重组酶表达载体转染DT40杂种，以诱导在hCF22和SC20载体之间进行Cre/loxP介导的染色体易位。用嵌套PCR分析稳定的转染子，以确定在SC20载体的loxP克隆位点上克隆了2.5兆碱基的hChr22区域，该区域由HCF2和AP000344基因座限定。然后，通过FACS细胞分类，根据所编码的绿色荧光蛋白的荧光，分离期望含有ΔHAC的PCR阳性细胞。对分类的细胞进行荧光原位杂交(FISH)分析，以验证含有2.5兆碱基hChr22插入物的ΔHAC的存在。
类似地，还采用染色体克隆系统构建ΔΔHAC。在AP000344基因座处切断hChr22片段，然后通过同源重组在DT40细胞中将loxP序列整合到AP000553基因座上。然后，生成的细胞与含有SC20最小染色体载体的R克隆融合。用Cre-表达载体转染细胞杂种，以进行Cre/loxP介导的染色体易位。通过PCR和FISH分析确定ΔΔHAC，其含有被AP000553和AP000344基因座限定的2.5兆碱基的hChr22插入物。
通过产生含有HAC的嵌合小鼠来评价ΔHAC和ΔΔHAC的体内功能性。然后采用常规方法(2001年5月11日申请的日本专利2001-142371)，将这些HAC分别导入到小鼠胚胎干(ES)细胞中，用这些干细胞生产嵌合小鼠。生成的小鼠具有高嵌合性(85-100％皮毛颜色)，证明含有这些HAC的ES细胞具有高水平的多能性以及这些HAC的体内有丝分裂稳定性。此外，ΔHAC通过ΔHAC嵌合小鼠品系传递到下一代，证明了这种ΔHAC的减数分裂的稳定性。
保留了这些HAC的鸡DT40细胞已经根据布达佩斯条约，于2001年5月9日提交独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(International Patent organism Depository，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566 Japan)保藏。保藏号如下ΔHAC(FERM BP-7582)、ΔΔHAC(FERM BP-7581)和SC20片段(FERM BP-7583)。保留这些HAC的鸡DT40细胞也已经保藏在台湾食品工业研究和发展研究所(Food Industry Research andDevelopment Institute)(FIRDI)。保藏号和保藏日期如下ΔHAC(CCRC 960144；2001年11月9日)、ΔΔHAC(CCRC 960145；2001年11月9日)和SC20片段(该细胞系以名称SC20(D)提交保藏；CCRC 960099；1999年8月18日)。
ΔHAC中的2.5兆碱基(Mb)的hChr22插入片段由以下BAC毗连群构成，所述毗连群由以下Genbank登录号列出AC002470、AC002472、AP000550、AP000551、AP000552、AP000556、AP000557、AP000558、AP000553、AP000554、AP000555、D86995、D87019、D87012、D88268、D86993、D87004、D87022、D88271、D88269、D87000、D86996、D86989、D88270、D87003、D87018、D87016、D86999、D87010、D87009、D87011、D87013、D87014、D86991、D87002、D87006、D86994、D87007、D87015、D86998、D87021、D87024、D87020、D87023、D87017、AP000360、AP00361、AP000362、AC000029、AC000102、U07000、AP000343和AP000344。ΔΔHAC中的1.5Mb的hChr22插入片段由如下的BAC毗连群构成AP000553、AP000554、AP000555、D86995、D87019、D87012、D88268、D86993、D87004、D87022、D88271、D88269、D87000、D86996、D86989、D88270、D87003、D87018、D87016、D86999、D87010、D87009、D87011、D87013、D87014、D86991、D87002、D87006、D86994、D87007、D87015、D86998、D87021、D87024、D87020、D87023、D87017、AP000360、AP00361、AP000362、AC000029、AC000102、U07000、AP000343和AP000344(Dunham等，Nature 402489-499，1999)。
牛胎儿成纤维细胞的产生为了生产牛胎儿成纤维细胞，从Trans Ova(Iowa)家畜舍内饲养的经过疾病检查的Holstein母牛或Jersey母牛中收集45-60天的胎儿，其中记录父本和母本连续三代的谱系。将所收集的胎儿在湿冰上运送到Hematech′s Worcester Molecular Biology Division，以生产原代胎儿成纤维细胞。到达后，将胎儿转移到组织培养柜的非组织培养级的100mm塑料培养皿中。使用无菌镊子和剪刀，从所述胎儿中去除胚外膜和脐带。将胎儿转移到新的塑料培养皿后，去除头部、肢体和内脏。将去除内脏的胎儿转移到含有约10ml胎儿冲洗液的第三个培养皿中，所述胎儿冲洗液由以下物质组成125ml含有Ca2+和Mg2+的1×Dulbecco′s-PBS(D-PBS)(Gibco-BRL，目录号14040)；0.5ml酒石酸泰乐菌素(Tylosine Tartrate)(8mg/ml，Sigma，目录号T-3397)；2ml青霉素-链霉素(Sigma，目录号P-3539)；和1ml两性霉素(Fungizone)(Gibco-BRL，目录号15295-017)(混合并通过0.2μm尼龙过滤装置[Nalgene，目录号150-0020]过滤)。
用胎儿冲洗液将各个胎儿再洗涤3次，以去除微量血液，将其转移到50ml锥形组织培养管中，用无菌手术刀片将其轻轻地切碎成小片。用无Ca2+和Mg2+的1×D-PBS(Gibco-BRL，cat#.14190)洗涤组织片一次。在组织片沉降到管底部后，去除上清液，替换成约30ml的细胞解离缓冲液(Gibco-BRL，目录号13151-014)。将管倒置数次，以便让其混合，然后在组织培养箱中，在38.5℃/5％CO2下温育20分钟。在组织片沉降到管底部后，去除上清液，更换成等体积的新鲜细胞解离缓冲液。将组织和细胞解离缓冲液混合物转移到一个带有24mm圆端旋转棒的75ml的无菌玻璃胰蛋白酶化的烧瓶中(WheatonScience Products，cat#.355393)。将烧瓶转移到38.5℃/5％CO2组织培养箱中，置于磁力搅拌板上，以足以有效混合的速度搅拌大约20分钟。将烧瓶转移到组织培养柜中；使组织片沉降，然后去除上清液，通过以1,200rpm离心5分钟来收集解离细胞。将细胞沉淀重悬在小体积的成纤维细胞的完全培养基中，该培养基的组成如下440ml αMEM(BioWhittaker，目录号12-169F)；50ml经照射的胎牛血清；5mlGLUTAMAX-I添加剂(Gibco-BRL，目录号25050-061)；5ml青霉素-链霉素(Sigma，目录号P-3539)；1.4ml 2-巯基乙醇(Gibco-BRL，目录号21985-023)(将除了胎牛血清外的所有组分混合，然后通过0.2μm尼龙过滤装置[Nalgene，目录号151-4020]过滤)，并在冰上贮存。再重复所述解离过程3次，在每个步骤中使用另外的30ml细胞解离液。将细胞合并；用成纤维细胞完全培养基洗涤；顺序通过23号和26号针头，最后通过70μm细胞过滤器(B-D Falcon，目录号352350)，产生单细胞悬浮液。通过在血细胞计数器中，在存在锥虫蓝(0.4％溶液，Sigma，目录号T-8154)的情况下计数，测定细胞密度和活力。
在成纤维细胞完全培养基中，将原代成纤维细胞以1×106活细胞/T75cm2组织培养烧瓶的细胞密度，在38.5℃/5％CO2下扩大培养。培养3天后，或者在细胞汇合前，用1×D-PBS(不含Ca2+和Mg2+)洗涤烧瓶1次，并与10ml细胞解离缓冲液在室温下温育5-10分钟，来收获成纤维细胞。用倒置显微镜目测监控细胞的解离。在该步骤中，小心确保通过研碎来使细胞团块分散。在洗涤和量化后，解离的成纤维细胞随时可以用于基因打靶试验。这些细胞也可以被冷冻保存以供长期保藏。
将HAC导入牛胎儿成纤维细胞中采用微细胞介导的染色体转移(Kuroiwa等Nature Biotech.181086-1090，2000)，将ΔHAC和ΔΔHAC从所述DT40细胞杂种转移到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，在添加了10％FBA(Gibco)、1mg/mlG418和0.2mg/ml潮霉素B的F12(Gibco)中，于37℃和5％CO2下培养含有ΔHAC的CHO克隆(“D15克隆”)。将D15克隆在12个T25烧瓶中进行扩大培养。当汇合度达到80-90％时，以0.1μg/ml的浓度往培养基中加入秋水仙酰胺(Sigma)。3天后，将培养基更换为添加了10μg/ml细胞松弛素B(Sigma)的DMEM(Gibco)。以8,000rpm离心烧瓶60分钟，收集微细胞。让微细胞通过8-、5-和3-μm滤器(Costar)来纯化，然后重悬在DMEM培养基中。如下所述，将所述微细胞与牛成纤维细胞融合。
在添加了10％FBS(Gibco)的α-MEM(Gibco)中，于37℃和5％CO2下对牛胎儿成纤维细胞进行培养。在T175烧瓶中对成纤维细胞进行扩大培养。当汇合度达到70-80％时，用0.05％的胰蛋白酶使细胞与烧瓶分离。用DMEM培养基洗涤成纤维细胞两次，然后铺在所述微细胞悬浮液上。在以1,500rpm离心所述微细胞-成纤维细胞悬浮液5分钟后，按照生产商的方案，将PEG1500(Roche)加到细胞沉淀中，使得微细胞与牛成纤维细胞融合。融合后，将融合细胞装载到24-孔平板上，在添加了10％FBS的α-MEM培养基中培养24小时。然后用含有0.7mg/ml G418的培养基替换该培养基。在G418抗生素存在下生长大约2周后，选择具有G418抗性的融合细胞。如下所述，将这些G418抗性克隆用于核移植。
类似地，通过MMCT，将ΔΔHAC从CHO克隆C13转移到牛胎儿成纤维细胞中。所选择的G418抗性克隆被用于核移植。
核移植、激活和胚胎培养基本上如早先的描述实施核移植方法(Cibelli等，Science 19982801256-1258)。在成熟后约18-20小时(hpm)，将体外成熟的卵母细胞去核，用苄基亚胺(Hoechst 33342，Sigma)标记，在紫外线下验证染色体去除。通过应用2.4kV/cm持续20秒的单个电脉冲(Electrocell manipulator 200，Genetronics，San Diego，CA)，使这些胞质-供体细胞双联体融合。3-4小时后，取出所有被转移的双联体的一个25％的随机亚组，通过双苄基亚胺标记被转移的细胞核来证实融合。在30hpm时，将重构的卵母细胞和对照如先前所描述的方法(Lin等，Mol.Reprod.Dev.199849298-307；Presicce等，Mol.Reprod.Dev.199438380-385)，用钙离子载体(5μM)激活4分钟(CalBiochem，San Diego，CA)和用含有10μg放线菌酮和2.5μg细胞松弛素D(Sigma)的ACM培养基激活6小时。激活后，在HEPES缓冲中国仓鼠胚胎培养基(HECM-Hepes)中洗涤卵子5次，然后置于4孔组织培养板中培养，该培养板中含有经照射的小鼠胎儿成纤维细胞和0.5ml胚胎培养基，并且覆盖0.2ml经过胚胎检验的矿物油(Sigma)。每个孔中放置25-50枚胚胎，在38.5℃下、5％CO2的气体环境中培养。第4天，往培养基中加入10％FCS。
胚胎移植在第7天和第8天，分别将核移植囊胚移植到第6天和第7天的同期化的受体母牛中。采用一次性注射Lutalyse(Pharmacia&Upjohn，Kalamazoo，MI)，接着检查发情来使受体母牛同期化。在胚胎移植后的第30天和第60天，通过超声波成像检查妊娠的存在，此后，每30天通过直肠触诊来进行检查，直到270天。HAC在这些牛的胎儿中的保留情况被总结在表2中，并且在以下章节中被更加详细地描述。
表2牛胎儿中的HAC保留情况的总结
含有人染色体#14的片段的HAC的导入以与上述方法基本相同的方法，将SC20片段、人染色体#14片段(“hchr.14fg”，含有Ig重链基因)导入胎儿成纤维细胞中。也可以采用任何其他常规的染色体转移方法来将该HAC或含有人Ig基因的另一种HAC插入到供体细胞中。所得到的供体细胞可以用于常规的核移植技术中，例如上述的那些技术，以生产具有HAC的转基因有蹄类动物。
通过超声波检查28头妊娠受体的妊娠情况，给这些受体移植了来自含有chr.14fg的细胞的克隆胚胎。结果总结在表3中。
如果需要，来自所得的HAC胎儿或HAC后代的细胞可以被用于第二轮核移植，以生产其他克隆后代。来自最初的HAC胎儿或HAC后代的细胞也可以被冷冻，形成一种细胞系，作为其他HAC有蹄类动物生产的供体细胞来源。
表3使用含有hchr.14fg的供体细胞于40天时的妊娠
妊娠率低于预期的。这是由于在胚胎移植期间的极其异常的炎热天气。
如附图27中所示，携带HAC的胚胎的妊娠率似乎与非转基因克隆的妊娠率相当。最近，一头怀有ΔΔHAC小牛的受体产下一头活的健康幼仔。其他受体将在接下来的数月内生产。
人重链基因座在ΔHAC牛胎儿中重排和表达的证明在各个妊娠天数时取出克隆的ΔHAC转基因牛胎儿，分析其中人的免疫球蛋白基因座的存在、重排和表达。对通过RT-PCR从这些胎儿之一的脾脏和非淋巴组织(肝脏和大脑)获得的基因组DNA和cDNA进行分析，表明所述ΔHAC的存在、重排和表达。
在ΔHAC胎儿中存在人重链和/或轻链为了确定在ΔHAC胎儿中是否存在人的重链和轻链，从ΔHAC胎儿中分离肝脏DNA，通过PCR分析是否存在编码人重链和轻链的基因组DNA。
为了检测基因组重链DNA，使用以下引物VH3-F5′-AGT GAGATA AGC AGT GGA TG-3′(SEQ ID NO1)和VH3-R5′-CTT GTGCTA CTC CCA TCA CT-3′(SEQ ID NO2)。用于检测λ轻链DNA的引物为IgL-F5′-GGA GAC CAC CAA ACC CTC CAA A-3′(SEQ IDNO3)和IgL-R5′-GAG AGT TGC AGA AGG GGT YGA CT-3′(SEQID NO4)。PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl 10×Ex Taq缓冲液、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物和10pmol反向引物、1μl基因组DNA和0.3μl Ex Taq。在如下条件下温育反应混合物来进行38个PCR循环85℃3分钟，94℃1分钟，98℃10秒钟，56℃30秒钟，和72℃30秒钟。
如附图5所示，胎儿#5968，6032和6045都含有人重链(μ)和轻链(λ)基因座。胎儿#5996仅含有人重链基因座。胎儿#5983不含人重链基因座，并且可能不含人轻链基因座。胎儿#5846不含任何一种人序列。因此，胎儿#5983和5846可能没有保留HAC。这些结果表明，ΔHAC可以在牛中稳定地保留到妊娠的第58天。
在ΔHAC胎儿#5996中存在人Cμ外显子包括Cμ3和Cμ4部分的特异于mRNA转录的引物被用于检测胎儿#5996中ΔHAC是否存在以及是否表达编码人μ基因座恒定区的转录物。
对于人μ重链的基因组恒定区的RT-PCR分析，使用引物“CH3-F1”(5′-acc acc tat gacagc gtg ac-3′，SEQ ID NO5)和“CH4-R2”(5′-gtggca gca agt aga cat cg-3′，SEQ ID NO6)，生成350bp的RT-PCR产物。这种PCR扩增通过最初在95℃下变性保温5分钟来进行。然后，在95℃下1分钟，59℃下1分钟和72℃下2分钟，进行35个循环的变性、退火和扩增。然后，在72℃下保温反应混合物10分钟。如下所述，用引物I7L和P9来检测重排的牛重链(附图7)。作为内部对照，用引物“GAPDH正向”(5′-gtcatcatc tct gcc cct tct g-3′，SEQID NO7)和“GAPDH反向”(5′-aac aac ttc ttg atg tca tca t-3′，SEQID NO8)来检测GAPDH RNA的水平。对于GAPDH RNA的扩增，在95℃下保温样本5分钟，接着于95℃1分钟、55℃1分钟和72℃2分钟，进行35个循环的保温。然后，在72℃下保温混合物7分钟。
该分析表明，对胎儿#5996脾脏的RT-PCR分析产生一个条带(泳道3)，其与用对照人脾脏cDNA(泳道4)和来自ΔHAC嵌合小鼠的cDNA(泳道5)产生的扩增产物相匹配(附图6)。在非淋巴组织牛肝脏(泳道1)或牛大脑(泳道2)中未检测到这种条带。在肝脏(附图6的泳道10)和大脑(附图7的泳道6)中成功地扩增了管家基因GADPH，表明了这些组织支持RT-PCR的能力。
妊娠77天时牛重链基因座的重排检测ΔHAC胎儿#5996，检测其是否经历了免疫球蛋白重链基因座重排所需的重组系统表达和激活所必需的发育过程。对于该分析，进行常规的RT-PCR分析来检测是否存在编码μ-VH重排的mRNA转录物。使用引物“17L”(5′-ccc tcc tct ttg tgc tgt ca-3′，SEQID NO9)和“P9”(5′-cac cgt get etc ate gga tg-3′，SEQ ID NO10)，通过RT-PCR分析分离自胎儿的#5996脾脏、肝脏和大脑的RNA。在95℃下保温PCR反应混合物3分钟，然后采用如下条件95℃1分钟，58℃1分钟和72℃2分钟，进行35个循环的变性、退火和扩增。然后，在72℃下保温反应混合物10分钟。
附图7的泳道5表明，得到预期大小的重排牛重链扩增产物(450bp)。该产物迁移到与对照牛Cμ重链cDNA扩增产物的位置相当的位置上(泳道7)，已知所述对照含有对应于重排的牛重链转录物的序列。如所预期的，重排的重链在脾脏中表达(泳道5)，但是在该发育阶段的大脑(泳道2)和肝脏(泳道3)中无表达。
人重链基因座在ΔHAC胎儿#5996中的重排和表达通过扩增包括Cμ和VH区域部分的DNA区段，证明人重链基因座的重排和表达。用特异于包括Cμ(Cμ1)和VH(VH3-30)部分的RNA转录物的引物来确定，是否存在含有重排人Cμ-VDJ序列的RNA重链物(附图8)。
对于该RT-PCR分析，引物“Cμ1”(5′-cag gtg cag ctg gtg gag tctgg-3′，SEQ ID NO11)和″VH3-30″(5′-cag gag aaa gtg atg gagtc-3′，SEQ ID NO12)被用来制备450bp的RT-PCR产物。该RT-PCR按如下进行将反应混合物于95℃下保温3分钟，接着进行40个循环的95℃30分钟，69℃30分钟和72℃45分钟，和72℃下10分钟的一个保温循环。将这种RT-PCR产物用相同引物案进行再扩增，95℃下3分钟的一个保温循环，95℃1分钟，59℃1分钟和72℃1分钟的40个保温循环，以及72℃下10分钟的一个保温循环。作为内部对照，如上所述，进行GAPDH的RT-PCR扩增。
附图8中的凝胶表明，对来自胎儿#5996的脾脏的RT-PCR分析产生一个条带(泳道5)，与用人脾脏cDNA(泳道4)或ΔHAC嵌合小鼠脾脏cDNA(泳道1)产生的扩增产物相匹配。在非淋巴组织牛肝脏(泳道2)或牛大脑(泳道3)中未检测到这种条带。作为阳性对照，GADPH RNA的扩增(泳道8和9)表明这些组织支持RT-PCR的能力。
还使用引物CH3-F3(5′-GGA GAC CAC CAA ACC CTC CAAA-3；SEQ ID NO13)和CH4-R2(5′-GTG GCA GCA AGT AGACATCG-3′；SEQ ID NO14)，通过RT-PCR分析，证实了人重链区在胎儿#5996中的重排和表达。这些PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl 10×Ex Taq缓冲液、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物和10pmol反向引物、1μl cDNA和0.3μl Ex Taq。在如下条件下温育反应混合物来进行40个PCR循环85℃3分钟，94℃1分钟，98℃10秒钟，60℃30秒钟，和72℃30秒钟。
如附图9的泳道6和7所示，来自胎儿#5996的脾脏的扩增序列与来自两个阳性对照的剪接恒定区片段的大小相同，阳性对照为来自人脾脏的样本(泳道8)和ΔHAC嵌合小鼠脾脏cDNA(泳道9)。如所预期，来自正常小鼠脾脏和牛脾脏的阴性对照不含扩增序列(泳道1和2)。来自胎儿#5996的肝脏和大脑的样本不含与经过剪接的人μ重链恒定区片段一样大小的扩增的剪接序列，但是含有来源于污染RNA样本的基因组DNA的未剪接基因组片段的扩增序列(泳道3、4和5)。
人重链基因座在ΔHAC胎儿中的VDJ重排还进行了RT-PCR分析，以进一步证实重链基因座在ΔHAC胎儿#5996中发生了VDJ重排。进行嵌套RT-PCR，第一个反应使用引物Cμ-1(5′-CAGGAGAAAGTGATGGAGTC-3′；SEQ ID NO15)，第二个反应使用引物Cμ-2(5′-AGG CAG CCA ACG GCC ACGCT-3′；SEQ ID NO16)，两个反应中都使用引物VH3-30.3(5′-CAG GTG CAGCTG GTG GAG TCTGG-3′；SEQ ID NO17)。RT-PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl 10×Ex Taq缓冲液、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物和10pmol反向引物、1μl cDNA和0.3μl Ex Taq。进行RT-PCR，在第一个反应中在如下条件下进行38个循环85℃3分钟，94℃1分钟，98℃10秒钟，65℃30秒钟和72℃30秒钟。对于第二个反应，使用引物VH3-30.3和Cμ-2(5′-AGG CAG CCA ACG GCCACGCT-3′；SEQ ID NO16)，在如下条件下进行38个循环85℃3分钟，94℃1分钟，98℃10秒钟，65℃30秒钟和72℃30秒钟。
如附
图10的泳道6和7所示，对胎儿#5996的脾脏进行RT-PCR分析，产生大小与泳道8和9中的阳性对照一样的重链条带。来自胎儿#5996的肝脏和大脑的样本含有某些污染性的重排DNA(泳道3和5)。泳道1和2中的阴性对照产生大小不正确的条带。
通过测序证实ΔHAC重排从ΔHAC胎儿#5996的脾脏的RNA反转录得到cDNA，用特异于重排的人μ重链的引物扩增该cDNA，并在琼脂糖凝胶上进行电泳。从凝胶上切取通过Cμl-VH3-30引物对扩增得到的条带。从该条带上回收扩增的cDNA并将其克隆。纯化来自所得的经过PCR检测为重排的人μ阳性的克隆的DNA，并对其进行测序(附
图11A)。
来自该ΔHAC胎儿的序列与20种以上的已知人重链序列的同源性超过95％。例如，人抗肺炎球菌抗体的μ链与该序列的一个区具有97％的同源性(附
图11B)。
通过用引物Cμ-2和VH3-30.3对胎儿#5996的脾脏进行RT-PCR分析，接着用该引物进行再扩增，还得到来自重排的人重链的其他序列。CHROMA SPIN柱(CLONETECH)纯化RT-PCR产物，并按照生产商的方案，将其克隆到pCR2.1 TA克隆载体上(InVitrogen)。在10μl体积的反应混合物中进行染料终止序列反应(ABI AppliedSystem)，该混合物由BigDye终止剂反应混合物(3μl)、模板质粒(200ng)和Cμ-2引物(1.6pmol)组成。采用ABI 3700测序仪进行测序。对于该分析，在以下条件下进行25个循环96℃1分钟、96℃10秒钟、55℃5秒钟和60℃4分钟。
鉴定出至少两种重排的人重链转录物，其是VH3-11/D7-27/JH31Cp和VH3-33/D6-19/JH21Cp(附
图12A和12B)。这些结果证明，在胎儿#5996的脾脏中，所述ΔHAC中发生人μ重链基因座的VDJ重排。从同一个胎儿中鉴定出不止一种重排的重链序列，还证明了ΔHAC胎儿能够产生多种人免疫球蛋白序列。
人重链和轻链基因座在ΔΔHAC胎儿中的重排和表达在不同妊娠天数，从受体母牛中取出来源于牛胎儿成纤维细胞ΔΔHAC染色体转移的克隆胎儿。分析这些胎儿携带人免疫球蛋白重链和λ轻链基因座的HAC的存在和重排。对来自这些组织的基因座DNA的研究表明，在某些胎儿中存在人免疫球蛋白重链和轻链。对来源于这些胎儿的脾脏的cDNA进行检查表明，在某些胎儿中免疫球蛋白重链和轻链基因座存在重排和表达。FACS分析也证明了，人λ轻链蛋白在其中两个胎儿的脾脏淋巴细胞表面上表达。
在ΔΔHAC胎儿中存在人重链和轻链基因座为了确定ΔΔHAC胎儿是否保留了人重链和轻链基因座，对来自58天的胎儿#5580、57天的胎儿#5848以及91天的胎儿#5442A和5442B的肝脏的基因组DNA进行了PCR分析。用于检测重链基因座的PCR引物为VH3-F(5′-AGT GAG ATA AGC AGT GGATG-3′；SEQID NO18)和VH3-R(5′-CTT GTG CTA CTC CCA TCACT-3′；SEQID NO19)，而用于检测轻链的引物为IgL-F(5′-GGA GAC CAC CAAACC CTC CAAA-3′；SEQ ID NO20)和IgL-R(5′-GAG AGT TGCAGA AGG GGT YGACT-3′；SEQ ID NO21)。PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl 10×Ex Taq缓冲液、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物和10pmol反向引物、1μl基因组DNA和0.3μl Ex Taq。如下进行38个PCR循环85℃3分钟，94℃1分钟，98℃10秒钟，56℃30秒钟和72℃30秒钟(附
图13和14)。
如附
图13和14所示，阳性对照58天的胎儿#5580含有人重链和轻链免疫球蛋白两个基因座。此外，91天的胎儿#5442A和5442B也含有重链和轻链两个基因座(附
图14)。相反，胎儿#5848不含任何的人基因座，也可能不含ΔΔHAC。这些结果表明，ΔΔHAC可以在牛中稳定地保留到妊娠的第91天。
人重链基因座在ΔΔHAC胎儿#5442A中的重排和表达用RT-PCR来检测重排的人重链RNA转录物在ΔΔHAC胎儿#5542A中的表达。所用的RT-PCR引物为CH3-F3(5′-GGA GAC CACCAA ACC CTC CAAA-3′；SEQID NO22)和CH4-R2(5′-GAG AGTTGC AGA AGG GGT GACT-3′；SEQ ID NO23)。RT-PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl 10×Ex Taq缓冲液、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物和10pmol反向引物、1μl cDNA和0.3μl Ex Taq。如下进行40个RT-PCR循环85℃3分钟，94℃1分钟，98℃10秒钟，60℃30秒钟和72℃30秒钟。
附
图15的泳道4和5含有来自胎儿#5442A的脾脏的扩增剪接μ重链恒定区序列，其大小与所述阳性对照样本的大小相似。这些结果表明，胎儿#5442A在其脾脏中表达一种重排的μ重链转录物。在未剪接的基因座序列的区域中也观察到模糊的条带，它们是从DNA样本中的污染的基因组DNA扩增得到的。来自胎儿#5442A的肝脏和大脑的对照样本不产生扩增重排序列所预期大小的条带。
人重链基因座在ΔΔHAC胎儿#5868A中的重排和表达用RT-PCR来检测重排的人重链RNA转录物在一个妊娠119天的ΔΔHAC胎儿(胎儿#5868A)的脾脏中的表达。用于该分析的引物为VH30-3(5′-cag gtg cag ctg gtg gag tctgg-3′；SEQ ID NO24)和CM-1(5′-cag gag aaa gtg atg gagtc-3′；SEQ ID NO25)。此外，引物“GAPDH上”(5′-gtc atc atc tct gcc cct tctg-3′；SEQ ID NO26)和“GAPDH下”(5′-aac aacttc ttg atg tea tca t-3′；SEQ ID NO27)用于扩增GAPDH对照转录物。对于该PCR分析，将反应混合物在95℃下保温5分钟，然后通过在95℃下保温1分钟、58℃下保温1分钟和72℃下保温2分钟，进行多个变性、退火和扩增的循环。然后，将混合物在72℃下保温10分钟。
附
图16的泳道3含有对ΔΔHAC胎儿#5868A分析所产生的RT-PCR产物。该RT-PCR产物具有扩增重排的人重链的预期大小(470bp)，并且在凝胶中迁移到与已知含有对应于重排的人转录物的序列的对照cDNA相同的位置。作为对照，当用引物进行扩增时，ΔΔHAC胎儿#5868A的脾脏cDNA和正常的牛cDNA样本都产生一种产物，证明了该cDNA支持扩增的能力(泳道7和8)。
人λ基因座在ΔΔHAC胎儿#5442A和5442B中的重排和表达使用特异于包括人λ部分的转录物的引物，来检测来自重排的人λ轻链基因座的RNA转录物。
对于附
图17所示的RT-PCR分析，使用引物Cλ1(5′-GGG AATTCG GGT AGA AGT TCA CTG ATCAG-3′；SEQ ID NO28)、Cλ2-3(5′-GGG AAT TCG GGT AGA AGT CAC TTA TGA G-3′；SEQ IDNO29)和Cλ7(5′-GGG AAT TCG GGT AGA AGT CAC TTA CGAG-3′；SEQ ID NO30)的等摩尔混合物以及引物Vλ1 LEA1(5′-CCCCCA AGC TTR CCK GST YYC CTC TCC TC-3′；SEQ ID NO31)。所述RT-PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl10×Ex Taq缓冲液、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物和10pmol反向引物、1μl cDNA和0.3μl Ex Taq。RT-PCR的条件如下85℃3分钟，94℃1分钟，98℃10秒钟，60℃30秒钟和72℃1分钟，进行40个循环。
如附
图18所示，该RT-PCR分析还使用引物Vλ3LEA1(5′-CCCCCA AGC TTG CCT GGA CCC CTC TCT GG-3′；SEQ ID NO32)、Vλ3JLED(5′-ATC GGC AAA GCT TGG ACC CCT CTC TGG CTCAC-3′；SEQ ID NO33)和VλBACK4(5′-CCC CCA AGC TTC TCGGCG TCC TTG CTT AC-3′；SEQ ID NO34)的等摩尔混合物以及引物Cλ1(5′-GGG AAT TCG GGT AGA AGT TCA CTG ATCAG-3′；SEQID NO35)、Cλ2-3(5′-GGG AAT TCG GGT AGA AGT CAC TTA TGAG-3′；SEQ ID NO36)和Cλ7(5′-GGG AAT TCG GGT AGA AGT CACTTA CGA G-3′；SEQ ID NO37)的等摩尔混合物。所述RT-PCR的反应条件与以上关于附图7所述的条件相同。
附
图17的泳道6和7以及附
图18的泳道4和5含有来自胎儿#5442A的脾脏的RT-PCR产物，其大小与阳性对照条带类似，这表明该胎儿中存在重排的轻链RNA转录物。来自胎儿#5442B的脾脏样本产生非常微弱的大小合适的条带(在该照片上不可见)。该RT-PCR产物表明，胎儿#5442B也在其脾脏中表达重排的轻链免疫球蛋白转录物。正如所预期的，来自#5442A和5442B大脑的样本不表达人的重排λ轻链转录物。
人λ基因座在ΔΔHAC胎儿#5868A中的重排和表达在ΔΔHAC胎儿#5868A中，也检测到重排的人λ轻链基因座的RNA转录物。对于这一分析，使用特异于包括人λ部分的转录物扩增的引物，来检测编码重排的人λ基因座部分的转录物的ΔΔHAC编码的表达。该分析中使用引物VL1 LEAI(5′-ccc ccaagc ttR ccK gSt Yyc ctctcctc-3′；SEQ ID NO38)，以及引物CL1(5′-ggg aat tog ggt aga agtcac tga tcag-3′；SEQ ID NO39)、CL2-3(5′-ggg aat tog ggt aga agt cactta tgag-3′；SEQ ID NO40)和CL7(5′-ggg aat tog ggt aga agt cac ttacgag-3；SEQ ID NO41)的等摩尔混合物。对于该RT-PCR反应，将反应混合物在95℃下保温5分钟，然后在95℃下保温1分钟、在60℃保温1分钟和在72℃下保温2分钟进行多个变性、退火和扩增的循环。然后，将混合物在72℃下保温10分钟。
该分析证明，来自ΔΔHAC#5868A的脾脏cDNA(附
图19的泳道4)产生与TC小鼠脾脏cDNA(泳道6)阳性对照相同大小的RT-PCR产物。使用得自ΔΔHAC#5868A的大脑或肝脏cDNA(分别为泳道2和3)，未检测到这种RT-PCR产物。用引物“GAPDH上”和“GAPDH下”成功地扩增管家基因GAPDH(泳道8和10)，表明这些组织中的每一种都能够支持RT-PCR。
通过测序证实ΔΔHAC重排使用引物Cλ1、Cλ2-3和Cλ7的等摩尔混合物以及引物VλlLEAl，或者使用引物Vλ3LEAl、Vλ3JLEAD和VλBACK4的等摩尔混合物以及引物Cλ1、Cλ2-3和Cλ7的等摩尔混合物，对胎儿#5442A的脾脏样本进行RT-PCR分析。用CHROMA SPIN柱(Clontech)纯化PCR产物，并按照生产商的方案，将其克隆到pCR2.1 TA克隆载体(Invitrogen)中。使用Cλ1、Cλ2-3和Cλ7的等摩尔混合物，进行染料终止剂序列反应(ABI Applied System)。以96℃1分钟、96℃10秒钟、55℃5秒钟和60℃4分钟进行25个循环。10μl反应混合物中含有BigDye终止剂反应混合物(3μl)、模板质粒(200ng)和Cλ1、Cλ2-3和Cλ7引物(1.6pmol)。用ABI 3700测序仪分析反应混合物。
鉴定出至少两种重排的人λ轻链转录物(V1-17/JL3/Ck和V2-13/JL2/Ck)。这些结果证明，人λ轻链基因在胎儿#5442A的脾脏的ΔΔHAC中发生VJ重排(附图20和21)。
人λ轻链和牛重链在ΔΔHAC胎儿#5442A和5442B中的表达的FACS分析分析来自ΔΔHAC胎儿#5442A和5442B的脾脏淋巴细胞中人λ轻链和牛重链蛋白的表达。这些细胞与藻红蛋白标记的抗人λ抗体(附图22C和22D)、FITC标记的抗牛IgM抗体(附图22D和22H)或无抗体(附图22A、22B、22E和22F)在4℃下反应20分钟。然后用添加了2％FCS的PBS洗涤细胞两次，并在FASCalibur细胞分类器上进行分析。用无抗体对照来电子设定门控(electronically set thegates)，计算与所述抗体反应的细胞的百分率。这些百分率显示在各个频率曲线的下方。胎儿#5442A(附图22A-22D)和胎儿#5442B(附图22E-22H)表达人λ轻链蛋白和牛重链蛋白。
人抗体蛋白在HAC小牛中的表达如上所述，一种新方法被开发来生产染色体转移(Tc)的小牛(附图37)。这种方法克服了由于原代牛成纤维细胞仅有约35个群体倍增的有限寿命以及必需有大量DNA插入物被导入和维持在供体细胞中的限制。特别地，用人类人工染色体(HAC)载体将完整的未被重排的人Ig重链(IgH)和λ轻链(IgR)基因座导入到牛原代成纤维细胞。通过制备克隆的胎儿，来复原和扩增所选择的成纤维细胞克隆。选择克隆的胎儿细胞并再克隆以生产四个健康的Tc小牛，其功能性地重排重链和轻链人Ig基因座并生产人多克隆抗体。这些结果证明，使用HAC载体生产转基因家畜的可行性。更加重要的是，含有人Ig基因的Tc牛可以被用于生产新的人多克隆治疗剂，可应用于从预防抗生素抗性感染到抗击生物恐怖的范围。这些方法在下文被更加详细地描述。
采用在此描述的MMCT技术，将HAC从CHO克隆导入到牛胎儿成纤维细胞中。将成纤维细胞置于用G418(700pg/ml)对HAC载体上的neo基因标记的筛选下，直到出现克隆。在该步骤中避免完全的抗生素筛选和基于DNA的筛选，以使核移植前的细胞分化最小化。根据生长和形态学来挑选克隆，并且如先前的描述进行核移植(Lucier等，J.Immunol.1615438-5444，1998)。由于该细胞仅在少数几天内对核移植来说是有用的，在通过生产克隆胎儿来复原和扩增后进行最后的筛选。
发育到囊胚阶段的比例范围在17-21％之间，而40天的妊娠率在22-50％之间，细胞系之间没有差异。在第56-58天，取出四个ΔHAC胎儿和两个ΔΔHAC胎儿，重建成纤维细胞系，冷冻保存来用于进一步的分析和核移植。通过G418抗性(附图38A)以及IgH和Igλ基因座的基因组PCR(附图38B)，评价HAC在来自56-58天收集的胎儿和7个在77-119天收集的胎儿的成纤维细胞系中的保持率。13个胎儿中的9个对G418具有抗性，而它们中的8个显示具有人IgH和Igλ基因座。三个ΔHAC(#5968、#6032和#6045)以及一个ΔΔHAC(#5580)阳性的56-58天的胎儿用于再克隆和生产后代。通过RT-PCR分析，接着对扩增产物进行测序，来评价人Ig基因座在5个阳性的77-119天的胎儿中的表达和重排。在所有胎儿中表达人IgH和Igλ基因(附图38C)并且显示了正确的V(D)J重排(附图38D)的证据。
通过37头受体，再克隆的ΔHAC细胞系生产了1头雄性(细胞系#6045)和5头雌性小牛(细胞系#5968和#6032)(16％，附图39A)。两头来源于细胞系#6032的小牛在出生后的48小时内死亡。一头小牛来自非再生的ΔΔHAC细胞。全部的5头小牛都很健康，并且表型正常。通过G418选择、基因组PCR和荧光原位杂交(FISH)分析(附图39B和39C)，确定在所有小牛中保留了HAC。FISH分析结果表明，HAC作为独立染色体被保留，而且保留HAC的细胞比例为78-100％。在外周血淋巴细胞(PBLs，91％)和成纤维细胞(87％)之间，没有观察到明显的保留率的差别。供体细胞系#6045可能具有比供体细胞系#5968更高的保留率(分别为97％和86％)。有意思的是，Tc牛中的保留率可能比先前本发明人在小鼠中所观察的更高。为了确定人Ig基因座是否在小牛以及胎儿中被重排和表达，本发明人对PBLs进行了RT-PCR分析。本发明人在PBLs中观察到人IgH以及Igλ基因的表达，并且通过测序分析确定人IgH和Igλ的所有组分的多样性(表4)。一套代表性的序列显示了分布在基因座上的VH/Vλ、DH和JH/Jλ区段的广泛利用。在Igλ转录物中，观察到了来自VH1和VH3的V区段的频繁利用，该利用与VH区段在人中的利用相似。在IgH和Igλ转录物中还观察到非种系核苷酸的添加(N-添加)以及核苷酸的删除。这在重链和轻链的第三互补决定区(CDR3s)中产生高度多样化。此外，通过固相ELISA确定，在7头小牛的5头中，在饲喂初乳前采集的血液样本中检测到13-258ng/ml的人Ig蛋白(在新生牛犊中，Ig表达通常非常低，以至于不可检测)。这些数据表明，采用再克隆策略，可以在原代细胞中有效地进行HAC转移，并且HAC中所携带的人Ig基因可以被正确地加工，并在Tc小牛中高度多样性地被表达。
本发明的结果表明，染色体克隆、染色体转移和体细胞再克隆技术的组合可以被用于生产保留了携带Mb大小的基因组转基因的HAC载体的健康小牛。此外，这些技术被用于证明在牛中人IgH和Igλ基因的完整基因座的转移和保留。有意思的是，已经证明在具有与人或小鼠完全不同的免疫生理学的种类中，这两个基因座进行正确的加工并且表达功能性重排的人免疫球蛋白基因。该HAC系统对于表达多种复杂的人类蛋白(例如血红蛋白)以及用于药学应用的大的蛋白质集合来说是有用的。例如，在本研究中生产的Tc小牛，保留了人IgH和Igλ基因座，可以用于人多克隆抗体的生产。目前，人类多克隆抗体仅能够从人类血液或血浆供体中获得。因此，存在人类多克隆产物的供应和应用的限制。Tc奶牛可以被超免疫化来生产大量新的用于治疗多种人类疾病的多克隆治疗剂。
表4克隆的Tc小牛中的人免疫球蛋白重链和λ轻链转录物的所有组成成分分析通过RT-PCR扩增人μ和λ的特异性mRNA，进行克隆和测序。给出了10个独立的μ和λ克隆中的每一个的V(D)J连接的核苷酸序列，划分成VH/Vλ、DH、JH/Jλ和N区段，通过与公开的种系序列的同源性来鉴定(Ig-BLAST)。
实施例3在一个或多个内源性抗体具有突变的生产异种抗体的转基因有蹄类动物在如实施例2中所述的表达异种抗体并且在朊病毒基因中具有突变的有蹄类动物中，可任选地通过突变一个或多个内源性抗体基因，来降低内源性抗体的表达。通过相对于功能性内源性重链和轻链基因的数量，增加功能性异种免疫球蛋白重链或轻链基因的数量，表达期望的异种抗体(例如人类治疗性抗体)的B细胞的数量将增加。
为了生产这些转基因有蹄类动物，可以让ΔHAC或ΔΔHAC转基因有蹄类动物与内源性免疫球蛋白链(例如μ重链或者λ或κ轻链)的一个或多个等位基因中含有突变的转基因有蹄类动物交配。如果需要，可以让所得到的转基因有蹄类动物与(i)在内源性α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒和/或J链核酸的一个或两个等位基因中具有突变的转基因有蹄类动物或者(ii)含有外源性J链核酸(例如人的J链核酸)的转基因有蹄类动物进行交配。可替代地，通过突变一个或多个内源性免疫球蛋白基因来遗传修饰来自ΔHAC或ΔΔHAC转基因胎儿的细胞(例如胎儿成纤维细胞)。在另一种可能的方法中，ΔHAC或ΔΔHAC被导入到细胞中(例如胎儿成纤维细胞)，在该细胞中，内源性免疫球蛋白(μ重链和/或λ轻链)被半合灭活或者纯合灭活。在任一上述方法中，还可以通过(i)在内源性α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒和/或J链核酸的一个或两个等位基因中导入突变，优选敲除突变或者(ii)导入外源J链核酸来遗传突变细胞。然后，将得到的转基因细胞用于核移植方法中，来生产期望的转基因有蹄类动物。以下描述示例性的方法。
DNA构建体可以使用上述的μ重链(附图2A)、λ轻链、κ轻链、α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒和/或J链敲除构建体。可替代地，可以使用下述的嘌呤霉素抗性μ重链构建体(附图3F)。设计该构建体来去除牛μ重链基因座的4个主要的编码外显子，但是保留完整的跨膜结构域，使μ重链基因座被灭活。
按如下方式装配嘌呤霉素构建体。将含有紧邻编码外显子1的区域的4.4Kb的XhoI片段插入到pBluescript II SK+的XhoI位点上。质粒pPGKPuro含有嘌呤霉素抗性基因，得自Peter W.Laird博士，Whitehead Institute，USA。将含有嘌呤霉素抗性基因的1.7Kb XhoI片段亚克隆到存在于多接头区域中的SalI位点上，邻近4.4Kb片段并且位于其下游。该1.7Kb嘌呤霉素标记取代了牛免疫球蛋白重链基因座的编码外显子CH1、CH2、CH3和CH4。含有位于野生型基因组序列中的这四个外显子下游的μ基因座的4.6Kb区的XbaI片段被添加到该构建体中，作为第二个同源区。
为了生产最终的打靶构建体，通过用NotI和MluI切割这三种装配好的片段，生成该构建体的亚克隆。MluI的限制性消化将4.6Kb片段截短为1.4Kb。NotI位点位于多接头中，并且不可切割成亚克隆DNA本身。将MluI位点用Klenow片段补平，产生平端。利用存在于pBluescript载体中的NotI和SmaI位点，将NotI/补平的MluI片段亚克隆到新的Bluescript IISK+载体中。对于基因打靶，用NotI线性化最后的载体。
通过电穿孔进行基因打靶和对转染的成纤维细胞进行药物筛选对于电穿孔，将1×107个经历了有限次数群体倍增的牛胎儿成纤维细胞(例如按实施例2所述从ΔHAC或ΔΔHAC转基因胎儿获得的成纤维细胞)的单细胞悬浮液以1200rpm离心5分钟，重悬在0.8ml的无血清α-MEM培养基中。将重悬的细胞转移到0.4cm电穿孔样品池中(Invitrogen，cat&num；P460-50)。接着，加入30μg限制性酶线性化的基因打靶载体DNA，并用1ml移液管将样品池中的内容物混合，然后进行一个室温下2分钟的温育步骤。将样品池插入到GenePulserII电穿孔系统(Biorad)的振荡室(shaking chamber)中，然后以1000伏特和50μF进行电穿孔。迅速将样品池转移到组织培养柜中，用吸管将电穿孔的细胞加入到约30ml的成纤维细胞完全培养基中。将细胞等分到30个100mm的组织培养皿(Corning，cat#431079)中，轻轻地旋转，使细胞均匀分布，然后在38.5℃/5％CO2下温育16-24小时。吸出培养基，更换为含有所选的选择药物的完全成纤维细胞培养基。每两天进行培养基的更换，持续总共7-14天。在所述药物的选择过程中，目测监控代表性的平板来检测细胞的死亡和集落的形成。设定阴性对照平板，该阴性对照平板含有无基因打靶载体时电穿孔的成纤维细胞，在所述药物的选择过程中应该不产生集落。
挑选药物抗性的成纤维细胞集落和进行细胞扩增在药物筛选步骤完成后(通常7-14天)，药物抗性集落是宏观可见的，随时可供转移到48孔组织培养板中以进行扩增。为了辅助转移过程，在用彩色记号笔(Sharpie)在组织培养平板的底部圈出单个集落。用1×D-PBS(无Ca2+和Mg2+)洗涤含有克隆的组织培养平板2次，然后在每个平板中加入5ml细胞裂解缓冲液的1∶5稀释液。在3-5分钟的室温温育步骤之后，单个集落与组织培养皿的底部开始分离。在集落分离之前，用P200移液器和气溶胶阻挡吸头(aerosol barrierpipette tip)(200或250μl)将它们分别转移到48孔组织培养平板的单个孔中。在转移后，用吸管反复吹吸，使集落完全解离，然后加入1ml成纤维细胞完全培养基。为了确保所述细胞具有药物抗性，继续在整个所述48孔阶段中进行药物筛选。在38.5℃/5％CO2下培养转移的集落，并且用倒置显微镜目测监控。2-7天后，将接近汇合的孔用1×D-PBS(无Ca2+和Mg2+)洗涤2次，加入0.2ml细胞离解缓冲液，接着在室温下温育5分钟，使细胞与底部分离。分离后，用P1000移液器和气溶胶阻挡吸头(1000μl)反复吹吸，使细胞进一步分离。将约75％的离解的成纤维细胞转移到24孔组织培养平板的各个孔中，进一步进行扩大培养，以供后续的PCR分析用，将剩余的25％转移到第二个24孔平板的一个孔中，进行扩大培养，最后用于体细胞核移植试验。当在含有75％的原始细胞的平板中的细胞增殖到接近汇合时，从这些克隆中分离DNA，用于遗传分析。
DNA制备用于分离供遗传分析用的DNA的方法是由Laird等，Nucleic AcidsResearch，1991，Volume 19，No.15的方法改进得到的。特别地，一旦一种特定的克隆在24孔平板的一个孔中已经达到接近汇合，则从该孔中吸出培养基，用PBS洗涤贴壁细胞2次。吸净PBS，更换为0.2ml缓冲液，来解离所述细胞并从待分离的DNA中消化过量的蛋白质。该缓冲液由100mMTris-HCl(pH 8.5)、5mM EDTA、0.2％SDS、200mMNaCl和100μg/ml蛋白酶K组成。将24孔平板放回到组织培养箱中达最少3小时，从而使DNA释放并消化蛋白质。将该方法的粘性产物转移到1.5ml微量离心管中，加入0.2ml异丙醇以沉淀DNA。通过离心回收沉淀，用70％乙醇漂洗DNA沉淀，风干后，将沉淀重悬于25-50μl含有10mM Tris，pH8和1mM EDTA的缓冲液中。该DNA用于克隆的PCR分析。
克隆筛选用两种不同的方法来筛选克隆，这两种方法都采用聚合酶链式反应(PCR)。所有在本章节中描述的方法都适用于任何其他基因的打靶，不同之处仅为用于遗传分析的引物序列。
按照第一种方法，用不同的两对引物来独立扩增稳定转染的产物。用一对引物来检测克隆的基因组中打靶载体的存在，而不考虑整合位点。引物被设计来退火到存在于打靶载体中的DNA序列上。该PCR反应的产物的强度可能与已经整合到基因组中的打靶载体的拷贝数相关。因此，通过所述PCR反应仅含有一个拷贝的打靶载体的细胞往往产生强度较弱的条带。另一对引物被设计来仅检测整合到所需基因座中的载体的拷贝。在这种情况下，一种引物被设计来退火到打靶载体内，而另一种引物被设计来退火到打靶载体中不存在的、对打靶基因座特异的序列上。在这种情况下，只有当打靶载体紧邻打靶载体中不存在的所述位点发生整合时，才可以检测到PCR产物，指示期望的打靶事件。如果检测到产物，则用该克隆进行核移植。
对于新霉素抗性的重链敲除构建体，用引物Neol(5′-CTT GAAGAC GAA AGG GCC TCG TGA TACGCC-3′；SEQ ID NO42)和IN2521(5′-CTG AGA CTT CCT TTC ACC CTC CAG GCACCG-3′；SEQ ID NO43)来检测细胞中打靶载体的存在，不考虑整合的位置。用引物Neol和OUT3570(5′-CGA TGA ATG CCC CAT TTC ACC CAAGTC TGTC-3；SEQ ID NO44)来特异性地仅扩增整合到μ重链基因座的打靶构建体的那些拷贝。
对于用来分析所述新霉素抗性的重链敲除构建体的整合的这些PCR反应，使用Qiagen PCR试剂盒。该PCR反应混合物含有1pmol各种引物、5μl 10倍反应缓冲液、10μl Q溶液、5μl DNA和1μl dNTP溶液。用水使反应混合物的总体积达到50μl。在94℃下利用起始变性温育3分钟来进行PCR扩增。然后，在94℃下温育45秒钟、60℃下温育45秒钟和72℃下温育2分钟来进行30个循环的变性、退火和扩增。然后，将反应混合物在72℃性温育5分钟，并在4℃下温育直到从PCR仪中取出混合物。
在可替代的方法中，采用单个的引物套来扩增打靶的基因座，并且PCR产物的大小可用于确定是否正确打靶。设计一种引物来退火到不存在于打靶载体中的基因座区域上，而设计另一种引物来退火到存在于打靶载体但是不存在于野生型基因座中的位点上。在这种情况下，不会检测到整合到基因座的不期望位点上的打靶载体。由于被打靶载体删除的区域在大小上与插入该位置的药物筛选标记不同，产物的大小取决于所扩增的基因座是野生型基因型的或者是靶向基因型的。来自含有不正确插入或者根本未插入打靶载体的克隆的DNA扩增，产生预期大小的野生型基因座的单一PCR产物。来自含有正确打靶(“敲除”)的等位基因的克隆DNA扩增产生两种PCR产物，一种代表野生型等位基因的扩增，一种代表由于抗药性标记取代野生型等位基因中的某些序列所致的、大小可以预测的、被改变的等位基因的扩增，等位基因的长度不同于所取代的序列。
对于嘌呤霉素抗性的重链敲除构建体，使用引物短端(5′-CTGAGC CAA GCA GTG GCC CCGAG-3′；SEQ ID NO45)和长端(5′-GGG CTG AGA CTG GGT GAA CAG AAG GG-3′；SEQ ID NO46)。这对引物扩增野生型重链基因座以及已经被嘌呤霉素构建体正确打靶的基因座。两个条带大小之间的差别约为0.7Kb。存在较短的条带表明正确打靶。
对于用于分析嘌呤霉素抗性的重链敲除构建体的整合的PCR反应，采用Promega Master Mix试剂盒。所述PCR反应混合物含有1pmol各种引物、2.5μl DNA和25μl 2X Promega Master Mix。用水使反应混合物的总体积达到50μl。在94℃下起始变性保温2分钟来进行PCR扩增。然后，在94℃下保温45秒钟、在60℃下保温45秒钟和在72℃下保温2分钟，进行30个循环的变性、退火和扩增。然后，将反应混合物在72℃下保温5分钟，并在4℃下保温直到从PCR仪中取出混合物。
第一轮核移植所选择的其中免疫球蛋白基因被灭活的成纤维细胞被用于如实施例2所述进行核移植，以生产转基因有蹄类动物，其在内源性免疫球蛋白基因中含有突变并且含有编码异钟免疫球蛋白基因的HAC。可替代地，采用常规方法进行核移植，将来自所选择的转基因成纤维细胞的细胞核或者染色质(即无膜包被的一个或多个染色体)插入到去核的卵母细胞中(被描述在如2000年12月22日申请的U.S.S.N.60/258,151)。这些方法还可以用于其中α-(1，3)-半乳糖基转移酶、朊病毒和/或J链核酸被突变的细胞。
第二轮诱变和核移植如果需要，从由第一轮核移植生产的转基因有蹄类动物中获得细胞(例如，胎儿成纤维细胞)。可以如上所述进行另一轮基因打靶来灭活在第一轮打靶中被灭活的基因的第二个等位基因。可替代地，另一个免疫球蛋白(例如μ重链、λ轻链、κ轻链或J链)、α-(1，3)-半乳糖基转移酶或朊病毒基因在这一轮打靶中被灭活。对于第二轮打靶，可以使用高浓度的抗生素，或者使用具有不同抗生素抗性标记的敲除构建体。如上所述选择抗生素抗性细胞。所选择的细胞可以如上所述用于第二轮核移植，以生产例如在内源性免疫球蛋白基因中含有两个突变并且含有编码异种免疫球蛋白基因的HAC的转基因有蹄类动物。可替代地，首先处理所选择的抗生素抗性细胞，以便如下所述分离G1期的细胞，该细胞被用于第二轮核移植。
为了分离用于核移植的G1期细胞，在分离前24小时，将5.0×105个细胞铺到含有10mlα-MEM+FCS的100mm的组织培养平板上。在第二天，用PBS洗涤平板，并且在分离前的1-2小时更换培养基。然后在Vortex-Genie 2(Fisher Scientific，Houston，TX，中速)上振荡30-60秒钟，去除培养基，以1000G离心5分钟，将沉淀重悬在250μlMEM+FCS中。然后选择通过胞质桥连接的新分裂的细胞双联体，因为这些细胞处于G1早期。这种分离方法称作“抖落(shake-off)”法。
实施例4用于突变内源性免疫球蛋白基因的其他方法在本发明方法的一些实施方案中，在朊病毒基因中具有一个或多个突变的有蹄类动物中生产异种免疫球蛋白，基本上通过结合使用同源重组技术、导入携带完整异种Ig基因座的人工染色体、核移植并且施用抗体来消除内源性抗体来实现。更加特别地，虽然还可以在Ig核酸中无突变的动物中实现异种抗体的生产，该方法优选包括靶向破坏IgM重链基因的一个或两个等位基因和任选的Ig轻链基因的一个或两个等位基因。可以通过连续的同源重组，然后进行另一个交配操作，来实现基因敲除。在优选实施方案中，这通过采用合适的同源重组载体首先对组织培养中的雄性或雌性有蹄类动物(例如牛)的IgM重链基因的一个等位基因进行靶向破坏来实现。相对于其他体细胞，使用胎儿成纤维细胞是优选的，由于这些细胞容易繁育，并且容易在组织培养中被遗传操作。但是，对于本发明来说，使用胎儿成纤维细胞不是必要的，实际上，可以用其他细胞系来替代，并具有相当的效果。
当然，这种方法必需构建具有与打靶IgM重链等位基因同源的区域的DNA构建体，使得整合到有蹄类动物基因组的IgM重链等位基因中的构建体破坏其表达。用于实施这种打靶破坏IgM等位基因的示例性载体被描述在如下实施例中。在这一点上，用于在打靶位点上提供同源重组的构建载体的方法对于本领域技术人员来说是已知的。此外，在这种情况下，合适载体的构建在本领域技术人员的水平之内，特别是在牛重链和Igλ轻链基因的序列，以及来自其他有蹄类动物的免疫球蛋白基因序列是已知的情况下(参见下文)。为了方便同源重组，用于实现同源重组和IgM基因灭活的载体分别包含实质上具有与有蹄类动物IgM重链和Ig轻链基因的序列同一性的DNA部分。优选地，这些具有至少98％序列同一性、更加优选至少99％序列同一性以及更高序列同一性的序列，将与靶向基因座是同基因的，以方便同源重组以及靶向删除或灭活。
典型地和优选地，该构建体将包含提供对期望的同源重组体，例如成纤维细胞进行筛选的标记基因，其中IgM重链基因和/或Ig轻链基因已经被有效地破坏。其中，示例性的标记基因包括抗生素抗性标记、抗药性标记和绿色荧光蛋白。优选的构建体示于附图2A中，而用于制备这种构建体的起始材料示于附图3A和3B中。采用标准的分子生物学技术可以生产含有两个与内源性免疫球蛋白基因同源的区域的其他构建体，并应用于本发明的方法中，该免疫球蛋白基因的侧面是可操作地连接到启动子上的阳性选择标记(例如抗生素抗性基因)。
示于附图2A和3C中的μ敲除构建体被设计来去除称作“C-μ外显子1-4”的编码牛免疫球蛋白重链恒定区的外显子以及称作“TM外显子”的编码跨膜结构域的两个外显子。
为了构建该载体，将来自基因组μ重链牛序列的XbaI-XhoI片段，称作“1”的区域，亚克隆到商业DNA载体pBluescript(Stratagene，LaJolla，California)中，事先已经用酶XbaI和XhoI对pBluescript作了剪切。一旦克隆得到该片段，在邻近XbaI位点上存在NotI限制性酶识别序列，用于插入约3.5Kb的NotI片段。该片段含有新霉素抗性标记，将在下文进一步描述。如果需要，可以采用来自另一种有蹄类动物品种、种类或种属的基因组μ重链序列(例如来自SwissBull/Holstein杂交种的以Genbank登录号U63637保藏的μ重链序列)。
一旦片段“1”与新霉素抗性标记一起被连接到pBluescript中，仍然存在邻近新霉素抗性标记的SacI位点。用SacI线性化新构建体，用DNA聚合酶补平由SacI消化产生的粘性末端，成为平端。
称作“2”的片段以XhoI-BstI1071片段被分离，用DNA聚合酶补平由XhoI-BstI1071酶消化产生的粘性末端，成为平端。
一旦完成，最终的构建体分别含有区域2、新霉素抗性标记和区域1。
对于牛成纤维细胞的转染，用限制性酶KpnI消化该构建体(两个KpnI位点示图中)，而该DNA片段被用于同源重组。
如下装配新霉素抗性构建体。称作“pSTneoB”的构建体(Katoh等，Cell Struct.Funct.12575，1987；Japanese Collection of ResearchBiologicals(JCRB)deposit number VE039)被设计来含有新霉素抗性基因，它受SV40启动子和位于编码区上游的TK增强子调控。编码区的下游为SV40终止子序列。Neo盒作为XhoI片段被从“pSTneoB”中切取出来。在用常规的分子生物学方法将片段的末端修饰为平端后，将平端的片段克隆到载体pBS246(Gibco/Life Technologies)的EcoRV位点上。该位点的两侧是loxP位点。称作“pLoxP-STNeoR”的新构建体被用于生产μ敲除DNA构建体。该构建体的期望片段的两侧是loxP位点和NotI位点，这两个位点最先存在于pBS246克隆载体中。期望的NotI片段含有loxP-neo-loxP，用于替代免疫球蛋白的μ恒定区外显子。被可操作地连接到新霉素抗性基因上的SV40启动子激活新霉素抗性基因的转录，使得其中期望的NotI片段已经替换了将要根据其产生的抗生素抗性来选择的μ恒定区的细胞。
在获得其中IgM重链等位基因已经被有效地破坏的细胞系之后，该细胞系被用作核移植的供体来生产克隆的有蹄类动物胎儿(例如克隆的牛胎儿)，甚至IgM重链等位基因之一被破坏的胎儿或动物。此后，用来源于例如成纤维细胞的的体细胞来实现第二轮的基因打靶破坏，为了生产其中第二个IgM重链等位基因被灭活的细胞，采用含有不同的可选择标记的类似载体。
优选地，与第一个打靶基因破坏并行，第二个有蹄类动物(例如牛)的体细胞系也被遗传修饰，这些细胞系同样是雄性来源或者雌性来源的。如果被操作的第一个细胞系是雄性的，优选用来修饰雌性细胞系；反之亦然，如果被操作的第一个细胞系是雌性的，则优选用来选择一个雄性细胞系。此外，优选地，被操作的细胞包含有蹄类动物(例如牛)胎儿成纤维细胞。。
在优选的实施方案中，雌性胎儿成纤维细胞被遗传修饰，以对Igλ轻链基因的一个等位基因导入一种打靶破坏。类似地，这种方法采用具有与有蹄类动物(例如牛)Igλ轻链同源的区域以及可选择标记的载体来实现，该DNA构建体被设计来当发生整合和与内源性Ig轻链发生同源重组时，使得靶向的Igλ轻链基因被破坏(灭活)。
一旦选择了具有期望的打靶破坏的雌性成纤维细胞系，该细胞系同样被用作供体细胞来进行核移植，或者来自这种细胞系的DNA被用作核移植的供体。
可替代地，使用与用于破坏第一个等位基因的构建体类似的、但是含有不同可选择标记的DNA构建体对该细胞进行第二轮同源重组，来灭活第二个Igλ轻链的等位基因。
用于实施核移植，特别是用于生产克隆牛和克隆转基因牛的方法已经被报导，并且被描述在美国专利5,945,577中。可替代地，可以采用被公开在PCT公开WO95/16670、WO96/07732、WO97/07669或WO97/07668的任何一个中的方法(统称为Roslin方法)。Roslin方法不同于马萨诸塞大学的方法，采用的是静止期的供体细胞，而不是增生的供体细胞。所有这些专利在此完全引入作为参考。这些核移植方法生产转基因的克隆胎儿，该胎儿用于生产克隆的转基因牛后代，例如包含Ig轻链基因和/或IgM基因的至少一个等位基因被打靶破坏的后代。在已经建立了这种细胞系后，它们被用于生产雄性和雌性重链和轻链半合子敲除(M和F Hemi H/L)的胎儿和后代。此外，这些技术不限于用于生产转基因牛，上述技术可以被用于其他有蹄类动物的核移植。
在核移植后，可以通过交配有蹄类动物或者通过用先前描述的同源打靶载体进行第二轮基因打靶来生产期望的动物。
如先前所指出的，本发明的另一个目的涉及产生雄性和雌性重链和轻链半合子敲除，其中这种半合子敲除是采用已经描述的细胞系来生产的。这可以通过交配按照上述方法生产的后代来实现，其中包含IgM重链基因的等位基因被破坏的后代与包含Ig轻链的等位基因被破坏的另一种后代交配。可替代地，这可以通过操作得自按照上述方法生产的后代的细胞通过第二轮基因打靶来实现。这包括通过同源重组打靶破坏IgM重链基因的等位基因或者Ig轻链的等位基因来实现。在包含雄性和雌性重链和轻链半合子敲除(M和F Hemi H/L)的细胞系被生产之后，该细胞系被用于生产包含这种敲除的胎儿或小牛。如所指出，这可以通过交配或第二轮基因打靶来实现。
一旦获得雄性和雌性重链和轻链半合子敲除体之后，来自这些动物的细胞被用于生产纯合敲除(Homo H/L)的胎儿。此外，这通过连续基因打靶或者交配来实现。实质上，如果通过交配来实现，这将包括交配雄性重链和轻链半合子敲除体与雌性重链和轻链半合子敲除体，以及选择包含纯合敲除体的后代。可替代地，可以在组织培养中操作来自上述半合敲除体的细胞，以敲除IgM或Ig轻链(λ)基因的另一个等位基因。优选对第二轮基因打靶进行交配，因为这会产生更加快速的结果，特别是因为有蹄类动物例如牛的妊娠期相对长。
在这种连续敲除和/或繁育策略中，在该过程中生成的任何供体细胞(例如，在内源性Ig核酸中含有或不含突变以及含有或不含异种Ig核酸的供体细胞)中，朊病毒基因的一个或两个等位基因被突变。因此，用在此描述的方法生产的有蹄类动物，在朊病毒基因、Ig重链基因、Ig轻链基因、α-(1，3)-半乳糖基转移酶和/或J链上具有任意数量期望的突变，并且具有一种或多种异种Ig和/或J链基因。
生产表达人Ig的转基因有蹄类动物的敲除方法用于生产Homo H/L胎儿或小牛的方法总结在附
图1中。其中概述了三种方案。第一种方法依赖于在再生的胎儿细胞系中进行连续敲除。这种方法在技术上是最困难的，并且风险最高，但是正如上述，这种方法可能比繁育方法更快地获得结果。其他两种方案依赖于繁育动物。在第二种方案中，只需要分别在雄性和雌性细胞系中进行一次重链和轻链基因的敲除。该方案不依赖于细胞系再生，是技术上最简单的方法，但是完成需要最长的时间。方案3介于方案1和2之间。在所有方案中，由于潜在的纯合H/L敲除小牛的存活和维持的困难，仅生产了纯合的H/L胎儿。如果需要，可以采用被动免疫治疗来增强纯合H/L敲除小牛的存活。
试验设计本发明优选地涉及生产半合子雄性重链敲除体(M Hemi H)和半合子雌性轻链敲除体(F Hemi L)，以及从这些打靶删除体中生产40天的胎儿。收获来自胚胎的细胞，M Hemi H细胞中的轻链基因座的一个等位基因被打靶，而F Hemi L细胞中的重链基因座的一个等位基因被打靶，生成H和L基因座被半合子删除的细胞(Hemi H/L)。这些细胞被用于生产40天的胎儿，从该胎儿中分离成纤维细胞。
用其他H链等位基因来打靶M Hemi H/L成纤维细胞，以产生MHomo H/Hemi L，以及用其他L链等位基因来打靶F Hemi H/L，以产生F Homo L/Hemi H。为了产生纯合删除，用较高的药物浓度来驱动纯合子打靶。但是，可能是由于这种方法难以成功，而且需要进行繁育。依赖于对选择盒的cre/lox打靶的示例性策略允许对一种以上的打靶删除采用相同的选择体系。对这些成纤维细胞进行克隆，收集40天的胎儿，并分离成纤维细胞。将来自该克隆的胎儿细胞打靶，以产生纯合的H或L基因座删除，生成M Homo H/L和F Homo H/L胎儿成纤维细胞。对这些成纤维细胞进行克隆，生产40天的胎儿，并分离成纤维细胞。然后将Homo H/L胎儿成纤维细胞用于结合HAC，任选地采用繁育方法。
文库构建用胎儿成纤维细胞来构建基因组文库。虽然已经报导了打靶构建体与用于克隆的细胞同基因是重要的，但是其对于本发明来说不是必需的。例如，同基因的、实质上同基因的或非同基因的构建体被用于在内源性免疫球蛋白基因中产生突变。在一种可能的方法中，使用Holstein牛，与其他牛品种相比，在遗传上，其具有高的近交水平。在不同动物的免疫球蛋白基因中，我们没有检测到任何多形性。这表明，序列同源性应当很高，而且用非同基因的构建体进行打靶应当是成功的。
由一个雄性细胞系和一个雌性细胞系构建文库，同时进行“可克隆性”检测。可以预期，在该方法结束后，将制备一个文库，并且检测了大量的不同胎儿细胞系，其中选择一个细胞系作为最佳的用于克隆用途。
用分离自胎儿成纤维细胞的大分子量DNA来构建基因组文库。从大小上分级DNA，将20-23Kb之间的大分子量DNA插入到λ噬菌体载体λZap或λFix中。本发明人用Stratagene制备的文库取得了很大的成功。因此，分离DNA并将按大小选择的DNA送往Stratagene，进行文库制备。为了分离含有牛重链和轻链的克隆，使用放射标记的IgMcDNA和放射标记的轻链cDNA。此外，在需要删除基因座的情况下，分离轻链基因组克隆。筛选各个胎儿细胞文库中含有牛重链和轻链的克隆。可以预期，筛选约105-106个噬菌斑，将会分离到含有重链或轻链基因座的克隆。一旦被分离，将两个基因座克隆到pBluescript中，并进行限制性作图。这些基因座在Holstein牛中的限制性图谱示于附图2B中(Knight等J Immunol 1403654-3659，1988)。此外，制备来自所获得的克隆的的图谱，用于装配打靶构建体。
打靶构建体的生产一旦分离了重链和轻链，就进行构建体的制备。通过删除IgM恒定区的膜结构域来制备IgM构建体。如Rajewsky及其同事所示，在小鼠中，删除IgM的膜结构域会导致B细胞发育的阻断，这是由于表面IgM是延续B细胞发育所需的信号(Kitamura等，Nature 350423-426)。因此，纯合的IgM牛缺乏B细胞。由于在本方案中不需要缺乏功能性Ig的动物的新生儿，因此，缺乏B细胞不会带来问题。但是，如果需要，可以采用被动免疫治疗来增强动物的存活直到导入人Ig基因座的最后一步。
用于实现敲除IgM重链等位基因的示例性打靶构建体示于附图2A中。对于重链，将膜IgM结构域用两侧是lox P位点的新霉素盒替换。被连接的膜结构域与neo盒一起被剪接，使得该膜结构域具有恰好在lox P位点的5′端具有插入的TAG终止密码子，以使该膜结构域被灭活。这放置在含有约5-6kb的3′染色体DNA的打靶构建体的5′端。
如果提高药物浓度未能删除IgM重链或轻链的第二个等位基因，则采用cre/lox系统(在Sauer，1998，Methods 14381-392在被评述)来删除可选择标记。如下文所述，cre/lox系统可以靶向删除可选择标记。如果需要删除标记，则将所有可选择标记与loxP序列侧面连接，以方便删除这些标记。
轻链构建体含有牛λ链恒定区(例如存在于GenBank登录号AF396698中的λ轻链恒定区或者任何其他有蹄类动物中的λ轻链恒定区)以及两侧是lox P位点的嘌呤霉素抗性基因盒，并将用两侧是lox P位点的嘌呤霉素盒替换牛基因。λ轻链恒定区基因3′端的约5-6kb的DNA将会在3′端被替换成嘌呤霉素抗性基因。如果需要，在嘌呤霉素抗性基因的5′端和3′端都携带lox P位点，以进行删除。由于有蹄类动物抗体基因之间的高度同源性，在GenBank登录号AF396698中的牛λ轻链序列可望与来自各种有蹄类动物的基因组λ轻链序列杂交，因而可以被用于常规方法中来分离各种有蹄类动物的λ轻链基因组序列。这些基因组序列可以被用于常规方法中，例如在此描述的那些，以生产敲除构建体来灭活任何有蹄类动物中的内源性λ轻链。
类似地，可以采用附图3G中的牛κ轻链序列或者任何其他有蹄类动物κ轻链序列来构建κ轻链敲除构建体。这些牛κ轻链序列可以被用作杂交探针来分离来自各种有蹄类动物的基因组κ轻链序列。这些基因组序列可以被用于常规方法中，例如在此描述的那些，以生产敲除构建体来灭活任何有蹄类动物中的内源性κ轻链。
其他有蹄类动物基因被可选择地突变或灭活。例如，内源性有蹄类动物的IgJ链被敲除，以预防被施用于人的本发明的抗体中的有蹄类动物IgJ链的潜在抗原性。对于打靶载体的构建，可以使用存在于Genbank登录号U02301中的牛IgJ链区域的cDNA序列。该cDNA序列被用作探针来从BAC文库例如RPC1-42(BACPAC in Oakland，CA)中分离牛IgJ链的基因组序列或者从任何其他有蹄类动物中分离J链的基因组序列。此外，人J链编码序列被导入到本发明的有蹄类动物中，以功能性地表达人IgA和IgM分子。这些人J链的cDNA可从GenBank登录号AH002836、M12759和M12378中获得。采用常规方法，例如在此描述的那些，将这些序列插入到有蹄类动物胎儿的成纤维细胞中。例如，将HAC、YAC载体、BAC载体、粘粒载体或者敲除构建体中的人J链核酸整合到内源性哺乳动物染色体中或者独立地维持在内源性有蹄类动物染色体中。生成的转基因有蹄类动物细胞被用于在此描述的核移植方法中，以生产期望的有蹄类动物，其具有降低或消除功能性有蹄类动物J链表达的突变并且含有表达人J链的异种核酸。
此外，将有蹄类动物α-(1，3)-半乳糖基转移酶基因突变，以降低或消除半乳糖基(α1，3)半乳糖表位的表达，该表位由α-(1，3)-半乳糖基转移酶生产。如果由本发明的有蹄类动物生产的人抗体被该糖表位修饰，当作为治疗剂被施用给人时，这些糖基化的抗体被受体中的与糖表位反应的抗体灭活或者消除。为了消除这些可能的对糖表位的免疫反应，牛α-(1，3)-半乳糖基转移酶基因的序列被用于设计敲除构建体来灭活有蹄类动物中的这种基因(Genbank登录号J04989；Joziasse等，J.Biol.Chem.26414290-14297，1989)。公开在美国专利6,153,428和5,821,117中的这些牛序列或猪的α-(1，3)-半乳糖基转移酶序列可以被用于从各种有蹄类动物中获取基因组α-(1，3)-半乳糖基转移酶序列，以生产半乳糖基(α1，3)半乳糖表位的表达被降低或被消除的其他有蹄类动物。
如果需要，有蹄类动物朊病毒基因被突变或灭活来降低潜在的感染危险，例如牛海绵状脑病(BSE)。对于打靶载体的构建，可以使用牛朊病毒基因的基因组DNA序列(GenBank登录号AJ298878)，如实施例1所描述。可替代地，这种基因组朊病毒序列可以被用于从其他有蹄类动物中分离基因组朊病毒序列。朊病毒基因可以用在此描述的方法来灭活。可替代地，先前描述的用于在绵羊中突变α-(1，3)-半乳糖基转移酶基因或者朊病毒的方法(Denning等，Nature Biotech.，19559-562，2001)可以根据在此描述的方法来改进。例如，可以采用在此描述的用于培养供体细胞(例如胎儿成纤维细胞)、生产敲除载体、用敲除载体转染供体细胞(例如在存在亚精胺时的转染)和/或将来自敲除细胞的遗传物质转移到用于生产转基因有蹄类动物的卵母细胞中的改进方法。
如果第一个可选择标记仍然存在于细胞中，对于打靶各个基因座的第二个等位基因，有必要装配一个含有不同可选择标记的新打靶构建体。如表5中所描述，各种选择策略是可利用的、并且可以对它们进行比较，并选择合适的筛选体系。首先，通过提高药物浓度(例如，将药物浓度加倍)来打靶第二个等位基因。如果不成功，可以使用一个新的打靶构建体。
表5可选择标记和用于筛选的药物基因药物NeorG418Hph 潮霉素BPuro嘌呤霉素Ecogpt 霉酚酸Bsr 杀稻瘟菌素SHisD组胺醇DT-A白喉毒素采用各种方法，可以将上述的其他突变或基因灭活掺入到本发明的有蹄类动物中。一旦生产了具有各种期望突变的转基因有蹄类动物细胞系，采用杂交来将这些额外突变掺入到本发明的有蹄类动物中。可替代地，具有这些额外突变的胎儿成纤维细胞可以被用作敲除内源性Ig基因和/或导入异种Ig基因的起始材料。此外，在内源性Ig基因中具有敲除突变和/或含有异种Ig基因的胎儿成纤维细胞被用作这些额外突变或灭活的起始材料。
Ig基因座的靶向删除将打靶构建体导入到胎儿成纤维细胞中，例如，通过电穿孔。通过使用合适的抗生素，来选择掺入了打靶载体的细胞。选择培养对药物筛选具有抗性的克隆。然后，用鸟嘌呤对这些克隆进行阴性选择，鸟嘌呤将会选择已经被适当整合的那些克隆。可替代地，通过PCR选择在药物筛选中存活的克隆。估计可能需要筛选至少500-1000个克隆来寻找被适当打靶的克隆。本发明人的估计是基于Kitamura(Kitamura等，Nature 350423-426，1991)，Kitamura等发现当打靶IgM重链恒定区的膜结构域时，300个neo抗性克隆中约1个被正确打靶。因此，建议将在96孔平板中，以10个克隆一组将克隆汇集，并对10个克隆的集合进行筛选来选择被打靶的克隆。一旦鉴定为阳性，对从汇集的克隆中分离的单一克隆进行筛选。该方法将能够鉴定被打靶的克隆。
由于成纤维细胞在培养的过程中会移动，因此，当在1个培养皿中产生超过约10的克隆时，就难以区分单个克隆。此外，应当开发高效转染的克隆繁育策略。可以使用多种合理的策略，例如稀释克隆。
Cre/Lox切除抗药性标记如上所示，示例性打靶构建体含有被loxP位点侧面包围的可选择标记，以方便用cre/lox体系有效删除标记。通过电穿孔，用含有Cre的质粒转染携带打靶载体的胎儿成纤维细胞。可以使用一种最近描述的Cre质粒，其含有GFPcre融合基因(Gagneten等，Nucleic Acids Res.253326-31，1997)。这使得可以快速地选择含有Cre蛋白的所有克隆。这些细胞可以通过FACS分选或者通过显微操作手工收集绿色荧光细胞来选择。绿色细胞被认为携带活跃转录的Cre重组酶，因此删除了抗药性标记。将被选择为Cre表达的细胞克隆，并通过PCR分析克隆来检测抗药性标记。将那些被确定已经发生剪切的细胞生长为小克隆，分离，并且在选择培养基中检测一个等分试样，以确定药物抗性基因已经被删除。其他的等分试样被用于下一轮的打靶删除。
应用打靶策略来改变其他有蹄类动物中的免疫球蛋白基因为了改变其他有蹄类动物的免疫球蛋白基因，将打靶载体设计成含有三个主要区域。第一个区域与被打靶的基因座同源。第二个区域是药物筛选标记，其特定地替换被打靶基因座的一部分。第三个区域类似于第一个区域，与被打靶的基因座同源，但是在野生型基因组中，其不与第一个区域邻近。打靶载体与期望的野生型基因座之间的同源重组使得在打靶载体上表现为同源的两个区域之间的基因座序列被删除，并且用药物抗性标记替换该序列。在优选的实施方案中，两个同源区域的总大小为约6kb，而替换被打靶的基因座的一部分的第二个区域的大小为约2kb。这种打靶策略被广泛地应用于从原核细胞到人细胞的大范围内的种类。各个载体的独特性在于被选择用于基因打靶方法的基因座以及在那些策略中所用的序列。这种方法可以被用于各种有蹄类动物，包括，但是不限于，山羊(Capra hircus)、绵羊(Ovisaries)和猪(Sus scrufa)以及牛(Bos taurus)用于在有蹄类动物的细胞中打靶特定基因的电穿孔也可以被广泛地应用于有蹄类动物。在此描述的常规方法是可改变的，以适于将打靶突变导入到其他有蹄类动物的基因组中。可以对电穿孔条件(电压和容量)进行修改，以优化从其他有蹄类动物中获得的转化子的数量。
此外，在此用于打靶牛重链基因座的策略(即，用含有直接与被去除的外显子侧面连接的区域同源的区域的载体去除所有编码外显子和间插序列)也可以同样地应用于其他有蹄类动物。例如，在绵羊(Ovisaries)的免疫球蛋白重链基因座上进行延伸序列的分析，在结构和序列上，免疫基因座与牛基因座高度相似(GenBank登录号Z71572、Z49180-Z49188、M60441、M60440、AF172659-AF172703)。除了大量被报导用于重排公绵免疫球蛋白链的cDNA序列，已经报导了重链基因座的基因组序列信息，它包括重链5′增强子(GenBank登录号Z98207)、3′μ转换区(Z98680)和5′μ转换区(Z98681)。绵羊重链的分泌形式的互补mRNA序列已经以登录号X59994录入。这一录入的序列含有四个编码外显子的全序列，它们与相应的牛序列高度同源。
关于所述绵羊基因座的信息从GenBank获得，用来确定与牛序列高度同源的区域，以供设计用于PCR分析的引物。因为使用非等基因DNA对牛细胞进行打靶，发现与绵羊序列高度同源的区域用作牛品种之间序列可能相似保守的指标。已知牛和绵羊的免疫球蛋白基因座的序列和结构之间具有相似性，可以预期，用以去除牛免疫球蛋白基因座的打靶策略可以成功地应用于所述绵羊系统。此外，关于猪(Susscrofa，登录号S42881)和山羊(Capra hircus，登录号AF140603)的现有信息表明，这两个物种的免疫球蛋白基因座也与所述牛基因座足够相似，因此可以利用本发明的打靶策略。
实施例5牛IgM敲除以下的方法用来生产其中免疫球蛋白重链(μ)基因座的一个等位基因已经通过同源重组而被破坏的牛成纤维细胞系。通过去除μ基因座(对应于IgM重链基因)的外显子1-4，并用一个拷贝的新霉素抗性基因取代，产生用于实施IgM敲除的DNA构建体。使用这种构建体，获得了成功地用于核移植的新霉素抗性细胞系，并且将来自该细胞系的囊胚植入到受体母牛中。此外，用PCR方法对这些囊胚中的一些进行检测，以确定在μ基因座中恰当地发生了靶向插入。通过核移植方法从所获得的几个细胞系产生囊胚，表明妊娠的是半合子IgM-敲除胎儿。此外，已经产生了包含单一的IgM重链(μ)敲除的雄性和雌性细胞系。可以预期，将从造血细胞系中克隆的动物进行交配，将会产生其中两个μ拷贝都被灭活的后代。如在此所述，这些后代可以与朊病毒敲除的有蹄类动物交配，生产在IgM和朊病毒基因中具有突变的后代。可替代地，如实施例1所述，来自后代的细胞可以被遗传修饰来灭活朊病毒基因的一个或两个等位基因。这些方法将在下文被更加详细地描述。
DNA构建体在本文件中所述的用于所有转化的DNA按照如下生产。四个主要的外显子(除了跨膜结构域外显子之外)，CH1-4被下游(CH4)末端的XhoI限制性位点和上游末端(CH1)的XabI位点侧面连接。用于转染方法的构建体由XhoI位点下游的1.5kb基因组序列和XabI位点上游的3.1Kb基因组序列组成(附图3D和3E)。这些序列如本文所述从来自马萨诸塞的泌乳牛群的Holstein牛中分离。将新霉素抗性标记插入到位于这两个片段的3.5Kb的片段上，替换原先含有CH1-4、得自原始基因组序列的2.4Kb DNA。所述载体的骨架为pBluescriptII SK+(Stratagene)，纯化8.1Kb的插入片段，用其转染牛胎儿成纤维细胞，该构建体示于附图3A-3C。含有其他同源区和/或含有另一种抗生素抗性基因的其他μ敲除构建体，用于突变内源性μ重链基因。
转染/敲除方法胎牛的转染用市售试剂Superfect Transfection Reagent(Qiagen，Valencia，CA，USA)来进行。
从Hematech′s堪萨斯工具的经病害检测的雄性Charlais牛中生产牛成纤维细胞，并送到Hematech′s Worcester Molecular BiologyLabs，用于所述的所有试验。任何其他有蹄类动物品种、种属或种类都可以被用作这些供体细胞(例如体细胞，乳胎儿成纤维细胞)的来源。对于所述供体细胞进行遗传修饰，以含有降低或消除功能性内源Ig表达的突变。
用于培养牛胎儿成纤维细胞的培养基由以下成分组成500mlαMEM(Bio-Whittaker#12-169F)；50ml胎牛血清(Hy-Clone#A-1111-D)；2ml抗生素/抗真菌剂(Gibco/BRL#15245-012)；1.4ml 2-巯基乙醇(Gibco/BRL#21985-023)；5.0ml L-谷氨酰胺(SigmaChemical#G-3126)和0.5ml酒石酸酪氨酸(Sigma Chemical#T-6134)。
在转染的前一天，将细胞接种到60mm的组织培养皿中，通过显微镜检测，确定达到40-80％的目标汇合度。
在转染的当天，将总体积为150μl的在无血清无抗生素培养基中的5μg DNA与20μl Superfect转染试剂混合，在室温下静置5-10分钟，以形成DNA-Superfect复合物。当形成所述复合物时，从含有待转染的牛成纤维细胞的60mm培养皿中去除培养基，用4ml磷酸缓冲生理盐水冲洗细胞1次。将1ml生长培养基添加到170μl的DNA/Superfect混合物中，立即将其转移到60mm培养皿中的细胞上。将细胞在38.5℃、50％二氧化碳下温育2.5小时。在细胞与DNA/Superfect复合物一起温育之后，吸出培养基，用4ml PBS洗涤细胞4次。加入5ml完全培养基，将培养物在38.5℃、5％CO2下温育过夜。然后用PBS洗涤1次，然后与1ml含0.3％胰蛋白酶的PBS一起在37℃下温育，直到通过显微镜观察确定细胞与平板分离。将得自各个60mm培养皿的细胞分装到24孔组织培养平板的24个孔中(41.7μl/孔)。往各个孔中加入1ml组织培养基，在38.5℃和5％CO2下温育平板24小时。
在所有转染操作期间，用不含DNA的Superfect/PBS混合物进行假转染，因为可预期那些细胞中都不含新霉素抗性基因，并且可预期所有细胞在将G418加入到组织培养基中后都死亡。这作为接受DNA的细胞阳性选择的的阴性对照。
在温育24小时后，再将1ml含有400μg的G418的组织培养基添加到各个孔中，使G418的最终浓度为200μg/ml。将细胞放回到培养箱中，进行7天的G418选择。在此期间，监控转染平板和假转染平板的细胞死亡情况，并且在7天内，来自假转染的大多数孔含有很少或者不含活细胞，而含有接受了所述DNA的细胞的平板则显示出良好的细胞生长。
在7天的选择期之后，将来自90-100％汇合的孔的细胞用0.2ml含0.3％胰蛋白酶的PBS解离，并将其转移到35mm的组织培养平板上，以进行扩大培养和温育，直到它们至少50％汇合，此时，用0.6ml含有0.3％胰蛋白酶的PBS对细胞进行胰蛋白酶处理。从每个35mm组织培养平板上，将0.6ml的细胞悬浮液中的0.3ml转移到12.5m2组织培养烧瓶中，进行进一步扩大培养。将剩余的0.3ml再接种到35mm的培养皿中，并温育，直到它们最低达到约50％汇合，此时对来自那些平板的细胞进行加工，提取DNA用于PCR分析。将来自各个细胞系的烧瓶保留在培养箱中，直到它们经过这些分析，如果它们不含期望的DNA整合，则可以终止培养，或者保留用于以后的核移植并冷冻保存。
靶向整合的筛选如上所述，用于筛选含有DNA构建体的转染子的DNA来源是一个含有一次传代的待分析的细胞的35mm组织培养皿。如下制备DNA，该DNA适于Laird等，Nucleic Acids Res.，194293)公开的方法。简而言之，如下制备DNA。用以下成分制备细胞裂解缓冲液100mM Tris-HCl缓冲液pH8.5；5mM EDTA，pH8.0；0.2％sodium十二烷基硫酸钠；200mM NaCl和100μg/ml蛋白酶K。
从各个35mm组织培养皿中吸出培养基，用0.6ml的上述缓冲液替换。将培养皿放回到培养箱中保持3小时，在此期间，发生细胞溶解和蛋白质消化。在该温育之后，将溶解产物转移到1.5ml的微量离心管中，并加入0.6ml异丙醇异沉淀DNA。通过颠倒离心管，将离心管充分振荡，然后让其在室温下静置3小时，此后以13,000rpm离心10分钟，使DNA沉淀在微量离心管中沉积。弃去各个离心管的上清液，用70％乙醇洗涤沉淀1次。吸去70％的乙醇，风干DNA沉淀。一旦干燥，将各个沉淀重悬在30-50μl Tris(10mM)-EDTA(1mM)缓冲液，pH7.4中，让其水合并溶解过夜。对于每个聚合酶链式反应(PCR)程序，使用5-7μl的各种DNA溶液。
用两个独立的PCR程序来分析转染子。第一个程序使用两种引物，所述两种引物预期退火到都位于用于转染的DNA内的位点上。第一种引物序列与所述DNA构建体的新霉素抗性盒同源，而第二种引物序列距离其约0.5Kb，产生0.5Kb的PCR产物。特别地，使用引物Neol(5′-CTT GAA GAC GAA AGG GCC TCG TGA TACGCC-3′；SEQID NO42)和IN2521(5′-CTG AGA CTT CCT TTC ACC CTC CAGGCACCG-3′；SEQ ID NO43)。Qiagen PCR试剂盒被用于该PCR反应。PCR反应混合物含有1pmol各种引物、5μl 10×反应缓冲液、10μl Q溶液、5μl DNA和1μl dNTP溶液。用水使反应混合物的总体积为50μl。采用最初于94℃变性保温2分钟来进行该PCR扩增。然后通过在94℃下保温45秒钟、在60℃下保温45秒钟和在72℃下保温2分钟，进行30个循环的变性、退火和扩增。然后，让混合物在72℃下保温5分钟，在4℃下保温直到从PCR仪中取出混合物。可替代地，可以在适当的反应条件下进行一个标准的PCR反应，使用与整合到细胞基因组中的所述敲除构建体的区域同源的任何其他引物，以证实在G418选择中存活的细胞由于整合了DNA构建体而具有抗性。
由于预期仅仅有较少比例的转染子在期望位置上(μ基因座)含有DNA整合，因此，使用另一对引物来确定，不仅所导入的DNA存在于所述转染子的基因组中，而且被整合到期望的位置上。使用位于所述DNA构建体中的新霉素抗性盒内的一种引物和预期仅当所述DNA整合到IgM基因座的适当位置上时才退火到1.8Kb之外(因为同源区位于转染用的DNA构建体中所包含的区域之外)的一种引物，来进行用于检测恰当整合的PCR方法。设计所述引物，退火到紧邻所述DNA构建体中表示的那些序列的DNA序列，如果它要被整合到期望位点(位于存在DNA构建体的区域中以及在基因组中与之邻近的基因座的DNA序列先前已被测定)上的话。特别地，在该分析中使用引物Neol和OUT3570(5′-CGA TGA ATG CCC CAT TTC ACC CAA GTC TGTC-3；，SEQ ID NO44)。如上所述，该PCR反应使用Qiagen PCR试剂盒来进行第一个PCR反应，以证实所述打靶构建体被整合到细胞中。可替代地，可以采用任何合适的反应条件以及任何与所述整合到细胞基因组中的敲除构建体的区域同源的其他引物、以及与所述细胞基因组中整合位点上游或下游区域同源的其他引物，来进行该PCR分析。
采用这些方法，针对DNA构建体靶向整合到合适的基因座中，对135个独立的35mm平板进行了筛选。来自8个平板的DNA被确定含有被恰当打靶的DNA构建体，从中选择3个用于核移植方法。这些细胞系被命名为“8-1C”、“5-3C”和“10-1C”。将未用于移植到受体母牛中的剩余囊胚用于提取DNA，对该DNA进行额外的PCR分析。使用嵌套的PCR方法使用也用于转染细胞系的首次筛选的引物的该分析是有效的。
如上所述，用设计来去除μ基因座的外显子1-4的基因打靶构建体来生产三种细胞系。将使用基于PCR的试验的经检测均为靶向插入阳性的这些细胞系用于核移植。通过PCR检测恰当靶向的构建体来筛选剩余的从那些核移植中产生的囊胚。获得如下频度的阳性囊胚细胞系8-1C6/8细胞系10-1C2/16细胞系5-3C0/16虽然在妊娠第40天时，通过超声波检测到总共11头怀孕，但是到第60天时，7个胎儿已经死亡。剩余的4个胎儿经过处理以生产新的胎儿成纤维细胞，而剩余的器官用于生产小组织样本以进行PCR分析。分析的结果如下细胞系8-1C2个胎儿，1个胎儿经过PCR检测为靶向插入阳性细胞系10-1C1个胎儿，经过PCR检测为靶向插入阳性细胞系5-3C1个胎儿，经过PCR检测为靶向插入阴性令人惊奇的是，虽然10-1C囊胚检测为靶向插入阳性的频度仅为2/16，但是从该细胞系获得的一个存活的60天的胎儿经过PCR检测为阳性。从8-1C也获得阳性胎儿。对所有组织样本的DNA进行DNA印迹分析，证实所述构建体不仅在一个末端上正确打靶(通过对原始构建体中存在的较短的同源区进行PCR来测定)，而且在另一端也正确打靶。根据迄今获得的结果，认为已经产生了来自两个独立整合事件的两个重链敲除胎儿。此外，由于这些胎儿来自两个不同的细胞系，因此，至少一个胎儿可能在两个末端上都正确整合了构建体。一旦DNA印迹分析证实，打靶载体在两个末端都恰当地打靶，则进行进一步的核移植，生产怀孕到足月的其他胎儿。
核移植与胚胎移植用K/O细胞系(8-1-C(18))进行核移植，生成8个胚胎。在Trans Ova Genetics(″TOG″；Iowa)，将来自这一批的总共6个胚胎移植到3头无病受体中。
将冷冻的胚胎移植到10头无病受体中，获得无病的雌性成纤维细胞系。在第35-40天证实妊娠后，制定胎儿回收计划。
妊娠诊断和胎儿回收通过超声波检查法检查移植了来自敲除胎儿细胞的克隆胚胎的18头受体的妊娠情况。结果总结在表6中。
表6使用μ重链敲除供体西部的40天时的妊娠
妊娠诊断检查移植了来自敲除细胞(8-1C)的克隆胚胎的3头受体的妊娠情况；1头被打开(open)，而另外2头需要在1个月后再加以证实。
胎儿回收和细胞系的建立获得第40天时怀有K/O胚胎的11头妊娠牛。在第60天时，从这些牛中取出4个活胎儿。从所有4个胎儿中建立细胞系，并将细胞系冷冻保存待用。此外，本发明人收集了来自所述胎儿的组织样本，并将其冷冻，送到Hematech分子生物学实验室进行PCR/DNA印迹分析。
所有4个细胞系都是雄性细胞系。为了获得雌性细胞系，在TransOva Genetics用无病受体建立妊娠的妊娠55天时收集的胎儿(6个)建立细胞系并冷冻保存，以供将来建立K/O细胞系。最近，证实存在一个含有μ敲除的雌性细胞系。该雌性细胞系可以被用于生产克隆动物，可以让克隆动物与从雄性细胞系生产的动物交配，并且在后代中筛选含有双μ敲除的后代。
如果需要，来自生成的敲除胎儿或敲除后代的细胞可以被用于第二轮核移植以生产额外克隆的后代。来自首次敲除胎儿或敲除后代的细胞可以被冷冻来形成细胞系，用作生产其他敲除有蹄类动物的供体细胞的来源。
实施例6α-1，3-半乳糖基转移酶活性降低的转基因有蹄类动物如果需要，生产其中α-1，3-半乳糖基转移酶被突变的转基因有蹄类动物，防止具有半乳糖(1，3)-半乳糖表位的异种抗体被糖基化。通过同源重组生产其中α-1，3-半乳糖基转移酶的一个等位基因被突变的牛成纤维细胞系。用于生产α-1，3-半乳糖基转移酶敲除细胞的DNA构建体被用于将嘌呤霉素抗性基因(puro，如在此描述)以及转录终止盒(STOP)插入到含有催化结构域的外显子9中，以阻止功能性的全长α-1，3-半乳糖基转移酶mRNA的转录。因此，生成的未成熟的α-1，3-半乳糖基转移酶转录物缺乏催化结构域。DNA构建体(即α-1，3-半乳糖基转移酶敲除载体)被电穿孔到三种独立的牛成纤维细胞系中，然后分离嘌呤霉素抗性克隆。根据PCR分析，在一些克隆中，在外显子9区域中发生同源重组。因此，生成其中α-1，3-半乳糖基转移酶的一个等位基因被突变的牛成纤维细胞系。如果需要，可以用相同的敲除载体来突变第二个等位基因，用较高的抗生素浓度或者使用具有不同抗生素抗性基因的另一种敲除载体来选择纯合敲除细胞。这种方法还可以被应用于来自其他有蹄类动物的细胞，以生产用于在此描述的核移植方法的转基因细胞，来生产本发明的转基因有蹄类动物。
这些方法在下文中被进一步描述。
α-1，3-半乳糖基转移酶敲除载体的构建如下生产α-1，3-半乳糖基转移酶敲除载体(附图23)。为了分离α-1，3-半乳糖基转移酶基因的外显子9周围的基因组DNA，用如下引物对来PCR扩增DNA探针5′-gat gat gtc tcc agg atg cc-3′(SEQ ID NO61)和5′-gac aag ctt aat atc cgc agg-3′(SEQ ID NO62)。使用这种探针，对牛基因组λ噬菌体文库进行筛选，并鉴定7个阳性λ噬菌体克隆。通过限制性作图，进一步对一个含有来自雄性Charolais牛成纤维细胞的DNA的克隆进行分析。将含有外显子9的NotI-XhoI基因组片段亚克隆到pBluescript II SK(-)中，然后在NotI-XhoI基因组片段的AviI位点上插入puro和STOP表达盒，该位点在催化结构域的5′端。白喉毒素基因(DT-A，Gibco)也被添加到该载体构建体中，以杀死其中打靶表达盒被非同源性地整合的细胞。
转染/敲除方法如下，用常规的电穿孔方案，对三个胎儿的成纤维细胞系(两种来自雄性Jersey牛，而一种来自雌性Jersey牛)进行转染。用于培养牛胎儿成纤维细胞的培养基含有500mlαMEM(Gibco，12561-049)、50ml胎牛血清(Hy-Clone#；ABL13080)、5ml青霉素-链霉素(SIGMA)和1ml 2-巯基乙醇(Gibco/BRL#；21985-023)。在转染的前一天，将细胞植入到T175组织培养烧瓶中，具有通过显微镜检查确定的80-100％的目标汇合度。在转染的当天，将约107个牛成纤维细胞胰蛋白化，并用α-MEM培养基洗涤1次。在将细胞重悬在800μlαMEM后，将30μg的DNA添加到细胞悬浮液中，通过吹吸充分混合。将细胞-DNA悬浮液转移到电穿孔样本池中，并在1,000V和50μF下进行电穿孔。此后，将被电穿孔的细胞铺到20个具有添加了血清的α-MEM培养基的24-孔平板上。培养48小时后，将培养基替换为含有1μg/ml嘌呤霉素的培养基，培养细胞2-3周来选择嘌呤霉素抗性细胞。选择后，挑选接近100％汇合的所有集落，从集落中提取基因组DNA来通过PCR筛选期望的同源重组事件。
对靶向整合的筛选如上所述，使用PUREGENE DNA分离试剂盒(Gentra Systems)，按照生产商的方案，从24孔的各个孔中独立地提取基因组DNA。将每种基因组DNA样本重悬在20μl的10mM Tris-Cl(pH8.0)和1mMEDTA(EDTA)中。用如下引物对通过PCR进行筛选5′-aag aag agaaag gta gaa gac ccc aag gac-3′(SEQ ID NO63)和5′-cct ggg tat aga caggtg ggt att gtg c-3′(SEQ ID NO64)。一条引物的序列位于α-1，3-半乳糖基转移酶敲除载体中，而另一条引物的序列恰好位于被打靶的内源性基因座的整合载体之外(附图23)。因此，期望的PCR产物应该仅在所述敲除载体通过同源重组整合到靶向基因座中时才可以检测到。
PCR反应混合物含有18.9μl水、3μl10×LA PCR缓冲液II(含Mg2+)、4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μl基因组DNA和0.3μl LA Taq。通过在以下条件下对反应混合物进行保温85℃3分钟、94℃1分钟、98℃10秒钟和68℃15分钟，进行40个循环的PCR。在PCR后，通过电泳分析反应混合物，选择出产生预期大小的PCR产物的嘌呤霉素抗性克隆(附图23)。因此，成功地生产了其中α-1，3-半乳糖基转移酶基因座中的一个等位基因被敲除载体突变的牛成纤维细胞系。
实施例7使用腺伴随病毒突变内源性基因来生产转基因有蹄类动物的替代方法可以用腺伴随病毒(AAV)特异地替换细胞基因组中存在的靶向序列(Inoue等，Mol.Ther.3526-530，2001)；Hirata等，J.Virol.7416536-16542，2000)；Inoue等，J.Virol.737376-7380，1999)；和Russell等，Nat.Genet.18325-330，1998))。与更常规的基因打靶方法相比，其基因打靶率十分有效。AAV具有宽广的宿主范围以及具有组织特异性，包括对牛和人皮肤成纤维细胞的特异性。因此，可以用AAV来生产在内源性免疫球蛋白(例如μ重链、λ轻链、κ轻链和J链)、α-1，3-半乳糖基转移酶或朊病毒基因中具有一个或多个突变的转基因有蹄类动物细胞。然后，这些转基因细胞可以被用于在此所述的核移植方法中，以生产本发明的转基因有蹄类动物。
应用AAV，导致牛免疫球蛋白重链基因座以高于先前用常规基因打靶策略(即电穿孔和脂转染方法)所达到的频率进行重组。在第一轮基因打靶试验中，在含有通过AAV载体所导入的DNA的73个稳定转染子中，获得5个正确打靶的成纤维细胞克隆这些试验按照如下进行。
AAV敲除载体AAV构建体可以通过简单地插入外源序列或者用存在于AAV载体中的新序列替换内源性序列来破坏基因。附图24显示移植AAV构建体，其中牛免疫球蛋白重链μ恒定区的所有4个编码外显子存在于2822bp的BamHI-XhoI片段上。将存在于市售载体pMClNeo中的含有新霉素抗性标记的1.16Kb片段插入到存在于来自Holstein牛的μ重链基因座的外显子4中的SacII位点上。该基因座是在被分离来产生实施例3所述敲除载体的噬菌体克隆中所含有的基因座。为了生产AAV载体，将μ重链基因座中的SacII位点补平，构建平端，随后将其与平端SalI接头(New England Biolabs)连接。然后，将含有新霉素抗性基因的pMClNeo的XhoI片段连接到通过SalI接头添加到基因座中的SalI位点上。由于XhoI和SalI限制性位点具有相匹配的末端，可以进行这种连接。这种敲除载体引起新霉素抗性基因被破坏性地插入到内源性μ重链基因中，从而使所述μ重链基因被灭活。该基因被灭活的发生无需使所述内源性μ重链基因座的区域缺失。
设计一种替代载体来在打靶期间从内源性基因座中去除外显子3和4，导致这两个外显子被一个功能性拷贝的新霉素抗性基因替换(附图25)。采用从雌性Jersey牛中PCR扩增基因组DNA来生产这种构建体。特别地，用如下引物来扩增3′同源区5′-GGG GTC TAG Agc agacac tac act gat ggg ccc ttg gtc c-3′(SEQ ID NO65)，该引物添加了一个XbaI限制性位点，和5′-GGG GAA GCT Tcg tgtccc tgg tcc tgt ctgaca cag-3′(SEQ ID NO66)，该引物添加了一个Hind III限制性位点。用如下引物扩增5′同源区，5′-GGG GCT CGA Ggt cgg cga agg atg ggggga ggt g-3′(SEQ ID NO67)，其增加了一个XhoI限制性位点，和5′-GGG GGG TAC Cgc tgg gct gag ctg ggc aga gtg gg-3′(SEQ ID NO68)，其添加了一个KpnI限制性位点。这些引物序列中的大写核苷酸不会退火到μ重链基因座上，但是被包括在引物中来加入限制性位点以方便后续的亚克隆步骤。加入前4个鸟嘌呤，以便将限制性位点与所述引物的真正末端分开，因为限制性酶不切割位于引物真正末端的位点以及内部位点。5′同源区长1.5Kb，含有外显子1和2。5′同源区还含有外显子3的前25个核苷酸，以保持外显子的剪接受体位点。剪接受体位点使得外显子3可以用于剪接，从而防止外显子1和2可能被剪接到下游的跨膜结构域中，形成异常的膜结合产物。3′同源区长度为1.24Kb，含有紧邻外显子4下游的区域。
对于附图24所示的构建体，采用标准方法，将所述打靶表达盒插入到Ryan等(J.Virol.701542-1553，1996)报导的含有病毒的长末端重复(LTR)序列的AAV载体中。如先前所描述(Inoue和Russell，J.Virol.727024-7031，1998)，用TtetA2包装细胞系，将所述AAV载体包装到衣壳中，并且按照先前所述进行纯化(Zolotukhin等，GeneTherapy，6973-985，1999)。对于附图25中所示的构建体，可以使用上述方法或者任何其他标准方法，将所述打靶盒插入到Ryan等所述的AAV载体或者任何其他AAV载体(例如得自Stratagene的市售载体)中，生产含有所述载体的病毒。
转导方法将来自Jersey牛的成纤维细胞以40,000细胞/孔接种到48孔的培养平板的一个孔中，在完全培养基中，在38.5℃和5％CO2下培养，直到细胞附着到孔的底部表面上。一旦细胞贴壁，去除培养基，替换成0.2ml含有具有附图24所示载体的AAV颗粒的鲜新培养基，感染复数(MOI)为500-20,000颗粒/细胞。MOI的选择是基于测定在药物筛选期间所产生的集落数和集落间隔的预试验。温育平板过夜。温育后，将被转导的孔用无钙和镁的PBS漂洗，如上所述胰酶或者细胞解离缓冲液使细胞与孔分离。通过轻轻吹吸解离的细胞，获得均一的细胞悬浮液，使得所述孔的细胞重新分配在10个100mm组织培养皿中，将各个培养皿用完全培养基温育过夜。
在该100mm培养皿中温育后，将培养基更换为含有浓度为350μg/ml的G418的选择培养基。每2-3天更换选择培养基一次，直到在培养皿的表面上存在肉眼可见的集落。此时，挑选单个集落，转移到各自的容器中。
在组织培养皿的外表面上标记含有集落的区域。一旦圈出所有的集落，从平板中吸出培养基，用无钙和镁的PBS洗涤平板3次。洗涤后，用1∶25稀释的1×胰酶浸没平板，在室温下静置，直到可见集落开始与平板表面分离。保持平板固定，以防止分离的集落漂移到平板的另一个位置上。用吸头挑出体积为50μl的细胞块，将吸头的内容物转移到24孔组织培养平板的一个孔中。一旦所有集落都被转移，加入含有G418的完全培养基，使被分离的克隆进行扩增，到接近汇合。
当一个孔接近汇合时，将其用无钙和酶的PBS洗涤2次。用0.2ml细胞解离缓冲液使细胞分离。将20μl细胞悬浮液转移到新的24孔平板中，而剩余的细胞在加入2.0ml完全培养基后再附着到原先的24孔平板表面上。培养原先的24孔平板到100％汇合。新的平板作为用于将来的牛克隆方法中的恰当打靶细胞的来源。
当来自原先的24孔平板的一个孔达到100％汇合时，去除培养基，用PBS洗涤细胞1次。去除PBS，更换为Laird等(Nucleic Acids Res.194293，1991)采用的细胞裂解缓冲液。简而言之，将0.2ml的裂解缓冲液加入孔中，该缓冲液含有200mM NaCl、100mM Tris-HCl pH 8.5、5mM EDTA、0.2％SDS和100μlg/ml蛋白酶K。将平板再放回培养箱中，达3小时到过夜。然后，将粘性的细胞溶解液转移到微量离心管中。加入等体积的异丙醇以沉淀DNA。在微量离心机中离心10分钟后，弃去上清液，将沉淀用0.5ml 70％乙醇洗涤1次。去除乙醇后，风干DNA沉淀，重悬在35μl TE缓冲液(10mM Tris pH8和1mMEDTA)中。将3μl的等分试样用于PCR分析。
PCR分析采用PCR分析，对来自用AAV颗粒转导的抗药性克隆的DNA样本进行筛选，寻找所述载体的正确打靶。这种筛选策略使用一种退火到编码药物筛选标记的DNA内的引物，以及另一种退火到靶向基因座中但是在所述AAV打靶颗粒中存在的序列之外的引物。仅当AAV打靶DNA整合到内源性基因组的期望位置上时，才能检测到PCR产物。
从使用这些AAV颗粒的单打靶试验中获得的结果示于附图26中。基于这种分析，73个独立克隆中的5个克隆含有正确打靶的载体DNA。
该方法也可以与附图25所示的AAV载体或者任何其他合适的腺病毒或腺伴随病毒载体一起使用。如果需要，可以通过用带有一种不同抗生素抗性基因(即除了新霉素抗性基因之外的基因)的AAV载体转导，使所分离的集落中的第二个μ重链等位基因被突变。为了选择生成的纯合敲除细胞，在存在相应的抗生素时培养被感染的细胞。可替代地，可以用含有新霉素抗性基因的AAV载体转导分离的集落，然后在存在高浓度抗生素(即杀死半合子敲除细胞而不杀死纯合敲除细胞的抗生素浓度)的情况下进行培养。
实施例8传统牛核移植胚胎中的细胞核再编程缺陷的证据传统的核移植技术通常生产低比例的活的新生儿。如下文所述，该低效率可能由于，至少部分是由于，重构的卵母细胞不能再编程供体细胞或者供体细胞核，以促进卵母细胞发育所需基因的转录和抑制不利于发育的基因的转录。实施例11和12描述了改进的克隆方法，该方法可以被用于本发明的方法中生产在朊病毒基因中具有突变和任选地具有异种Ig基因的转基因有蹄类动物。
在牛胚胎植入前发育过程中，核被膜、核基质和染色质-基质界面成分(chromatin-matrix interface component)的分布为了确定核被膜(B-型和A/C-型核纤层蛋白)、核基质(NuMA)以及染色质-基质界面(AKAP95)成分在植入前的胚胎中的分布，通过体外受精(IVF)生产牛胚胎，并通过免疫荧光分析进行检查。牛的体外受精按照先前的描述进行(Collas等，Mol.Reprod.Devel.34212-223，1993)。简而言之，来自一头公牛的冷冻-解冻的牛精液分层在45-90％Percoll梯度的最上层，以700xg离心30分钟。确定沉淀中的精液浓度，稀释精液使得受精时的最终浓度为106精子/ml。在成熟后的22个小时时，在TL HEPES中洗涤卵母细胞3次，放置到480μl的受精培养基中。在50个卵母细胞中以106精子/ml加入20μl精子悬浮液。在含有单层小鼠胎儿成纤维细胞的24孔组织培养平板中培养胚胎，在0.5ml胚胎培养基中，覆盖0.3ml经过胚胎试验的矿物油(Sigma)。每个孔中放置25-50个胚胎，在38.5℃下在5％CO2的气体环境下进行培养。通过原核发育检测，确定受精率超过90％。
为了对这些体外受精胚胎进行免疫荧光分析，从Jean-ClaudeCourvalin博士，CNRS，Paris，France获得抗人核纤层蛋白B的抗体。从Santa-Cruz Biotechnology购买抗核纤层蛋白A/C的单克隆抗体，而从Transduction实验室获得抗NuMA的抗体。抗大鼠AKAP95的亲合纯化的兔多克隆抗体得自Upstate Biotechnologies。将体外受精的牛胚胎附着到多聚L-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，用3％多聚甲醛固定15分钟，用0.1％Triton X-100透化处理15分钟(Collas等，J.Cell Biol.1351715-1725，1996)。用含有2％BSA的PBS/0.01％Tween 20(PBST)封闭蛋白质15分钟。将第一抗体(抗AKAP95、抗核纤层蛋白B、抗LBR、抗NuMA和抗核纤层蛋白A/C)和第二抗体都分别温育30分钟，在PBST-BSA中以1∶100稀释来使用。用结合在抗褪色的固定介质中的0.1Ag/ml Hoechst33342对DNA进行复染。将样本放置到载玻片上，用指甲油密封盖玻片。在Olympus BX60表面荧光显微镜上进行免疫荧光观察，用JVC CCD照相机和AnalySIS软件进行拍照。用AldusPhotostyler软件处理照片。用AnalySIS量化程序对荧光信号进行相对量化。将数据表示为平均相对荧光强度。
牛胚胎的免疫荧光分析表明，在细胞核的外周检测到B型核纤层蛋白(附图29A)。而在原核期或8细胞阶段未检测到核纤层蛋白A/C。预期在这些较早的细胞阶段未检测到核纤层蛋白A/C是由于分化细胞的标记(Guilli等，EMBO J.63795-3799，1987)。在所有检查阶段都检测到核基质结构蛋白NuMA(附图29A)。但是，在原核期的牛胚胎中，NuMA标记限制于雌原核(FPN)，雌原核是两个原核中的较小的那个(附图29A中的箭头)。AKAP95最近在小鼠胚胎中被表征(Bomar等，2002提交的初稿)，并被亲合纯化的抗大鼠AKAP95抗体检测到，AKAP95也仅限于雌原核(附图29A)。但是，在后续发育阶段的所有卵裂球的细胞核中也观察到AKAP95在细胞内的分布(附图29A)。
通过对牛原代胎儿成纤维细胞和原核期的体外受精胚胎进行蛋白质印迹分析，验证免疫荧光标记的特异性(附图29B)。对于该分析，通过40mA/凝胶的10％SDS-PAGE来溶解蛋白质。在100V下1小时，在转移缓冲液(25mM TrisHCl，pH8.3，192mM甘氨酸，20％甲醇和0.1％SDS)中将蛋白质通过电泳转移到硝化纤维膜上。用Tris缓冲生理盐水(TBS；即140mM NaCl，2.7mM KCl和25mM Tris-HCl，pH8.0)洗涤膜10分钟，用含有5％牛奶的TBST(含有0.05％Tween-20的TBS)封闭1小时，并用如下的第一抗体温育1.5小时抗AKAP95(1∶250稀释液)、抗核纤层蛋白B(1∶1000)、抗LBR(1∶500)、抗NuMA(1∶500)和抗核纤层蛋白A/C(1∶500)。在TBST中洗涤斑点2次，10分钟，用辣根过氧化酶(HRP)偶联的第二抗体温育1小时。斑点在TBST中洗涤2次，10分钟，并用增强的化学发光(ECL，Amersham)进行显示。
以预期的表观分子量检测所有蛋白质68kDa(B型核纤层蛋白)、70和60kDa(分别为核纤层蛋白A和C)、约180kDa(NuMA)和95kDa(AKAP95)。总之，这些结果表明，植入前的牛胚胎表达细胞核结构蛋白，可以用交叉反应抗体来检测。特别地，在植入前的牛胚胎中，未能免疫地检测到核纤层蛋白A/C。由于核纤层蛋白A/C在体细胞中表达(附图29B)，它们可能构成了核移植胚胎中的细胞核再编程的分子标记。
核被膜、NuMa和AKAP95在核移植牛胚胎中的动力学在牛中检测在传统的核移植方法中的核被膜和核基质结构的动力学。分别用核纤层蛋白A/C和B、NuMA和AKAP95的抗体来研究这些结构。为了确定这些标记在细胞核重建过程中的动力学，用如先前所述分离的原代胎儿成纤维细胞作为供体细胞，生产核移植的牛胚胎(Kasinathan等，Biol.Reprod.641487-1493，2001)。简而言之，通过用溶解在PBS中的0.08％胰酶和0.02％EDTA(胰酶-EDTA)胰蛋白酶化，从牛胎儿中收获细胞。将细胞接种在T75培养烧瓶(Corning)的α-MEM(Gibco)中，α-MEM中添加了10％胎牛血清(FBS；Hyclone)、0.15g/ml谷氨酰胺(Sigma)、0.003％(3-巯基乙醇(Gibco)和抗生素-抗真菌剂(Gibco)。在接种后的第3天，用胰酶-EDTA收获细胞，并冷冻在α-MEM/DMSO中。如先前所述分离G1期的细胞(Kasinathan等，Biol.Reprod.641487-1493，2001)。简而言之，在分离前的24小时，将5.0×105细胞铺到含有10ml MEM/FBS的T75烧瓶中。第二天，用PBS洗涤平板，更换培养基达1-2小时，在Vortex上中速振荡平板30-60秒钟。去除培养基，以500xg离心5分钟，将沉淀重悬在250μl MEM/FBS中。用微量移液管选择通过胞质桥连接的细胞双联体，并用于核移植。
如先前所述进行牛核移植(Kasinathan等，Biol.Reprod.641487-1493，2001)。在成熟后18-20小时，将体外成熟的卵母细胞去核。在将G1期的供体细胞转移到卵周隙后，用单个2.4kV/cm的电脉冲融合细胞20微秒(Electrocell Manipulator 200，Genetronics)。在成熟后的28-30小时(即，在卵母细胞从卵巢收集后在成熟培养基中放置28-30小时和与供体细胞融合后至少2小时)，用钙离子载体(5μM)激活重构的卵母细胞和孤雌生殖对照4分钟(Cal Biochem)，接着用10μg放线菌酮和2.5μg细胞松弛素D(Sigma)在ACM培养基中(100mM NaCl、3mM KCl、0.27mM CaCl2、25mM NaHCO3、1mM乳酸钠、0.4mM丙酮酸盐、1mM L-谷氨酰胺、3mg/ml BSA、1％BME氨基酸和1％MEM非必需氨基酸)激活5小时(Liu等，Mol.Reprod.Dev.49298-307，1998)。激活后，洗涤核移植胚胎或者卵母细胞5次，并在38.5℃下在5％CO2空气中与小鼠胎儿成纤维细胞一起共培养。
用标准方法激活重构的胚胎，融合后3小时，将处于成熟前染色质浓缩阶段的胚胎用多聚甲醛固定，并用核纤层蛋白A/C、核纤层蛋白B、NuMA和AKAP95的抗体通过免疫荧光进行分析(附图30，PCC)。
此外，对允许发育到原核(PN)阶段的核移植胚胎(即融合后15小时的牛胚胎)的组进行类似的分析(附图30，核移植-PN)。作为对照，对如在此所述激活的孤雌生殖卵母细胞也在原核阶段进行检查(附图30，Parth.PN)。
如所预期，供体体细胞(牛胎儿成纤维细胞，附图30)以如文献所预期的分布表达所有标记。在成熟前染色质的浓缩阶段，通过用Hoechst 33342染色DNA来显影显著浓缩的染色体聚集。在浓缩的染色体上或接近浓缩的染色体处，没有检测到核纤层蛋白A/C和B(附图30，PCC)，大概是由于它们分散在卵子的细胞质中。检测到一些被标记的NuMA；该NuMA大概与维持浓缩染色体的纺锤极相关联。相反，AKAP95与浓缩的(PCC)染色体相关联。该结果令人联想起人的有丝分裂细胞中的AKAP95标记(Collas等，J.Cell Biol.1471167-1180，1999；Steen等，J.CellBiol.1501251-1262，2000)。在原核期，检测到所有标记。核纤层蛋白A/C存在于原核被膜上(附图2，核移植-PN)。这与在对照孤雌生殖体(parthenote)原核的被膜(附图30)和受精的原核的被膜(附图29A)上缺乏该标记形成对比。在核移植原核中检测到核纤层蛋白B，在对照原核中也检测到该标记。此外，除了核仁，在细胞核的内部点缀着NuMA和AKAP95。在核移植原核中的N uMA标记始终比对照孤雌生殖原核中的明亮(比较核移植PN与Parth.PN，附图30)。共同地，这些观察结果表明，核移植胚胎的原核重新装配体细胞核标记核纤层蛋白A和C，显示出强烈的NuMA染色。
AKAP95在孤雌生殖胚胎和核移植胚胎的原核中的差别锚定A-激酶锚定蛋白AKAP95是暗示有丝分裂染色体浓缩的核蛋白。用作影响体细胞核在核移植后的再编程的另一种分子标记，AKAP95的核内锚定组分已经在从胎儿成纤维细胞形成的核移植原核阶段的牛胚胎中被表征。AKAP95在孤雌生殖胚胎的原核和供体体细胞核中的锚定也被检查了。
通过在室温下用0.1％Triton X-100、1mg/ml DNA酶I以及100mM或者300mM NaCl提取胚胎来原位检查AKAP95在原核胚中的胞内锚定。如上指出，雄原核不具有任何AKAP95。相反，在牛的核移植胚胎原核以及供体细胞核中，大量AKAP95和DNA对DNA酶I和300mM NaCl产生抗性(附图31)。在孤雌生殖体或核移植原核中，通过DNA酶I和300mM NaCl没有提取到B型核纤层蛋白(附图31)，表明AKAP95和DNA分布的变化不是由于细胞核结构的总体改变而引起的。这些数据表明，如同在体细胞核中那样，在牛方面，与孤雌生殖的原核相比，AKAP95更加紧密地锚定在核移植原核的细胞核内结构中。这种关联是否约束DNA结构或者是否从变化的基因组结构产生，仍有待于确定。由于DNA酶I抗性的DNA的转录被沉默，核移植后AKAP95锚定的不完全重塑可能消弱了在发育上重要的基因的表达。
核纤层蛋白A/C在核移植牛胚胎中的转录性错误调节一个显著结果是核纤层蛋白A/C在牛核移植胚胎原核的外周重新装配，而这种体细胞特异性标记并不存在于体外受精的原核和孤雌生殖的原核中。因此，本发明人研究了核纤层蛋白A/C的重新装配是否是由于(i)在成熟前染色质浓缩阶段解聚的体细胞核纤层蛋白再靶向(re-targeting)(附图30)，(ii)来自母本核纤层蛋白A/CmRNA的集合的翻译和装配或者(iii)体细胞核纤层蛋白A(LMNA)基因在核移植原核中的重新转录。
为了区分这些可能性，通过如在此描述的“传统”核移植方法来生产牛核移植胚胎，核移植后用蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)来激活重构的胚胎，或者在核移植后在存在RNA聚合酶II(PolII)抑制剂放射菌素D(ActD)时进行激活以抑制重新转录。为了在放线菌酮中培养牛核移植胚胎，除了在放线菌酮(CHX)中培养卵母细胞14小时外，如上所述在核移植后激活卵母细胞。激活后14小时，洗涤卵母细胞5次，并在含有15μg/ml Hoechst 33342(Sigma)的ACM培养基中放置1小时。培养后，通过表面荧光显微镜观察原核发育。然后在溶于PBS的3％多聚甲醛中固定原核胚，洗涤和放置到载玻片上。为了在放射菌素D中培养牛核移植卵母细胞，除了在培养步骤中往放线菌酮中添加5μg/ml放射菌素D(ActD)外，在核移植后如上所述培养卵母细胞。5小时后，洗涤卵子5次，并放置到含有5μg/ml放射菌素D的ACM培养基中。激活后14小时，洗涤卵母细胞5次，并在含有15μg/ml Hoechst 33342(Sigma)的ACM培养基中放置1小时。培养后，通过表面荧光显微镜观察原核发育。然后在溶于PBS的3％多聚甲醛中固定原核胚，洗涤和放置到载玻片上。
核纤层蛋白B在核移植原核外周的装配未受到蛋白质或RNA合成抑制的影响。该结果表明，核纤层蛋白B是从先前解聚的体细胞集合和/或从卵母细胞胞质中的大量核纤层蛋白B装配得到的。在核移植原核检中测到核纤层蛋白A/C(附图30)，但是在用放线菌酮激活再生的细胞核中缺乏核纤层蛋白A/C。该结果表明，核纤层蛋白A/C装配需要重新合成的蛋白质，并且这些核纤层蛋白未被通过供体核移植或细胞融合从带入卵母细胞中的分解体细胞库中重新导向。在存在放射菌素D时激活胚胎时，核纤层蛋白A/C未被重新装配。这些结果表明，核纤层蛋白A/C在核移植原核中重新装配是由于LMNA基因在重构原核中重新转录而产生的。在核移植的原核中检测到NuMA，而在用放线菌酮激活的核移植胚胎的原核中未重新装配NuMA，但是在放线菌酮D处理的核移植胚胎的原核中微弱地检测到NuMA。这些结果有力地表明，NuMA在核移植原核中的装配需要发生重新翻译，至少部分地从母本NuMA mRNA的集合中翻译。与对照未处理的核移植胚胎相比，放线菌素D处理的核移植胚胎中的抗NuMA标记较弱(比较中附图32的b′和b)，这种一致的结果表明，核移植原核中的部分NuMA装配是由于原核期NuMA基因的重新转录而产生的。
总之，这些结果表明，在核移植后，细胞核重塑不会使LMNA基因被关闭。类似地，在原核期的核移植胚胎中，NuMA基因显然仍具有活性。可能在成熟前的染色质浓缩过程中，这些基因发生暂时失活，这可以从染色质的高度浓缩的特性中推测得出(附图30)。这些结果清楚地说明，在本文描述的条件下生产的核移植胚胎中，细胞核不完全再编程。如早先对AKAP95的讨论，本发明人认为，核移植原核中持续存在核纤层蛋白A/C会影响基因表达，例如发育上重要的基因的表达。先前报导的核纤层蛋白A和C与染色质蛋白质以及DNA的相互作用，以及这些核纤层蛋白与转录因子的关系同样支持这种假设。
实施例9在传统的牛核移植胚胎中的示例性核再编程缺陷天然胚胎和传统核移植胚胎之间的示例性差别也在下文被描述。这些差别包括分化细胞特异的A型核纤层蛋白的原核装配、原核NuMA和TATA结合蛋白浓缩升高以及核基质-染色体界面成分AKAP95和DNA对用去垢剂、DNA酶和盐提取的敏感性升高的差别。对于这些研究，如先前描述的那样建立牛胎儿成纤维细胞系(Kasinathan等，Nat.Biotechnol.191176-1178，2001和Kasinathan等，Biol.Reprod.641487-1493，2001)。用先前描述的筛除(shake-off)方法，从培养物中分离G1期的成纤维细胞双联体(Kasinathan等，Nat.Biotechnol.191176-1178，2001)。如先前描述，用体外成熟的卵母细胞进行体外受精(Collas等，Mol.Reprod.Dev.34224-231，1993)。对于核移植(NT)和卵母细胞激活，如先前报导，在成熟后20小时，用G1期的供体细胞进行核移植(Kasinathan等，Nat.Biotechnol.191176-1178，2001和Kasinathan等，Biol.Reprod.641487-1493，2001)。在28-30hpm(T＝0)时，用5μM钙离子载体激活重构的胚胎4分钟，接着用10μg/ml CHX和2.5μg/ml细胞松弛素D激活5小时。洗涤胚胎，与小鼠胎儿成纤维细胞共培养(Kasinathan等，Biol.Reprod.641487-1493，2001)。当在CHX中培养重构的胚胎时，如上所述激活卵母细胞，并用2.5μg/ml CHX再培养9小时(在CHX中，总共14小时)。彻底洗涤胚胎，并如先前所述进行培养(Kasinathan等，Biol.Reprod.641487-1493，2001)。当重构的胚胎被暴露于ActD时，除了在5小时的CHX培养步骤中添加5μg/ml ActD外，如上所述激活卵母细胞。
对于免疫分析，将细胞、卵母细胞、胚胎、细胞核(实施例14)和染色质(实施例14)加载到多聚L-赖氨酸包被的盖玻片上，用3％的多聚甲醛固定15分钟，并用0.1％Triton X-100透化15分钟。用PBS/2％BSA/0.01％Tween 20封闭蛋白质。将第一抗体和第二抗体(1∶100稀释)分别培养30分钟。特别地，使用抗人核纤层蛋白B的兔多克隆抗体(Chaudhary等，J.Cell Biol.122295-306，1993)。也使用购自Santa-Cruz Biotechnology的山羊抗核纤层蛋白B多克隆抗体、抗核纤层蛋白A/C单克隆抗体和抗TBP抗体。抗NuMA的单克隆抗体得自Transduction Laboratories，而抗大鼠AKAP95亲合纯化的单克隆抗体购自Upstate Biotechnologies。DNA用0.1μg/ml Hoechst 33342复染。用JVC CCD照相机拍照，并用AnalySIS软件量化免疫荧光强度。将数据表示为相对于对照的平均±SD荧光强度，至少重复3次。对于原位提取，在免疫荧光分析之前，将放置到载玻片上的胚胎和细胞用溶解在Tris-HCl(pH7.2)中的0.1％Triton X-100、1mg/ml DNA酶I和300mM NaCl培养15分钟。对于免疫印迹，将100个胚胎溶解在20μl SDS样本缓冲液中，用10％SDS-PAGE溶解蛋白质，并用如下抗体进行分析抗核纤层蛋白B，1∶1,000；抗核纤层蛋白A/C，1∶250；抗NuMA，1∶500；抗AKAP95，1∶250。
基于上述免疫分析，对A型/C型和B型核纤层蛋白、NuMA和AKAP95在通常用于NT的牛胎儿成纤维细胞中的分布进行表征(附图40)。在体外制备的植入前的牛胚胎中，早在原核(PN)阶段就在细胞核外周中检测到核纤层蛋白B(附图40)。如所预期，在分化的细胞中缺乏核纤层蛋白A/C。NuMA和AKAP95仅限于原核阶段的雌原核中，但是在后续阶段，分散在整个细胞核中。在免疫印迹中证实了免疫荧光数据的特异性(附图40)。
在通过电穿孔将牛成纤维细胞移植到与去核卵母细胞相关的细胞核外形重塑过程中，检测核纤层蛋白A/C和B、NuMA和AKAP95的动力学(Kasinathan等Biol.Reprod.641487-1493，2001)。在融合的3个小时内，供体核发生成熟前的染色体浓缩(PCC)(附图41A)。细胞核核纤层蛋白和NuMA在卵母细胞胞质中重新分布，并不再存在于PCC染色体中(附图41A)。AKAP95与PCC染色体相关，这是与有丝分裂细胞相关的特性。在卵母细胞激活处理开始后的14个小时，NT胚胎显示出完全发育的原核(附图41A，NT PN)。但是，与孤雌生殖胚胎或受精胚胎的原核相反，实际上所有NT原核具有强烈的核纤层蛋白A/C和NuMA免疫反应性，这是供体体细胞的两个特征(附图41A)。
在存在10μg/ml蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)或者5μg/mlRNA聚合酶(Pol)II抑制剂放射菌素D(ActD)(这两者都与原核形成相容)时，受体卵母细胞激活原核核纤层蛋白A/C的装配(附图41B和41C)。该结果表明，这些体细胞核纤层蛋白的装配是由体细胞核纤层蛋白A(LMNA)基因的转录产生的。核纤层蛋白B装配未受到CHX或ActD的影响，表明该核纤层蛋白B装配从分解的体细胞库和/或B型核纤层蛋白的母本库中重新导向(附图41B和41C)。
实际上，在CHX暴露之后未检测到NuMA；但是在用ActD处理之后在NT原核中检测到40％NuMA免疫反应性(附图41B和41C)。该结果表明，NuMA装配是由于母本mRNA翻译和重新转录而导致的。由于核纤层蛋白A/C和NuMA在NT原核中被反常地转录，这些蛋白质可以被用作标记来确定核移植方法再编程供体遗传物质的能力。
如实施例8中所讨论的，AKAP95是细胞核基质-染色质界面的一种结构性多价蛋白(Collas等，J.Cell Biol.1471167-1179，1999)，在超乙酰化的染色质中富集，其在细胞内的锚定性质可以被用作供体遗传物质再编程的一种标记。AKAP95是唯一被研究的标记，在供体体细胞核的染色体上和NT原核中被检测到，具有与孤雌生殖体(附图4lA)和PN胚胎(附图40B)相似的标记强度。通过抑制蛋白质或RNA的合成，维持了AKAP95与NT原核的关系。因此，PN AKAP95的主要部分是体细胞来源的。通过用0.1％Triton X-100、1mg/ml DNA酶I和300mM NaCl提取NT胚胎、孤雌生殖体和供体成纤维细胞来检测AKAP95锚定。在孤雌生殖体中，约90％的AKAP95和DNA被提取；但是，NT原核中的约35％的AKAP95未被提取(附图41D)。AKAP95和DNA对DNA酶I和NaCl的灵敏性与成纤维细胞核的灵敏性类似(附图41D)。在这些条件下，未提取到核纤层蛋白B，表明AKAP95和DNA提取性能的差别不是由细胞核的结构中的总变化产生的。这些结果意味着，NT原核的特征为被AKAP95紧密锚定，以及有限的DNA对DNA酶I的接近性。因此，通过体细胞NT生产的原核似乎表现为结构异常，这是由于供体细胞核形态的不完全重塑和/或体细胞基因的错误转录调控而导致的。
实施例10在传统的牛核移植胚胎中的示例性细胞核再编程缺陷。
如实施例9中所描述的，将核移植(NT)胚胎中的表达模式与体外生产(IVP)的植入前胚胎中的表达模式进行了比较。为了进行该比较，进行了体外受精，并且如先前描述进行胚胎培养(Collas等，Mol.Reprod.Dev.34224-231，1993和Kasinathan等，Biol.Reprod.641487-1493，2001)。通过将供体牛胎儿成纤维细胞融合到去核的卵母细胞中来进行NT(Kasinathan等，Nat.Biotechnol.191176-1178，2001和Kasinathan等，Biol.Reprod.641487-1493，2001)。在成熟后(hpm)28-30小时，用钙离子载体激活受体卵母细胞4分钟，接着用10μg/mlCHX和2.5μg/ml细胞松弛素D激活5小时，并洗涤。将胚胎与小鼠胎儿成纤维细胞共培养(Kasinathan等，Biol.Reprod.641487-1493，2001)。对于CHX处理，如上所述激活卵母细胞，在培养之前，用2.5μg/ml CHX再培养胚胎9小时。对于ActD处理，如上所述对卵母细胞进行激活，除了在5小时的CHX培养步骤中加入5μg/ml ActD外，而在培养之前，将胚胎在5μg/ml ActD中再放置9小时。在体外将胚胎培养到囊胚阶段，在每头受体母畜中移植两枚胚胎。通过超声波检查来监控妊娠，并进行C断层扫描。出生后24小时内，由兽医对小牛进行评分(score)。
为了评价NT和IVP胚胎中的蛋白质水平，使用购自Santa-CruzBiotechnology的抗核纤层蛋白B多克隆抗体、抗核纤层蛋白A/C单克隆抗体和抗TBP多克隆或单克隆抗体。抗AKAP95的抗体来自UpstateBiotechnologies。如所述进行免疫荧光分析(Bomar等，J.Cell Sci.1152931-2940，2002)。简而言之，将细胞和胚胎放置到多聚L-赖氨酸包被的盖玻片上，用3％多聚甲醛固定15分钟，用0.1％Triton X-100透化15分钟，在PBS/2％BSA/0.01％Tween 20中封闭蛋白质。将样本分别与第一抗体和第二抗体(1∶100稀释)一起培养30分钟。用0.1μg/mlHoechst 33342复染DNA。用JVC CCD照相机拍照，并用AnalySIS软件量化免疫荧光强度。如果需要，在进行免疫荧光分析之前，在盖玻片上用溶解在Tris-HCl(pH 7.2)中1％Triton X-100、1mg/ml DNA酶I和300mMNaCl的混合物提取样本15分钟。对于免疫印迹，用10％SDS-PAGE溶解蛋白质样本(30μg)，印迹到硝化纤维膜上，并用特定抗体探查。
在核移植胚胎中供体核的动力学为了研究体细胞核在牛核移植(NT)中的动力学，检查核被膜的两个结构成分，被广泛表达的B型核纤层蛋白(称作核纤层蛋白B)和分化细胞特异性的A型核纤层蛋白(核纤层蛋白A/C)(Gruenbaum等，J.Struct.Biol.129313-323，2000)。核纤层蛋白将核膜锚定到染色质上，一般认为其在体外(原)核重构后促进细胞核扩展。核纤层蛋白也被证明对于细胞存活是关键的，因为不能装配B型核纤层蛋白会导致细胞死亡。作为转录机制的标记，对TATA-结合蛋白TBP的动力学进行了分析，TBP实质上是所有基因的转录因子。核纤层蛋白B的核周分布以及TBP和DNA在牛胎儿成纤维细胞以及体外生产(IVP)的植入前胚胎中的共定位(colocalization)与在其他物种中的观察结果是一致的(Holy等，Dev.Biol.168464-478，1995；Houliston等，Development 102271-278，1988；和Worrad等，Development 1202347-2357，1994)。(附图46A)。如分化细胞的标记，在植入前发育过程中未检测到核纤层蛋白A/C(附图46A)。通过免疫印迹验证了免疫荧光标记的特异性(附图46B)。
在将成纤维细胞核移植到去核的卵母细胞后，核纤层蛋白A/C以及B都从成熟前浓缩的染色体(PCC；融合后3小时)上解离，而TBP仍然与染色体结合(附图46C，PCC)。在对受体卵母细胞的激活开始后14小时，所有NT胚胎含有具有核周核纤层蛋白B标记的成分发育的原核以及与DNA共定位的TBP(附
图1C，NT-PN)。但是，与IVP胚胎相反，95-99％的NT胚胎早在原核阶段就表达核纤层蛋白A/C(附图46C)，而且在整个早期发育阶段都持续表达(参见下文)。通过测定所检测的细胞核中的第二抗体的荧光强度与代表DNA浓度的DNA荧光强度(Hoechst 33342)的比例(单倍体比二倍体)，量化NT胚胎和IVP胚胎的原核中的被免疫标记的核纤层蛋白B、核纤层蛋白A/C和TBP的相对含量。虽然在NT胚胎和IVP胚胎的原核中，核纤层蛋白B的相对含量是类似的，但是NT原核中的核纤层蛋白A/C和TBP的相对含量比IVP胚胎的雄原核(MPN)或雌原核(FPN)的高(附图46D)。
在NT胚胎的原核中的TBP、DNA和A型核纤层蛋白在NT原核中的较高含量的TBP是与对用去垢剂(1％Triton X-100)、核酸酶(1mg/ml DNA酶I)以及盐(0.3M NaCl)的组合进行原位提取的较大抗性相关的。相对于未被提取的对照的免疫荧光标记强度，量化被提取的胚胎中的免疫荧光标记强度，结果表明，在IVP胚胎的雄原核(MPN)或雌原核(FPN)中，仍有约35％的TBP未被提取(附图47A)。但是，如成纤维细胞核中一样，NT原核中的TBP对提取具有很强的抗性(附图47A)。类似地，与IVP胚胎的原核相比，NT原核的DNA对这些条件下的提取的抗性升高了4.5倍(附图47A，DNA)，提示了更加紧密的染色质结构。
为了确定在NT胚胎的原核中的核纤层蛋白B、核纤层蛋白A/C以及TBP的来源，如本文所述，在存在RNA聚合酶(Pol)II抑制剂放射菌素D(ActD；5μg/ml)时或者使用蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX，10μg/ml)对受体卵母细胞进行激活(Knott等，Biol.Reprod.661095-1103，2002)。核纤层蛋白A/C、核纤层蛋白B以及TBP的装配通过光密度分析免疫荧光标记的原核胚来检查。这两种抑制剂都阻止核纤层蛋白A/C的装配(附图47B和48C)，表明这些体细胞核纤层蛋白在胚胎中的装配是核纤层蛋白A基因在原核阶段转录产生的。核纤层蛋白B装配未受到CHX或ActD处理的影响(附图47B和47C)，表明核纤层蛋白B是从NT后溶解在卵母细胞胞质中的体细胞核纤层蛋白装配得到的和/或从核纤层蛋白的母本集合中装配得到的。在未被处理的胚胎中或者在抑制RNA或蛋白质合成之后，也检测到类似含量的TBP(附图47B和47C)。由于TBP与PCC过程中的浓缩的染色体相关，并且由于中期II卵母细胞胞质完全缺乏可检测的TBP，在NT过程中，体细胞来源的TBP可能仍然与供体基因座相关。因此，除了表达A型核纤层蛋白外，NT胚胎原核具有较高含量的TBP和细胞内锚定增强的TBP。
实施例11使用再编程的供体染色质来克隆哺乳动物为了克服在实施例8-10中例证的传统核移植胚胎中存在的不完全再编程的问题，开发出新的方法，以在核移植之前更加有效地再编程供体染色质(PCT/USO1/50406，2001年12月21日申请)。这些方法包括在再编程培养基(例如细胞提取物)中培养来自供体细胞的细胞核(例如编码异种抗体的细胞核)，引起核被膜溶解，以及可能的染色质浓缩。这种核被膜崩解以及染色质浓缩使得结合在染色体上的转录调控蛋白被释放，这些转录调控蛋白还将会促进卵母细胞、胚胎或胎儿发育所不期望的基因的转录。此外，来自再编程培养基的调控蛋白将会结合到染色质上并促进发育所需的基因的转录。
为了生产在朊病毒基因上具有突变和可选择地具有异种Ig基因的有蹄类动物，可以在再编程之前、期间或之后，通过突变朊病毒的一个或多个等位基因和可选择地通过插入一条或多条编码异种抗体的核酸，来修饰供体细胞核或染色质。如果需要，来自克隆胎儿或克隆后代的细胞被用于第二轮核移植，来生产额外克隆的后代。还可以冷冻来自首次克隆胎儿或克隆后代的细胞，形成用作生产额外克隆的有蹄类动物的供体细胞来源的细胞系。
批量生产用于克隆的供体细胞核从培养中的的同步化或未被同步化的细胞群体中可以分离出多达数百万个细胞核。细胞群体可以自然地同步化或经化学处理同步化。优选地，群体中的至少40、60、80、90或100％的细胞停滞在G0期或G1期。为了实现这一目标，将细胞培养在例如低血清培养基中，例如5％、2％或0％的血清中达1、2、3或更多天，来提高处于G0期的细胞的比例。为了将细胞同步化在G1期，可以将细胞以附着细胞形式生长到汇合，然后如先前所述，在0.5-1μg/ml洛克达唑(SigmaChemicals，St.Louis，MO)中培养17-20小时(参见，例如Collas等J.Cell Biol.1471167-1180，1999和其中的参考文献)。通过用一只手反复拍打含有附着的细胞的烧瓶，来剧烈地振荡烧瓶，使有丝分裂细胞与G1期的双联体分离。G1期的双联体是分化过程末期的成对的拉长的细胞，它们仍然通过一个极细的桥连接在一起。根据这种特征性的双联体结构，可以将分离的G1期双联体从培养基中分离出来。分离后，G1期的双联体可以仍然保存连接或者可能分成两个分开的细胞。
用标准方法，在磷酸缓冲的生理盐水(PBS)中收获同步化的或未被同步化的细胞，采取多个洗涤步骤来将细胞从其原始培养基中转移到低渗缓冲液(10mM HEPES，pH7.5、2mM MgCl2、25mM KCl、1mM DTT、10μM抑酶肽、10μM亮抑酶肽、10μM抑肽素A、10μM大豆胰蛋白酶抑制剂和100μM PMSF)中。例如，可以用50ml PBS洗涤，在4℃下以500xg离心10分钟来沉淀细胞。轻轻倒出PBS上清液，将沉淀重悬在50ml PBS中，如上所述进行离心。离心后，将沉淀的细胞重悬在20-50体积的冰冷低渗缓冲液中，在4℃下以500xg离心10分钟。轻轻倒出P上清液，往细胞沉淀中加入约20体积的低渗缓冲液。小心地将细胞重悬在该缓冲液中，在冰上培养至少1小时，使细胞逐步膨胀。
为了从细胞中分离细胞核，用标准方法溶解细胞。例如，将2-5ml的细胞悬浮液转移到玻璃匀浆机中，用大小适合的杵以起始的10-20次撞击进行Dounce氏匀浆。可替代地，用机动的搅拌器(例如Ultraturrax)来匀浆细胞悬浮液。如果需要，用相差显微镜在40倍下监控细胞溶解产物。在该匀浆过程中，细胞核应当保持完整，大部分或者优选所有的原始附着的胞质成分例如囊泡、细胞器和蛋白质从细胞核中释放出来。如果需要，将1-20μg/ml细胞骨架抑制剂细胞松弛素B或细胞松弛素D添加到前述的低渗缓冲液中，以方便该加工。匀浆持续足够长的时间，以溶解细胞并从细胞核中释放胞质成分。对于某些细胞类型，需要多达100、150或更多次撞击。然后将溶解产物转移到放在冰上的15ml圆锥形管中，对剩余的膨胀细胞悬浮液重复进行细胞溶解加工。将用低渗缓冲液配制的2M的蔗糖母液添加到细胞溶解产物中(例如，将1/8体积的2M母液添加到溶解产物中)，得到250mM蔗糖的最终浓度。通过颠倒来混合该溶液，通过在4℃下在摇摆转子中以400xg离心10-40分钟来沉淀细胞核。然后弃去上清液，将沉淀的细胞核重悬在10-20体积的细胞核缓冲液(10mM HEPES，pH 7.5，2mM MgCl2，250mM蔗糖，25mM KCl，1mM DTT，10μM抑酶肽，10μM亮抑酶肽、10μM抑肽素A、10μM大豆胰蛋白酶抑制剂和100μM PMSF)中。如上所述，沉淀细胞核，并重悬在1-2体积的细胞核缓冲液中。新鲜的分离细胞核可以立即用于下述的体外再编程和核移植，或者保存备用。对于保存，将细胞核稀释在细胞核缓冲液中，到约106/ml的浓度。加入甘油(2.4体积的100％甘油)，通过轻轻吹吸充分混合。将悬浮液以100-500μl的体积等分到冰上的1.5ml试管中，在甲醇-干冰浴中立即进行冷冻，保存在-80℃下。使用前，在冰上或室温下解冻细胞核的等分试样。加入1体积冰冷的细胞核缓冲液，在摇摆转子中以1,000xg离心该溶液15分钟。将沉淀的细胞核重悬在100-500μl细胞核缓冲液中，如上所述进行离心。然后将沉淀的细胞核重悬在最小体积的细胞核缓冲液中，在冰上保存备用。
用于再编程供体遗传物质的有丝分裂提取物或培养基的制备对于有丝分裂提取物的制备，通过在0.5-1μg/ml洛克达唑中培养17-20小时(参见，例如Collas等，J.Cell Biol.1471167-1180，1999和其中的参考文献)将体细胞系(例如成纤维细胞)同步化在有丝分裂期，如上所述，通过剧烈振荡来分离有丝分裂细胞。弃去分离的G1期的双联体，或者该双联体可以保持与构成分离细胞的主要部分的有丝分裂细胞(通常至少80％)在一起。在4℃下，在10ml圆锥形管中，以500xg离心收获的分离细胞达10分钟。汇集多个细胞沉淀，重悬在总体积50ml的冰冷PBS中，并在4℃下以500xg离心10分钟。重复该PBS洗涤步骤。将细胞沉淀重悬在约20体积的冰冷细胞溶解缓冲液(20mM HEPES，pH8.2，5mM MgCl2，10mM EDTA，1mM DTT，10μM抑酶肽，10μM亮抑酶肽、10μM抑肽素A、10μM大豆胰蛋白酶抑制剂和100μM PMSF和可选择地20μg/ml细胞松弛素B)中，通过在4℃下以800xg离心10分钟来沉淀细胞。弃去上清液，小心地将细胞沉淀重悬在不超过1体积的细胞溶解缓冲液中。细胞在冰上培养1小时，使细胞膨胀。用尖端超声波仪进行超声波处理或者用玻璃研钵和杵进行Dounce匀浆来溶解细胞。溶解细胞直到至少90％的细胞和细胞核被溶解，这可以通过相差显微镜来评定。用于溶解至少90％的细胞和细胞核的超声波时间将根据用于制备提取物的细胞的类型而变化。
将细胞溶解产物放置在1.5ml的离心管中，用台式离心机在4℃下以10,000到15,000xg离心15分钟。从离心机中取出试管，立即放到冰上。用200μl移液管尖头小心地收集上清液，将来自多个管的上清液汇集在一起，放在冰上。该上清液是“有丝分裂细胞质的”或“MS15”提取物。可以将该细胞提取物等分到放在冰上的试管中，每管50μl或10μl，取决于用于生产染色质的是常规方法还是微量法。立即在液氮中迅速冷冻该提取物，并在-80℃下保存直到使用。可替代地，将细胞提取物加到冰上的超速离心管中(例如，适合用于SW55 Ti转子；Beckman)。如果需要，在试管中覆盖矿物油直到顶端。在4℃下以200,000xg离心提取物3小时，沉淀包含在MS15提取物中的膜囊。在离心后期，弃去矿物油。小心地收集上清液，如果需要，汇集在一起，加到冰上的冷的1.5ml试管中。该上清液称作为“MS200”或者“有丝分裂胞质”提取物。如所述的用于MS15的提取物方式，将该提取物等分并冷冻。
如果需要，可以用其他细胞核因子富集提取物。例如，可以从再生提取物来源的细胞类型的细胞或者从任何其他细胞类型的细胞纯化细胞核，并如上所述通过超声波溶解。在搅动下，在含有浓度为0.15-800mM的NaCl或KCl细胞核缓冲液中培养10-60分钟来提取细胞核因子。离心溶解产物来沉淀不可溶的成分。透析含有感兴趣的被提取因子的上清液来去除NaCl或KCl。将透析的细胞核提取物等分并冷冻保存。在加入用于再生的细胞核之前，将该细胞核提取物以各种浓度添加到上述完全细胞提取物中。
还可以从生殖细胞中制备有丝分裂提取物，例如卵母细胞或雄性生殖细胞。例如，收集自然停滞在该阶段的中期II的卵母细胞、洗涤并且如上所述进行胞解，来生产卵母细胞提取物。为了制备雄性细胞提取物，通过切碎器官并在蔗糖或percoll梯度中对收获的细胞进行差异离心，从屠宰场获得的睾丸中分离生殖细胞。从体(Leydig和Sertoli)细胞中分离生殖细胞，通过悬浮洗涤，在PBS中沉淀。然后如上所述在冰冷的细胞溶解缓冲液中洗涤细胞一次，并通过超声波溶解。通过在4℃下以15,000xg离心15分钟来使溶解产物澄清，等分上清液(即生殖细胞提取物)，并迅速冷冻在液氮中。
作为细胞提取物的替代，还可以通过将一种或多种天然或重组的因子(例如核酸或蛋白质例如DNA转甲基酶、组蛋白脱氨酶、组蛋白、精蛋白、核纤层蛋白、转录因子、激活剂、阻抑蛋白、染色质重塑蛋白、生长因子、白介素、细胞因子或其他激素)添加到溶液中例如缓冲液中，来制备再编程培养基。优选地，一种或多种因子对卵母细胞或干细胞是特异的。
浓缩的染色质的形成在冰上解冻MS15或MS200提取物或者有丝分裂培养基的等分试样。将ATP-生成体系(0.6μl)添加到20μl提取物或培养基中，并通过振荡混合。对于ATP-生成体系的制备，混合等比例的100mM ATP母液、1M磷酸肌酸和在水中制备的2.5mg/ml肌氨酸激酶溶液(100x)，在冰上保存直到使用。往提取物中加入ATP生成体系，最终浓度为1mM ATP、10mM磷酸肌酸和25μg/ml肌氨酸激酶。
将细胞核悬浮液添加到提取物或培养基中，浓度达到每10μl提取物或培养基中有1μl细胞核，通过吹吸充分混合，在30、33、35、37或39℃的水浴中进行培养。以规则的间隔轻拍打含有混合物的试管，以防止染色体在试管底部凝聚成块。以规则的间隔例如每15分钟，在显微镜下监控核被膜的崩解和染色体的浓缩。当核被膜崩解并且染色体已经开始浓缩时，开始从提取物或培养基中回收染色质的操作。
可替代地，通过在用抗体将分离的细胞核预先加载到核基质蛋白NuMA上之后进行上述操作，以形成未浓缩或仅部分浓缩的染色质(Steen等，J.Cell Biol.149，531-536，2000)。该操作使得可以通过溶解环绕供体细胞核的核膜来从染色质上去除细胞核成分；但是，通过加入抗NuMA抗体来抑制浓缩步骤。阻止染色体浓缩可以降低在有丝分裂提取物中培养染色体时染色体发生崩解或丢失的危险。
对于该操作，在室温下在含有0.75μg/ml溶血卵磷脂的500μl细胞核缓冲液中透化纯化的细胞核(2,000细胞核/μl)15分钟。通过加入1ml在细胞核缓冲液中制备的3％BSA并在冰上培养5分钟，来泯灭过量的溶血卵磷脂。然后沉淀细胞核，并在细胞核缓冲液中洗涤一次。将细胞核以2,000细胞核/μl重悬在100μl的含有抗NuMA抗体(1∶40稀释；Transduction Laboratories)的细胞核缓冲液中。在冰上培养1小时，轻轻搅拌，用1M蔗糖以500xg沉淀细胞核20分钟。然后将细胞核重悬在细胞核缓冲液中，并添加到如先前章节所说的含有ATP生成体系的有丝分裂提取物或培养基中。可选择地，将抗NuMA抗体添加到提取物或培养基中，以进一步防止染色体浓缩。
通过暴露于去垢剂或蛋白激酶中来形成浓缩的或仅部分浓缩的染色体。去垢剂用于溶解细胞核中的未被结合的或松散地结合到染色体上的细胞核成分，以去除核被膜。对于该操作，在添加了去垢剂例如0.1％-0.5％Triton X-100或NP-40的细胞核缓冲液中培养被纯化的细胞核(2,000-10,000细胞核/μl)。为了便于去除核被膜，其他盐例如NaCl，以约0.1、0.15、0.25、0.5、0.75或1M的浓度被添加到缓冲液中。在冰上轻轻振荡培养30-60分钟后，通过在摇摆转子中以1,000xg离心10-30分钟来沉淀细胞核，离心时间取决于总体积。将沉淀的细胞核重悬在0.5-1ml细胞核缓冲液中，并如上所述进行沉淀。重复该洗涤步骤两次，以确保完全去除去垢剂和额外的盐。
可替代地，用重组的或天然的蛋白激酶单独地或组合地去除核被膜。优选地，用标准方法来纯化蛋白激酶或者从商业来源获得纯化形式的蛋白激酶。这些激酶可能使核被膜、核基质或染色质的成分磷酸化，以去除核被膜(参见，例如Collas和Courvalin，Trends CellBiol.105-8，2000)。优选激酶包括依赖细胞周期蛋白的激酶1(CDK1)、蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A(PKA)、MAP激酶、依赖钙/钙调素的激酶(CamKII)和CK1酪蛋白激酶或CK2酪蛋白激酶。对于该方法，室温下，在1.5ml离心管中，将约20,000纯化细胞核培养在20μl磷酸化缓冲液中。用于CDK1(Upstate Biotechnology)的优选磷酸化缓冲液含有200mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH7.2-7.6)、10mMMgSO4、80mM β-甘油磷酸、5mM EGTA、100M ATP和1mM DTT。对于PKC，一种优选缓冲液含有200mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH7.2-7.6)、10mM MgSO4；100μM CaCl2、40μg/ml磷脂酰丝氨酸、20μM甘油二酯、100μM ATP和1mM DTT。如果同时使用PKC和CDK1，采用添加了40μg/ml磷脂酰丝氨酸和20μM甘油二酯的CDK1磷酸化缓冲液。用于PKA的优选磷酸化缓冲液包括200mM NaCl、10mM MgSO4、10mM Tris，pH 7.0、1mM EDTA和100μM ATP。对于MAP激酶，使用添加了10mM CaCl2和1mM DTT的PKA磷酸化缓冲液。对于CamKII，可以使用添加了1mM DTT的PKA缓冲液或者从Upstate Biote chnology购买的Cam激酶分析试剂盒(Venema等，J.Biol.Chem 27228187-90，1997)。
通过加入蛋白激酶到25-100ng的最终浓度，来开始磷酸化反应。该反应在室温下培养达到1小时。在该过程中，通过显微镜监控核被膜的崩解，例如以15分钟的间隔。在核被膜崩解后，如上所述洗涤细胞核3次，以除去去垢剂溶液。
染色质的回收将含有浓缩的、部分浓缩的或者未浓缩的染色质的提取物或溶液加入到相同体积的用细胞核缓冲液配制的1M蔗糖中。在4℃下，在摇摆转子中以1,000xg离心10-30分钟来沉淀染色质，离心时间取决于样本的体积。弃去上清液，通过吹打小心地将沉淀的染色质重悬在0.1-1.0ml细胞核缓冲液或者脂融合缓冲液(溶解在约pH7.0或pH7.5的20mM HEPES或者约pH6.2的20mM MES中的150mM NaCl、10μM抑酶肽、10μM亮抑酶肽、10μM抑肽素A、10μM大豆胰蛋白酶抑制剂和100μM PMSF)中，并以1,000xg离心10-30分钟。弃去上清液，将沉淀的染色质重悬在细胞核缓冲液或脂融合缓冲液中，在冰上保存直到使用。将各种染色质转移到20μl的HEPES缓冲培养基的液滴中，在显微操作培养皿中用油覆盖这些液滴。如下所述，将一条染色体插入到各个去核的卵母细胞中。
制备染色质的微量法将10-20μl的MS15或MS200提取物或含有ATP生成体系、去垢剂和/或盐溶液或者有丝分裂培养基或者如上所述的蛋白激酶溶液放置到培养皿中。然后加入50μl的处于培养基中的分离的G1期细胞双联体或G0期的细胞的液滴、用于方便细胞溶解的含有0.1％Triton X-100或NP-40的HEPES或者碳酸氢盐缓冲液的分离的50μl“胞解”液滴，以及50μl的卵母细胞注射培养液液滴。这些液滴的每一个被用CO2平衡的矿物油覆盖着。在培养皿中还添加了50μl的培养基“洗涤液滴”，用于洗涤溶解的细胞或细胞核。
用移液管将细胞转移到胞解液滴中。通过轻轻地重复吹吸，在移液管中溶解细胞膜。当细胞被溶解时，将溶解产物轻轻地排出到洗涤液滴中，迅速将细胞核吸走以除去去垢剂。可选择地，透化处理的细胞核，并且在被添加到有丝分裂提取物或培养基之前用抗NuMA抗体进行培养。然后将细胞核排斥到MS15、MS200或培养基、去垢剂和/或盐溶液或者蛋白激酶溶液的液滴中。如上所述监控细胞核崩解和染色体浓缩。如果使用不含抗NuMA抗体的有丝分裂提取物，一旦核被膜崩解，染色体就开始浓缩，如下所述，用微量移液管分离单一的完整染色质，并且转移到去核的受体卵母细胞中卵母细胞的去核优选地，受体卵母细胞为中期II的卵母细胞。在该阶段，卵母细胞被激活或者已经被充分激活，以如对待受精精子那样处理导入的染色质。为了卵母细胞的去核，将卵母细胞中的部分或优选全部DNA去除或灭活。这种在受体卵母细胞中的DNA的破坏或去除阻止了卵母细胞的遗传物质对克隆哺乳动物的生长和发育产生影响。用于破坏卵母细胞的原核的一种方法是暴露于紫外线中(Gurdon，in Methods in CellBiology，Xenopus LaevisPractical Uses in cell and Molecular Biology，Kay和Peng，编辑，Academic Press，California，36卷299-309，1991)。可替代地，通过任何标准技术，手术去除卵母细胞原核(参见，例如McGrath和Solter，Science 2201300-1319，1983)。在一种可能的方法中，将针头插入到卵母细胞中，将细胞核吸到针头的内腔中。然后从卵母细胞中取出针头。而不破坏质膜(美国专利4,994,384和5,057,420)。
用于将染色质插入卵母细胞的脂融合通过如下所述的脂融合或者通过标准的微注射或者电融合技术(参见例如美国专利4,994,384和5,945,577)，将染色质导入到受体卵母细胞中。如下的脂融合方法还可以被用于其他应用，将染色体插入到其他受体细胞中。
如上所述，通过离心从有丝分裂提取物、去垢剂和/或盐溶液、或者蛋白质激酶溶液中分离染色质，然后用脂融合缓冲液洗涤。将染色质存储在冰冷的脂融合缓冲液中直到使用。可替代地，等分染色质，在液氮或在甲醇-干冰浴中冷冻，并且冷冻保存在-80℃下。将一种或多种基因融合试剂与脂融合缓冲液以分别为约5∶1-1∶10的比例混合，制备脂融合溶液。基因融合试剂由但是不限于聚乙二醇(PEG)和亲脂性化合物例如Lipofectin、Lipofectamin、DOTAP{N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵甲基硫酸盐；C43H83NO8S}、DOSPA{2，3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐}和DOPED(二油酰基磷脂酰乙醇胺)。
其他优选的脂质包括中性的和单价的或多价的阳离子脂质，例如含有季铵基团的那些脂质。其他优选的脂质含有胆固醇部分，例如那些由胆固醇中的羟基与脂质中的基团反应形成的脂质。还有其他优选的脂质具有饱和的或不饱和脂肪酸，其优选含有5到10、10到15、15到20或20到30个碳原子，包括端点值。这些脂质可以用标准的化学合成技术合成，从天然来源获得，或者从商业来源购买得到(Summers等Biophys J.713199-3206，1996；Nabekura等，Pharm Res.131069-1072，1996；Walter等，Biophys J.66366-376，1994；Yang等，Biosci Rep.13143-157，1993；Walter和Siegel，Biochemistry.6323271-3281，1993)。其他优选的基因融合化合物为磷脂，例如来自海胆卵子或者其他来源的膜囊碎片(Collas和Poccia，J.Cell Science 1091275-1283，1996)。优选地，将染色体与膜囊碎片接触不会使得染色体被完整的膜包被。
对于阳离子脂质，例如DOTA，可以以0.1-30μg/ml的浓度用于脂融合缓冲液中。可替代地，可以使用由阳离子脂质和中性脂质例如DOPE的混合物组成的脂质体配方。
将新鲜制备的或者冷冻解冻的染色质与脂融合溶液混合，使得该染色质上包被该化合物。在20-30℃温度下培养约10-30分钟。将脂融合溶液中的含有染色质的微滴放置在经CO2平衡过的矿物油下。还制备含有去核的受体卵母细胞的液滴。将包被了脂融合化合物的染色质挑选到微量移液管中，插入到卵母细胞胞质和透明带之间的卵周隙中。将染色质放置到接近卵母细胞膜，以确保与卵母细胞接触。将染色质-卵母细胞复合物维持在20-30℃的温度下，在显微镜下监控融合。一旦发生融合，如下所述激活重构的卵母细胞。
重构的卵母细胞的激活、培养和移植为了防止极体排出和染色体丢失，在存在细胞松弛素B时激活卵母细胞，或者在激活后立即加入细胞松弛素B(Wakayama等PNAS9614984-14989，1999；Wakayama等Nature Genetics 24108-109，2000)。可以采用电的或非电的手段来激活重构的卵母细胞。用于激活卵母细胞的电技术在本领域中是熟知的(参见，例如美国专利4,994,384和5,057,420)。用于激活细胞的非电技术可以包括本领域知晓的用于提高细胞分化概率的任何技术。非电的用于激活卵母细胞的手段的例子包括在乙醇；肌糖三磷酸；Ca++离子载体和蛋白激酶抑制剂；蛋白质合成抑制剂；佛波醇酯；毒胡萝卜素或者精子的任何成分存在时，培养卵母细胞。其他用于激活的非电方法包括使卵母细胞经过冷休克或者机械应激。可替代地，在核移植后的1-3小时后，在含有Sr2+的培养基中培养卵母细胞约6小时来激活它们，用细胞松弛素B防止细胞浆的移动和极体排出(Wakayama等PNAS 9614984-14989，1999；Wakayama等Nature Genetics 24108-109，2000)。根据所克隆的哺乳动物的类型，优选的激活长度可以是变化的。例如，在家畜例如牛中，卵母细胞激活阶段通常在约16-52小时或者优选在约28-42小时的范围内。
激活后，将卵母细胞放置在培养基中达恰当的时间量，以使生成的胚胎发育。在两细胞阶段或者后期，将胚胎移植到代孕受体雌性动物中，以发育到足月。对于牛，在植入到母体宿主内之前，通常将胚胎培养到囊胚期(例如，约6-8天)。对于其他克隆动物，体外培养的合适长度是本领域技术人员知晓的，或者可以通过常规试验确定。
用于将胚胎植入到哺乳动物子宫中的方法也是本领域熟知的。优选地，胚胎的发育阶段与宿主哺乳动物的发情周期相关。一旦胚胎被植入到哺乳动物的子宫中，该胚胎可以发育到足月。可替代地，胚胎可以在子宫中发育到所选择的时期，然后用标准的手术方法取出胚胎(或胎儿)，以确定其健康状况和发育能力。来自一个物种的胚胎可以被植入到来自另一个物种的动物的子宫环境中。例如，牛胚胎可以在绵羊的输卵管中发育(Stice和Keefer，Biology of Reproduction 48715-719，1993)。胚胎和子宫之间的任何物种杂交关系可以被用于本发明的方法中。
细胞核与卵母细胞或者其他受体细胞的脂融合如上所述，通过将一种或多种基因融合试剂与脂融合缓冲液以约5∶1-1∶10的各种比例混合来制备脂融合溶液。将新鲜制备的或者冷冻解冻的细胞核与脂融合溶液混合，使得该细胞核上包被该化合物。在20-30℃温度下培养约10-30分钟。将脂融合溶液中的含有细胞核的微滴放置在CO2平衡过的矿物油下。还制备含有受体细胞优选去核的受体细胞的液滴。如上所述，通过显微操作机械地去除染色体或细胞核或者通过暴露于UV光中来破坏遗传物质，来制备去核的受体细胞。对于插入到卵母细胞中，将包被了脂融合化合物的染色质挑选到微量移液管中，插入到卵母细胞胞质和透明带之间的卵周隙中。为了插入到其他受体细胞中，优选地将被包被的细胞核放置到接近细胞膜，以确保与细胞接触。将细胞核-细胞复合物维持在20-30℃的温度下，在显微镜下监控融合。一旦发生融合，如上所述激活重构的卵母细胞。
实施例12用再编程的经过透化处理的细胞来克隆哺乳动物的用途也可以无需从细胞中分离细胞核或染色质来再编程细胞。在该方法中，将细胞透化，然后在允许培养基(例如细胞提取物)和细胞之间发生因子交换的条件下，在间期的或有丝分裂期的再编程培养基中培养。如果使用间期培养基，则细胞中的细胞核仍然与膜结合；如果使用有丝分裂培养基，则可能发生核被膜崩解和染色质浓缩。在通过在该培养基中培养再编程细胞核后，优选重新封闭质膜，形成完整的再编程细胞，其含有来自培养基的期望因子。如果需要，如实施例11所述，用其他细胞核因子富集该培养基。然后使再编程的细胞与受体卵母细胞融合，将从重构的卵母细胞生成的胚胎植入母体受体哺乳动物中，以生产克隆哺乳动物。
为了在朊病毒基因中生产具有突变和任选地具有异种Ig基因的有蹄类动物，在再编程之前、期间或之后，通过突变朊病毒基因的一个或多个等位基因和任选地通过插入一条或多条编码异种抗体的核酸来修饰供体细胞。如果需要，将来自克隆的胎儿或者克隆后代的细胞用于第二轮核移植中，以生产额外克隆的后代。还可以将来自首次克隆的胎儿或克隆后代的细胞冷冻，形成作为生产额外的克隆有蹄类动物的供体细胞的来源的细胞系。
细胞的透化处理用这种方法可以再编程细胞，包括未被同步化的细胞或者被同步化在G0、G1、S、G2或M期的细胞或者这些阶段的细胞的组合。用标准方法透化处理细胞，例如用洋地黄皂苷或者链球菌溶血素O进行透化处理。简而言之，用标准方法收获细胞，并用PBS洗涤。对于洋地黄皂苷透化处理，将细胞重悬在含有浓度约0.001-0.1％的洋地黄皂苷的培养基中，在冰上培养10分钟。对于用链球菌溶血素O进行透化处理，在室温下，在链球菌溶血素O溶液(参见，例如Maghazachi等FASEB J.11765-774，1997及其中的参考文献)中培养细胞约15、30或60分钟。经过各种培养后，通过以400xg离心10分钟来洗涤细胞。通过在PBS中重悬和沉淀，重复洗涤步骤两次。在室温下将细胞保持在PBS中直到使用。优选地，如下所述，将经透化的细胞立即加入到间期或有丝分裂期培养基中进行再编程。
再编程培养基的制备为了制备间期再编程提取物，用标准方法收集间期培养的细胞，通过在4℃下在10ml圆锥管中以500xg离心10分钟来洗涤细胞。弃去上清液，将细胞沉淀重悬在总体积为50ml的冷PBS中。在4℃下，以500xg离心细胞10分钟。重复该洗涤步骤，将细胞沉淀重悬在约20体积的冰冷的间期细胞溶解缓冲液中(20mM HEPES，pH8.2，5mMMgCl2，1mM DTT，10μM抑酶肽，10μM亮抑酶肽、10μM抑肽素A、10μM大豆胰蛋白酶抑制剂和100μM PMSF，和可选择地20μg/ml细胞松弛素B)。在4℃下以800xg离心来沉淀细胞。弃去上清液，小心地将细胞沉淀重悬在不超过1体积的间期细胞溶解缓冲液中。在冰上培养细胞1小时，使细胞膨胀。用尖端超声波仪进行超声波处理或者用玻璃研钵和杵进行Dounce匀浆来溶解细胞。溶解细胞直到至少90％的细胞和细胞核被溶解，这可以通过相差显微镜来评定。用于溶解至少90％的细胞和细胞核的超声波时间将根据用于制备提取物的细胞的类型而变化。
将细胞溶解产物放置在1.5ml的离心管中，用台式离心机在4℃下以10,000-15,000xg离心15分钟。从离心机中取出试管，立即放到冰上。用200μl移液管尖头小心地收集上清液，将来自多个管的上清液汇集在一起，放在冰上。该上清液是“间期细胞质的”或“IS15”提取物。可以将该细胞提取物等分到冰上的试管中，每管20μl，并且立即在液氮中迅速冷冻，在-80℃下保存直到使用。可替代地，将细胞提取物加到冰上的超速离心管中(例如，适合用于SW55 Ti转子；Beckman)。如果需要，在试管中覆盖矿物油直到顶端。在4℃下以200,000xg离心提取物3小时，以沉淀IS15提取物中含有的膜囊。在离心后期，弃去矿物油。小心地收集上清液，如果需要，汇集在一起，加到冰上的冷的1.5ml试管中。该上清液被称作为“IS200”或者“间期胞质”提取物。如所述的用于IS15的提取物方式，将该提取物等分并冷冻。
如果需要，可以用其他细胞核因子富集提取物。例如，可以从再生提取物来源的细胞类型的细胞或者从任何其他细胞类型的细胞纯化细胞核，并如上所述通过超声波溶解。在搅动下，在含有浓度为0.15-800mM的NaCl或KCl细胞核缓冲液中培养10-60分钟来提取细胞核因子。离心溶解产物来沉淀不可溶的成分。透析含有感兴趣的提取因子的上清液来去除NaCl或KCl。将透析的细胞核提取物等分并冷冻保存。在加入用于再生的细胞核之前，将该细胞核提取物以各种浓度添加到上述的完全细胞提取物中。
还可以从生殖细胞，例如卵母细胞或雄性生殖细胞中制备间期提取物。例如，如上所述激活卵母细胞，培养5小时以进入间期。然后除了在溶解缓冲液中省去EDTA外，如实施例11所述那样处理卵母细胞用于中期II的卵母细胞提取物。雄性生殖细胞提取物可以如实施例11所述进行制备。
作为细胞提取物的替代，还可以通过将一种或多种天然或重组的因子(例如核酸或蛋白质例如DNA转甲基酶、组蛋白脱乙酰基酶、组蛋白、精蛋白、核纤层蛋白、转录因子、激活剂、阻抑蛋白、染色质重塑蛋白、生长因子、白介素、细胞因子或其他激素)添加到溶液中例如缓冲液中。优选地，一种或多种因子对卵母细胞或干细胞是特异的。
在培养基中再编程细胞将被透化处理的细胞以约100-1,000细胞/μl的浓度悬浮在上述间期再编程培养基或者实施例11所述有丝分裂再编程培养基之一中。将ATP生成体系和GTP加入到上述提取物中，在30-37℃下培养达2小时，以促进因子从提取物中转移到细胞中的活化细胞核摄取因子或染色体结合因子。以800xg离心再编程的细胞，通过重悬洗涤，和在PBS中以400xg离心。如果需要，将细胞重悬在含有30％胎牛血清(FCS)的培养基、含有2mM CaCl2(由用水配制的1M母液中加入)的RPMI1640或者含有2mM CaCl2的α-MEM培养基中，在常规细胞培养箱中于37℃下培养1-3小时，使细胞膜再封闭。然后在常规的温热培养基(10％FCS)中洗涤细胞，采用标准培养条件进一步培养细胞。如实施例17中所述，再编程的透化细胞还可以被用于遗传转移到卵母细胞中，而不需要再封闭细胞膜。
再编程透化的细胞的替代方法可替代地，可以在放置在盖玻片上时对细胞进行透化处理，以将对细胞的处理减到最少，以去除对细胞的离心，从而使细胞的活力最大化。在12孔平板中，让细胞(例如成纤维细胞)在RPMI1640中的16mm的多聚L-赖氨酸包被的盖玻片上生长到50,000-100,000细胞/盖玻片。在37℃下的常规气体条件下，在无Ca2+Hank氏平衡盐溶液中(Gibco-BRL)的200ng/ml链球菌溶血素O中透化处理细胞50分钟。如果需要，可以根据碘化丙锭的摄取测定在这些条件下被透化处理的细胞的比例。吸去链球菌溶血素O；盖玻片上覆盖有80-100μl再编程培养基；在37℃下和CO2气体中培养细胞30分钟到1小时。再编程培养基优选含有ATP生成体系和1mM任一ATP、CTP、GTP和UTP。为了任选地再封闭质膜，将含有2mM CaCl2的α-MEM培养基、含有20-30％胎牛血清的培养基或者含有2mM CaCl2的RPMI1640添加到孔中，在37℃下培养细胞2小时。可替代地，质膜未被再封闭。
链球菌溶血素O对透化处理和再封闭细胞的比例的影响为了评价透化处理和再封闭细胞的比例，进行链球菌溶血素O培养的剂量和时间滴定(表7)。在链球菌溶血素O处理的末期，通过0.1μg/ml DNA染料碘化丙锭的摄取来评价对细胞的透化处理。类似地在再封闭处理的末期，对各组细胞进行再封闭的评价。
表7链球菌溶血素O处理的牛成纤维细胞的透化处理和再封闭
对用链球菌溶血素O处理和暴露于有丝分裂提取物的牛成纤维细胞的存活力的评价进行TUNEL分析，评价用0或500ng/ml链球菌溶血素O透化处理和再封闭的细胞中，或者在用链球菌溶血素O透化处理、暴露于有丝分裂提取物30或60分钟并再封闭的细胞中的凋亡。TUNEL阳性细胞是发生凋亡的细胞(即细胞死亡)。数据表明，链球菌溶血素O本身不会诱导凋亡(表8)。基于TUNEL分析，将链球菌溶血素O处理的细胞暴露于有丝分裂提取物中60分钟而不是30分钟，使凋亡率上升10％(表8)。基于这些数据，在提取物中培养供体细胞30分钟比培养60分钟更加优选。通过对细胞进行免疫荧光分析，结果表明培养30分钟引起大部分被检查的细胞的核被膜崩解(约90％，n＞100)。
此外，在提取物中培养并在缓冲液N或TL-HEPES和如在实施例11中描述的用于染色质转移方法的蔗糖中洗涤的纯化细胞不会发生凋亡(分别为2/34和3/47TUNEL阳性)
表8对链球菌溶血素O和链球菌溶血素O加上提取物处理的牛成纤维细胞的TUNEL分析
选择用于这些克隆方法的透化方法是在38℃下用500ng/ml SLO处理30分钟。选择用于在再编程细胞周围形成完整细胞膜的再封闭方法是在含有α-MEM培养基中培养2小时。
使用蛋白酶的可替代细胞透化处理方法在一个采用蛋白酶的示例性的细胞透化处理方法中，让细胞(例如成纤维细胞)在35mm平板中生长过夜至汇合。采用常规的胰蛋白酶-EDTA(0.5％-5.3mM)方法处理5分钟，从平板上取出成纤维细胞。在PBS中洗涤成纤维细胞，然后重悬在1ml TL Hepes中。将1ml溶于TL Hepes中的3mg/ml蛋白酶添加到1ml细胞悬浮液中(最终的蛋白酶浓度为1.5mg/ml)，在室温下培养1分钟。在10ml HBSS中洗涤细胞，重悬在1ml HBSS中并计数。将最小体积的约105个细胞用于有丝分裂提取物培养。将40μl的MS-15有丝分裂提取物加到细胞中，在37℃下放置30分钟。然后在TL Hepes中洗涤细胞，用于本文描述性的核移植方法之一中。
这些细胞具有透化信号，由于在有丝分裂提取物中培养后，70-80％细胞发生核被膜崩解和成熟前染色体的浓缩，表明来自提取物中的MPF(成熟促进因子)或者MPF的某些成分已经跨过细胞膜。这种细胞透化方法可以与各种蛋白酶，例如胰蛋白酶一起使用，以及与生殖细胞、体细胞、胚胎细胞、胎儿细胞、成体细胞、分化的和未分化的细胞一起使用。
重构的卵母细胞的形成、激活、培养和移植采用标准的微注射或电融合方法，将再编程的细胞插入或者融合到受体卵母细胞中(参见，例如美国专利4,994,384和5,945,577)。例如，在标准的细胞培养基中，在存在或缺乏蔗糖(例如2.5％蔗糖)时，将细胞放置到接近卵母细胞，而且也可以将细胞导入注射吸管中。然后吹吸该吸管几次以溶解细胞，从细胞核中取出胞质成分，然后将其注射到细胞核中。然后激活重构的卵母细胞、培养，并采用例如实施例11中所述的那些的标准方法移植到母体受体哺乳动物中，以生产克隆的哺乳动物。
实施例13采用染色质转移和链球菌溶血素O移植以更完全地进行细胞核再编程的证据如实施例8-10中所述，在传统核移植原核阶段的胚胎中发生不完全的细胞核重塑和再编程。该发现得到核纤层蛋白A/C在核移植原核胚的核被膜中装配以及过量NuMA免疫荧光标记的证实。采用实施例11中所述染色质转移方法和实施例12中所述的细胞透化处理和再编程方法(也称作SLOT)实现更完整的细胞核再编程。
特别地，与用传统的克隆方法生产的克隆胚胎相比，本发明的克隆方法生成的胚胎具有更加类似于体外受精胚胎的蛋白质表达模式。如实施例8-10所示，染色质转移的胚胎表达的核纤层蛋白A/C蛋白比传统核移植胚胎更少。核纤层蛋白A/C是核纤层蛋白中的体细胞特异成分，在分化细胞中自然表达，而不在胚胎中表达。由于所报导的核纤层蛋白与转录因子、染色质蛋白以及DNA之间的相互作用，可能核纤层蛋白A/C在传统的核移植胚胎中的表达促进特异于体细胞的蛋白质的表达，这些特异于体细胞的蛋白质对于胚胎发育来说是不期望的。因此，本发明的染色质转移胚胎表达的不期望的体细胞特异性蛋白可能比传统的核移植胚胎更少。可替代地，染色质转移胚胎具有NuMA的表达模式，NuMA是核基质的主要成分，参与转录的调控，染色质转移胚胎比传统核移植胚胎更类似于体外受精胚胎。该结果还表明，染色质转移的胚胎比传统的核移植胚胎更有效地被再编程。
对牛成纤维细胞核的体外核崩解的评价从有丝分裂的牛成纤维细胞制备的提取物始终支持约80％纯化的成纤维细胞核的输入的崩解(附图33)。来自中期II卵母细胞的提取物(即来自受精前的自然停滞在中期II卵母细胞的提取物)也成功地支持细胞核崩解(30分钟内崩解75％的细胞核)。
检测导入的间期细胞核(附图34A)、从在MS 15有丝分裂提取物中培养的细胞核中获得的染色质(附图34B)、从在卵母细胞提取物中培养的细胞核中获得的染色质(附图34C)中的如下标记的表达核纤层蛋白B受体(LBR)，其是内层核膜的整合蛋白(膜标记)；核纤层蛋白B，其是核纤层蛋白的遍在成分；核纤层蛋白A/C，它是仅存在于分化细胞而不存在于胚胎中的核纤层蛋白的体细胞特异性成分；NuMA，核基质的主要成分和DNA。体细胞胞质MS15和卵母细胞MS15提取物都引起核纤层蛋白B、核纤层蛋白A/C、LBR和NuMA溶解在约100％的所检测的染色质单位中(附图34B和34C)。如所预期的，如先前在有丝分裂的人细胞中所观察到的，AKAP95保持与染色体关联(Collas等，J.Cell Biol.1471167-1180，1999)。在实施例8的成熟前染色质浓缩阶段的牛核移植胚胎中也出现该结果。有丝分裂提取物和卵母细胞提取物在促进核被膜溶解方面似乎都与完整的卵母细胞一样有效，而与所用的方法，即传统的核移植、核注射(NI)或染色质转移无关(附图35)由染色质转移生产的原核胚与来自核移植体的原核以及核注射胚胎之间的比较为了生产染色质转移的胚胎，在成熟后约18-20小时使体外成熟的卵母细胞去核。将来自间期牛胎儿成纤维细胞的细胞核在MS 15有丝分裂提取物中培养，如本文所描述从牛胎儿细胞中制备该提取物。在发生核被膜崩解后和在染色质浓缩完成之前，从提取物中分离染色质。特别地，当与间期的染色体浓缩水平(视为0％浓缩)和有丝分裂的最大染色体浓缩水平(视为100％浓缩)比较约有50-60％的染色质被浓缩时，分离染色质。在该阶段，难以区分各个染色质中的单个染色体，并且染色质的边缘具有不规则的形状。将从有丝分裂提取物中分离的染色质与去核卵母细胞一起，置于具有2.5％蔗糖的TL HEPES微滴中。加入蔗糖来将后续注射操作对卵母细胞的破坏最小化。用具有Burleigh Piezo Drill的斜面微注射吸管(Fishers，NY)将染色质注射到卵母细胞中(在70V的振幅下以2Hz频率处理75微秒)。通常采用多个脉冲，例如2、3、4或5个脉冲，使得针头足以穿透卵母细胞来进行注射。在注射后，在连续稀释的含有蔗糖的TL HEPES中洗涤卵母细胞，以将渗透休克最小化。成熟后28-30小时(即在从卵巢中收集后在成熟培养基中放置28-30小时，同时在注入染色质后至少2小时)，将重构的卵母细胞以及用于孤雌生殖发育的对照用钙离子载体(5μM)激活4分钟(Cal Biochem，San Diego，CA)和在溶于ACM培养基(100mM NaCl、3mM KCl、0.27mM CaCl2、25mM NaHCO3、1mM乳酸钠、0.4mM丙酮酸盐、1mM L-谷氨酸盐、3mg/ml BSA(无脂肪酸)、1％BME氨基酸和1％MEM非必需氨基酸(Sigma))的10μg/ml放线菌酮和2.5μg/ml细胞松弛素D(Sigma)中如先前所述激活5小时(Liu等，Mol.Reprod.Dev.49298-307，1998)。激活后，洗涤卵子5次，在覆盖了0.3ml胚胎试验的矿物油(Sigma)的、含有小鼠成纤维细胞和0.5ml胚胎培养基的4孔组织培养平板中放置培养。将25-50枚胚胎放置到各个孔中，在38.5℃下在5％CO2气体环境下进行培养。如果需要，将钙(例如，约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3、3.5、5mM或更高浓度的CaCl2)添加到培养基中，维持约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或更多小时，以促进卵母细胞在注射后被再封闭。由于当用本文描述的标准方法将卵母细胞植入到受体哺乳动物中时，完整的细胞膜环绕卵母细胞，可能提高再封闭的卵母细胞的存活率。
如上述进行染色质转移胚胎那样，生成核注射胚胎，除了将未在提取物中培养的间期牛胎儿成纤维细胞核注射到卵母细胞中而不是染色质中外。采用实施例8中描述的传统方法生产核移植胚胎。
如所预期的那样核移植、核注射和染色质转移的原核重新装配核纤层蛋白B(附图36A，红色标记)和AKAP95(附图36B，红色标记)。核移植以及核注射原核也装配体细胞特异性成分核纤层蛋白A/C(附图36A，绿色标记)，与所报导的上述的核移植胚胎的结果一致。但是，染色质转移原核以及对照的孤雌生殖体的原核都不装配核纤层蛋白A/C(附图36A)。与大部分染色质转移或孤雌生殖体原核不同(附图36B，绿色标记)，核移植原核还含有NuMA(绿色标记)。如上所报导，一定比例的孤雌生殖体细胞核和染色质转移细胞核装配低水平的NuMA。
染色质转移后的细胞核体外分解，染色质转移产生在形态上类似于对照孤雌生殖体原核的原核。相反，核移植和核注射原核具有体细胞特异性成分(核纤层蛋白A/C和广泛的NuMA标记)。该结果表明，在传统核移植或核注射操作后发生不完全的细胞核重塑。如上所述，在核移植和核注射原核中检测到的核纤层蛋白A/C来源于在原核阶段重新转录的核纤层蛋白。由于核纤层蛋白以及可能的NuMA涉及转录调控和人类疾病，在常规核移植原核中持续存在核纤层蛋白A/C表示不适当的功能性再编程。本发明人断定，体外细胞核分解和染色质转移生产比传统核移植或核注射更正常的原核。
使用再编程染色质或透化处理的细胞作为供体来源的克隆效率如实施例12所描述，开发了一种被标记为“SLOT”的克隆方法，其包括用链球菌溶血素O诱导原代牛胎儿成纤维细胞的透化，将透化的细胞暴露于再编程培养基(例如有丝分裂提取物)中30分钟，可选择地用2mM钙培养再封闭成纤维细胞，用标准的细胞融合方法将染色质转移到卵母细胞中。
对于该克隆方法，将一瓶链球菌溶血素O(Sigma S-5265；25,000单位以存储粉末形式保存在4℃下)溶解在400μl水中，充分混合。将全部内容物转移到15ml的圆锥形管中，然后加入3.6ml的水，通过振荡混合。将10μl的等分试样以0.062U/μl的母液浓度在-20℃下冷冻。在室温下，将细胞(约100,000个)悬浮在100μl HBSS(Gibco BRL，产品目录号14170-120)中。这些细胞是汇合的，因此约80-85％细胞处于G1期，而大部分的其他细胞处于S期。加入链球菌溶血素O母液(5μl)(即，500ng/ml或者0.3U/μl的最终浓度)，在38℃水浴中温育混合物25分钟。在温育过程中，轻轻拍打试管2-3次以确保细胞仍处于悬浮状态。加入室温PBS(200μl)，通过柔和的吹打以充分混合。在室温下，在台式离心机中以5,000rpm离心细胞5分钟。弃去全部的上清液。在该阶段，沉淀较小，不能被清楚地看见。加入含有ATP生成体系的有丝分裂提取物(40μl“MS15”)，充分混合。在离心细胞的过程中，通过解冻1小瓶40μl提取物，并加入1.2μl ATP生成体系，充分混合，在室温下温育，来制备提取物。该有丝分裂提取物与在上述章节中用于生产染色质的提取物相同。在38℃的水浴中温育混合物30分钟，并且偶尔轻轻拍打试管。加入室温的再封闭培养基(RM，500μl)(添加了1M母液使CaCl2为2mM的完全α-MEM[Bio-Whittaker])。敞开试管，在CO2培养箱中温育2小时，偶尔拍打试管以确保细胞处于悬浮状态。在室温下，在台式离心机中以5,000rpm离心细胞5分钟。将细胞沉淀重悬在100μl室温下的TLHEPES(Bio-Whittaker，产品目录号04-616F)中，并再加入900μl TLHEPES。采用标准方法进行核移植，如前面有关染色质转移的章节所述，激活卵母细胞，并植入到受体哺乳动物体内。
采用这种SLOT方法以及本发明的染色质转移方法生产的胚胎的发育被总结在表7中。与传统的核移植胚胎相比，SLOT胚胎发育到囊胚阶段会稍微少一些。SLOT和核移植胚胎发育到囊胚阶段的差别可能是由于核移植时使用的处于细胞周期G1期的细胞的比例高于SLOT。染色质转移的胚胎的存活率较低，染色质转移被认为是一种侵入性方法。
对于核移植和SLOT胚胎来说在妊娠40天的妊娠率具有可比性(表9)。SLOT胚胎在妊娠40-60天的存活率往往高于用传统方法生产的核移植胚胎。
表9染色质转移核移植以及SLOT生产的牛胚胎克隆的发育情况
如上指出，可以通过在钙离子中培养重构的卵母细胞，使得卵母细胞在被植入到受体哺乳动物之前再封闭，来提高染色质转移胚胎的存活率。可以通过减少细胞从培养基中取出和与卵母细胞融合之间的时间量来提高SLOT胚胎的存活率。例如，可以减少在链球菌溶血素O中的培养、在再编程培养基中培养和/或在封闭培养基中培养的时间长度。特别地，在再封闭培养基中培养的时间可以减少为约1小时或更少。可以如上所述在存在2mM钙离子或者在存在更高浓度钙离子(例如，约-2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0或者6.0mM钙离子)时，缩短再封闭处理时间，来提高再封闭率。通过缩短在与卵母细胞融合之前的处理细胞的时间量，细胞进入S期并开始DNA复制的可能性更小，进入S期并开始DNA复制会降低了重构卵母细胞的存活率。
实施例14采用染色质转移进行更完全的细胞核再编程的证据如实施例11中所讨论的，开发一种策略来增强供体细胞核的重塑，促进体细胞基因的抑制，生产具有类似于受精合子的原核结构的胚胎。在该常规染色质转移方法的特定实施例中，将分离的完整牛成纤维细胞细胞核在含有ATP生成体系的有丝分裂牛成纤维细胞的细胞质提取物中培养，ATP生成体系用于驱动细胞核的装配。
为了生成用于将供体核转换为染色质的有丝分裂再编程提取物，用0.5μg/ml洛克达唑处理约18小时，将成纤维细胞同步化在有丝分裂期，通过有丝分裂期的抖落法来收获，并在冰冷的PBS中洗涤2次，在冰冷的细胞溶解缓冲液(20mM Hepes、pH8.2、5mM MgCl2、10mMEDTA、1mM DTT和蛋白酶抑制剂)(Collas等，J.Cell Biol.1471167-1179，1999)中洗涤1次。将压紧的细胞重悬在1体积细胞溶解缓冲液中，在冰上膨胀1小时，并且在冰上用大小合适的杵进行Dounce匀浆，直到细胞被溶解。在4℃下以15,000xg离心溶解产物15分钟，收集上清液(有丝分裂提取物)，等分并在液氮中迅速冷冻，存储在-80℃下。
为了生产供体染色质，收获未同步化的汇合的成纤维细胞，洗涤，重悬在约20体积的冰冷的低渗细胞核分离缓冲液(10mM Hepes、pH7.5、2mm MgCl2、25mM KCl、1mM DTT和蛋白酶抑制剂的混合物)(Collas等，J.Cell Biol.1471167-1179，1999)中。在冰上放置1小时后，用大小合适的杵对细胞进行Dounce匀浆。加入2M蔗糖母液使蔗糖浓度为250mM，在4℃下以400xg离心沉淀细胞核10分钟。在细胞核分离缓冲液(与上述相同的缓冲液，但是蔗糖浓度为250mM)中洗涤细胞核，并且立即使用或者冷冻在细胞核分离缓冲液/70％甘油中(Collas等，J.Cell Biol.1471167-1179，1999)。
为了再编程，在40μl含有ATP生成体系(1mM ATP，10mM磷酸肌酸和25μg/ml肌氨酸激酶)的有丝分裂提取物中培养分离的成纤维细胞细胞核，在38℃水浴中以4,000细胞核/μl培养30分钟。通过相差显微镜监控核被膜崩解和染色质浓缩。在培养末期，将反应化合物用500μl含有2.5％蔗糖的TL Hepes稀释，通过以2,000xg离心沉淀5分钟来收获染色质。将染色质重悬在TL Hepes/蔗糖中，与去核卵母细胞一起转移到矿物油下的TL Hepes/蔗糖中。用Burleigh Piezo Drill(Fishers，NY)(2Hz，2μs，70V)将单个染色质注射到体外成熟的卵母细胞中，卵母细胞已经用斜面的微注射吸管以20hpm去核。注射后，在溶于Hepes的蔗糖的连续稀释液中洗涤卵母细胞，使渗透休克最小化，并进行培养。如果用于NT，则以28hpm激活重构的卵母细胞和孤雌生殖对照，并培养((Kasinathan等，Nat.Biotechnol.191176-1178，2001和Kasinathan等，Biol.Reprod.641487-1493，2001)。对于核注射(NI)，将纯化的成纤维细胞细胞核暴露于细胞溶解缓冲液中，而不是在有丝分裂提取物中，如果用于CT，则将细胞核注射到去核的卵母细胞中。
由于再编程，核纤层蛋白A/C、核纤层蛋白B以及NuMA很容易分解，而AKAP95仍然与浓缩的染色体结合(附图42A)。TUNEL分析表明，提取物中未发生凋亡。用人Hela细胞核以及有丝分裂提取物进行类似的细胞核崩解试验，结果表明浓缩的染色质能够支持细胞核在间期细胞质中重构(Steen等，J.Cell Biol.1501251-1562，2000)和转录。因此，体外细胞核分解产生了能够再生功能性细胞核的浓缩染色质。通过沉淀回收浓缩的成纤维细胞的染色质，并将单个染色质注射到去核的受体卵母细胞中。在回收培养物后，如实施例9用于NT卵母细胞所述的方法那样激活卵母细胞。为了对通过细胞核操作生成的人为假象进行调控，还注射了仅暴露于提取物的完整细胞核。
CT和对照核注射(NI)的结果显示在附图42A-42D中。NI生产的原核，如NT原核，含有核纤层蛋白A/C和B、NuMA以及AKAP95(附图42B和42C)。CT导致在80％以上的在注射和激活中存活的胚胎形成PN(约为被注射卵母细胞的50％，n＞2,000)。但是，CT原核显示了不可检测的核纤层蛋白A/C，抗NuMA免疫标记比NT和NI原核降低了3倍(附图42B和42C)。该模式与孤雌生殖的原核相似。与NT原核相比，在CT原核中，使用Triton X-100/DNA酶I/NaCl提取如上所述的AKAP95和DNA的可能性提高了8倍，表明CT对原核AKAP95锚定和DNA酶I的可接近性的有益作用(附图42D)。由于结合AKAP95的染色质与原先转录抑制(低乙酰化的)的染色质一起共分离分馏，该结果表明CT增强在PN装配时形成常染色体。
在通过平行地实施的NT和CT方法进行成纤维细胞供体细胞核重塑的过程中，检测TATA结合蛋白TBP的动力学。实际上，对于所有基因，TBP促进一般转录机制的装配(Sharp等，Cell 68819-821，1992)。在供体成纤维细胞的细胞核中，TBP与AKAP95和DNA一起共定位(附图43A)。在NT后获得的PCC染色体含有比在有丝分裂提取物中浓缩的染色体高5倍的TBP，如TBP/AKAP95和TBP/DNA的荧光强度比所示的(附图43B)。在体外浓缩的染色体中的TPB标记强度与有丝分裂成纤维细胞中的相似。在PN阶段，在CT胚胎中几乎不能检测到TBP，但是在NT和NI胚胎中具有很强的免疫反应活性(附图43A)。NT胚胎中的原核TBP是体细胞来源的，因为对转录或翻译的抑制维持较强的TBP标记。已经证明，反应到间期时，小鼠中的原核TBP增加(Worrad等，Development 1202347-2357，1994)。但是，由PCC或者体外浓缩的染色体形成PN的动力学在重新构建的NT和CT胚胎中的相似性表明，在NT原核中的TBP浓度升高不是由于较高级别的细胞周期阶段而致。因此，供体细胞核的体外分解促进TBP从染色体上分离，使得生成的CT原核含有比相同重构阶段的NT原核低10倍的TBP。
因此，通过NT方法的不完全再编程的5个结构性和功能性的标记包括，核纤层蛋白A/C的原核装配、原核NuMA和TBP的浓度升高、AKAP95和DNA对用去垢剂、DNA酶和盐提取的敏感性降低。相反，B型核纤层蛋白对于正确的细胞核再形成以及细胞存活是关键的(Steen等，J.Cell Biol.153621-626，2001)，虽然不能够确定被装配的B型核纤层蛋白是体细胞来源(并因此被再打靶)的，还是母本来源的，B型核纤层蛋白似乎可以在NT原核中正常地装配。LA基因在NT原核中仍然具有活性，引起分化细胞特异的A型核纤层蛋白的装配。通过染色质与转录机制间的相互作用，细胞核核纤层蛋白被认为参与了转录调控(Cohen等，Trends Biochem.Sci.2641-47，2001)；因此，正确的一套核纤层蛋白的装配最可能对于在NT细胞中正确的原核功能是关键的。
在本发明的方法中，体细胞的细胞核成分分散在提取物中，并且通常不与卵母细胞的胞质接触。这防止了体细胞特异的分子对发育中的细胞核再打靶，体细胞特异分子如B型核纤层蛋白，其组成区别于母本核纤层蛋白的组成(Cohen等，Trends Biochem.Sci.2641-47，2001)。体外染色质浓缩还可能促进DNA结合因子例如染色质重塑酶(Sif等，Genes Devel.122842-2851，1998)和转录因子的释放，从而“剥离”供体的潜在抑制性体细胞成分的基因组。特别地，TBP去除可能会导致再生的CT原核中的体细胞特异性基因失活，并使受精后低的雄原核的转录活性加倍(Poccia等，Trends Biochem.Sci.17223-227，1992)。
从供体细胞核中去除因子意味着将便于母本成分加载到染色质上并且重塑到生理性的原核中。CT提高了AKAP95和DNA对核酸酶和盐的敏感度。DNA酶I抗性的DNA大部分是转录沉默的；因此，通过NT对AKAP95锚定的不完全重塑可能降低了发育上重要的基因的表达，例如与胎盘发育、后期妊娠维持和克隆动物出生后的存活力相关的基因。
CT卵母细胞的如下特征表明，在有丝分裂提取物中培养的染色质的核移植显著地改进了生成的再生卵母细胞的功能特征。在CT原核(在将染色质导入到卵母细胞中后形成的原核)中表达的由体细胞供体细胞高水平表达的核基质蛋白NuMA比NT原核中低3倍。该结果表明，CT卵母细胞中的NuMA含量与NT卵母细胞相比更类似于天然卵母细胞中的NuMA含量。CT原核还表达比NT原核低10倍的常用转录因子。通过在有丝分裂提取物中培养从供体染色质中如此去除的TBP可能会导致生成的CT卵母细胞中的不期望的、体细胞特异的基因被灭活。核纤层蛋白A/C是一种核被膜蛋白，特异于分化的细胞，未在体外受精的或者孤雌生殖激活的卵母细胞中被检测到，在CT原核中也检测不到该蛋白，但是可以在NT原核中检测到。由于核纤层蛋白可能调节转录，CT原核中缺乏可检测的核纤层蛋白A/C可能会在CT卵母细胞中产生比在NT卵母细胞中更恰当的对转录的调节。核基质染色质界面的结构性蛋白AKAP95在转录抑制(低乙酰化)的染色质中富集，在原核中测定AKAP95和DNA对用去垢剂、DNA酶和盐提取的敏感度，以表征AKAP95对DNA的锚定和表征原核中的DNA的可接近性。与NT原核相比，CT原核中的可提取性提高了8倍，表明了在有丝分裂提取物中培养供体染色质对AKAP95锚定以及供体DNA形态重塑的有益作用。由于AKAP95和DNA酶I抗性DNA与转录抑制的或者沉默的DNA相关，AKAP95和DNA对核酸酶、盐和去垢剂的敏感度升高，表明CT卵母细胞可能增加表达发育上重要的基因的表达。
预期对于来自在朊病毒基因中有一个或多个突变的细胞的供体细胞核可获得类似的结果。
实施例15用链球菌溶血素O转移来实现更完全的细胞核再编程的证据使用SLOT在有丝分裂提取物中培养被透化处理的细胞的过程中，染色质再编程也被示于附图45A和45B中。在该试验中，在用SLOT生产的卵母细胞和用未在提取物(“NT”)中培养过的细胞核通过传统核移植方法生产的卵母细胞中，比较在体细胞供体细胞中高水平表达的核基质蛋白NuMA的表达以及特异于分化细胞的核被膜蛋白核纤层蛋白A/C的表达。激活后14个小时，SLOT原核(即在将含有染色质的供体细胞导入到卵母细胞中后形成的原核)表达的NuMA和核纤层蛋白A/C显著地比NT原核少(n＝15-20胚胎/标记，3个重复)。这些结果表明，再生的SLOT卵母细胞比NT卵母细胞更加有效地被再编程，并且更类似于天然的受精的卵母细胞。由于核纤层蛋白可能会调节转录，在SLOT原核中显著较低含量的核纤层蛋白A/C可能会在SLOT卵母细胞中产生比在NT卵母细胞中更加合适的对转录的调控。
除了在生成的卵母细胞中减少不期望因子的表达外，与传统的核移植方法相比，SLOT提高了生成的胎儿的发育能力(表10)。因此，许多SLOT供体细胞中的结构性和功能性的差别实质上提高了再生的卵母细胞形成非人胚胎和非人哺乳动物的能力。
表10用具有染色质的透化的供体细胞生产的牛胚胎(“SLOT”)的发育与用具有细胞核的供体细胞生产的牛胚胎(“NT”)的发育比较
实施例16采用链球菌溶血素O转移(SLOT)进行更加完全的细胞核再编程的示例性的证据如在实施例12和15中所述，开发出了一种新的体外核重塑体系。该体系包括透化处理供体细胞、在有丝分裂细胞提取物中诱导染色质浓缩、洗涤透化处理的细胞以去除在染色质浓缩过程中溶解的细胞核因子。与类似于体细胞的核移植胚胎相反，牛染色质转移胚胎的原核具有的几种标记的表达模式接近于正常胚胎的表达模式。用这种染色质转移体系生产了8头健康的小牛。染色质转移具有将存活延长到足月、低的大胎儿发生率以及显著提高出生后存活率的趋势。该结果表明在移植前成功地对体细胞供体细胞核进行操作。如下文中的进一步描述，体细胞核在有丝分裂提取物中分解，接着将浓缩的染色质转移到卵母细胞中，提高了细胞核重塑，显示出提高了克隆的发育能力和生活力。如果需要，该方法可以被用于进一步表征细胞核再编程的机制。
染色质转移策略为了消除在原核NT胚胎中确定的缺陷，在将成纤维细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，对其进行体外操作。附图48中概述了SLOT体系。为了生产有丝分裂提取物，用1μg/ml洛克达唑处理成纤维细胞18小时，将其同步化在有丝分裂期，通过有丝分裂的抖落方来收获细胞，在磷酸缓冲的生理盐水中洗涤2次，在细胞溶解缓冲液(20mMHepes，pH 8.2、5mM MgCl2、10mM EDTA、1mM DTT和蛋白酶抑制剂)中洗涤1次。将被沉淀的细胞重悬在1体积冰冷的细胞溶解缓冲液中，以在冰上膨胀1小时，用大小合适的玻璃杵进行Dounce匀浆。在4℃下以15,000xg离心溶解产物15分钟，等分上清液(有丝分裂提取物)，在液氮中冷冻，并存储在-80℃下。使用新鲜的或冷冻的提取物，在细胞核崩解效率方面没有显著差别。
在无Ca2+/Mg2+的Hank氏平衡盐溶液(HBSS)中洗涤来自汇合培养物的牛胎儿成纤维细胞，通过在约38.5℃水浴中，在溶于100μl HBSS的31.2U链球菌溶血素O(SLO；Sigma)悬浮液中培养100,000个细胞来进行透化。通过不透过细胞膜的DNA染料碘化丙啶(0.1μg/ml)的摄取来评价透化处理。沉淀被透化处理的成纤维细胞，洗涤，在约38.5℃下，在40μl含有ATP生产体系(1mM ATP、10mM磷酸肌酸和25μg/ml肌氨酸激酶)的有丝分裂提取物中培养30-45分钟，促进细胞核分解和去除细胞核成分。用0.1μg/ml Hoechst 33342标记等分试样以监控染色质的浓缩。培养后，通过沉淀从提取物中回收成纤维细胞，并洗涤。用500μl含有2mM CaCl2的αMEM/10％胎牛血清(Gibco-BRL)稀释反应混合物，以再封闭膜，在38.5℃下培养细胞2小时(Hakelien等，Nat.Biotechnol.20460-466，2002)。通过碘化丙锭的摄取来监控再封闭。被再封闭的细胞与体外成熟的卵母细胞融合，该卵母细胞已经以20hpm去核；以28hpm激活卵母细胞，如实施例10针对NT所述的那样培养胚胎。
在体外将SLOT胚胎培养到囊胚阶段，给每头受体雌性动物移植2枚胚胎。通过超声波检查方法监控妊娠，进行C-断层扫描。在出生后的24小时内，由兽医对小牛进行评分。
成纤维细胞的细胞核在有丝分裂提取物中的崩解有丝分裂提取物由来自有丝分裂牛成纤维细胞的溶解产物的15,000xg离心的上清液组成，含有ATP生成体系。该提取物不会诱导凋亡，通过不存在多聚(ADP)核糖基聚合酶(PARP)的蛋白质水解作用以及凋亡成纤维细胞的DNA断裂特征来判断(附图49A)。因此，该提取物适合于促进体细胞核的重塑。
该提取物诱发ATP依赖的染色体浓缩、来自染色质的A/C和B型核纤层蛋白的分解以及从染色质上去除TBP(附图49B)，A/C和B型核纤层蛋白的分解通过这些核纤层蛋白的胞质标记来判断。在从有丝分裂提取物中回收后，对来自成纤维细胞的纯化的浓缩染色质进行的免疫印迹分析，证实了这些事件(附图49C；比较泳道1和3)。在该试验中，A激酶锚定蛋白AKAP95被用作仍然与浓缩染色体相关的细胞核成分的标记，这通常发生在有丝分裂期(Collas等，J.Cell Biol.1471167-1180，1999)。组蛋白H4被用作凝胶中的蛋白质加载对照(附图49C)。来自染色质的核纤层蛋白和TBP的分解依赖于ATP再生系统(附图49B和49C，泳道3和4)，如在有丝分裂细胞中发生的那样(附图49C，泳道2)。此外，对暴露于有丝分裂提取物中后的完全被透化的成纤维细胞(相对于分离的染色质)进行免疫印迹分析，结果表明，一部分溶解的核纤层蛋白A/C和所有可检测的TBP从细胞中被消除和/或被蛋白酶解(附图49C，泳道6)。最后，都含有ATP再生体系的来自间期成纤维细胞的对照提取物(附图49C，泳道5)或者单纯的细胞溶解缓冲液，都不能促进细胞核分解，表明细胞核崩解是ATP依赖的，并且特异于有丝分裂提取物。被暴露于有丝分裂提取物并且用CaCl2再封闭的透化的成纤维细胞能够被培养数代，表明在膜透化处理、在提取物中培养被透化处理的细胞以及膜再封闭都是可行的方法。
在通过染色质转移生产的胚胎中的细胞核的表征再封闭的成纤维细胞与受体卵母细胞的融合以与未被透化处理的细胞一样的效率(超过70％)发生。在导入到卵母细胞时，供体染色质是未浓缩形式(附图50A，SLOT)。相反，用于NT的成纤维细胞的染色质在融合后的30分钟内仍然是解聚的(附图50A，NT)。因此，在转移到卵母细胞之前，用CaCl2再封闭经有丝分裂提取物处理的成纤维细胞，不会在供体细胞中促进细胞核再生。通过免疫荧光分析核纤层(lamina)和内层细胞膜蛋白质判断，在融合后立即在SLOT胚胎的浓缩染色质周围缺乏核被膜支持了该观察结果。
免疫标记在SLOT和NT胚胎的细胞核中的核纤层蛋白和TBP，以及这些标记相对于DNA荧光强度的免疫标记强度示于附图50B和50C中。核周的核纤层蛋白B标记强度与在SLOT和NT原核中的类似。但是，显著地与NT原核不同，在原核和到至少8-16细胞阶段，在SLOT胚胎中检测不到核纤层蛋白A/C(附图50B)。与NT原核相比，SLOT原核还显示出TBP标记下降4倍(附图50C)。已经证明，在发育到间期的过程中，小鼠中原核TBP的浓度升高(Worrad等，Development 1202347-2357，1994)。但是，由于由PCC或体外浓缩的染色质形成原核的动力学与在NT和SLOT胚胎中的类似，虽然不是确定地排除，但是在NT原核中TBP浓度升高不可能是由于处于更高阶段的细胞周期。TBP对用1％Triton X-100、1mg/ml DNA酶I和0.3M NaCl提取的抗性降低了2倍以上(附图50D)，表明TBP与细胞内的配基结合不牢固。同样地，在SLOT原核中，DNA对DNA酶I的抗性降低了将近4倍，表明SLOT有利于在原核中建立较为松散的染色质结构(附图50D)。因此，成纤维细胞的细胞核在有丝分裂提取物中分解，接着将浓缩的染色质转移到卵母细胞中，增强了供体细胞核的形态重塑，消除在NT胚胎的原核中检测到的缺陷。
染色质转移生产健康克隆SLOT使得克隆胚胎发育到足月(附图51A和51B)。在将囊胚移植到受体雌性中后，SLOT胚胎的40天的妊娠率显著地高于NT胚胎(P＝0.02；Fisher′s Test)，并且该趋势持续到发育到足月(分别地，出生小牛为12/59和23/211；P＝0.05)(附图51A)。此外，SLOT提高克隆在出生24小时后的存活率(分别为10/59和17/211；P＝0.04)(附图51A和51B)。
通过以1分(正常)到5分(极其异常)对动物和胎盘进行评分，来评价出生的NT(实施例10)和SLOT克隆的健康状况。胎盘分值包括参数，例如胎盘水肿、子叶数、大小和形态、羊水颜色、子宫形态以及脐带。动物分值包括功能评价和呼吸的、心血管的、消化的、尿路的、肌肉的、骨骼的和神经系统的一般表现。各头小牛的数据示于附图51C中。箱式图分析表明，来源于NT的动物和胎盘的分值比由SLOT生产的动物和胎盘的那些分值更加分散(附图51E)。SLOT和NT克隆的平均出生重量不具有显著性差别；但是，出生超过45kg的SLOT小牛的比例低于NT动物(P＝0.02；Fisher)(附图51D和51E)。总之，这些结果表明，染色质转移生产了活的后代，显示了发育能力和生存能力提高的证据。
与NT(实施例10)比较，尽管生产的SLOT后代的数量有限(n＝8)，SLOT显著地提高40天时的妊娠率(P＝0.02)和出生24小时后的存活率(P＝0.04)。在箱式图分析中也反映出了通过SLOT生产的动物的健康状况改进的趋势。此外，由SLOT生产的大胎儿(超过45kg)的情况较少，这在动物经营管理中具有实际和经济的应用价值。
在NT胚胎中已经鉴定了多个细胞核缺陷，包括核纤层蛋白A/C装配、原核TBP含量升高以及DNA对DNA酶I的抗性升高。这些缺陷可能是由于成纤维细胞的细胞核的不完全重塑或者由对分化细胞特异的(例如，核纤层蛋白A)基因的表达的错误调控产生。体外细胞核重塑以及浓缩的染色质转移到卵母细胞中消除了这些缺陷。
通过SLOT重塑细胞核提高了DNA对DNA酶I的敏感度，并且可能会促进转录活性(或者潜在活性)的染色质的形成。这些结果可能反过来有利于发育上重要的基因的表达。例如与胎盘发育、后期妊娠维持和与出生后的存活相关的基因。SLOT还引起对克隆胚胎中的核纤层蛋白A基因表达的抑制。对细胞核纤层组成的体外和体内操作已经证明，不能装配正确的一套核纤层蛋白必将导致凋亡(Steen等，J.Cell Biol.153621-626，2001)。而且，由于核纤层蛋白与DNA、染色质以及转录机制相互作用，在克隆的胚胎中，正确的核纤层重建对于正常的细胞核功能可能是关键的(Gruenbaum等，J.Struct.Biol.129313-323，2000和Cohen等，Trends Biochem.Sci.2641-47，2001)。
在有丝分裂期间或者在体外的染色质浓缩与结合DNA的成分的释放相关，结合DNA的成分例如是染色质重塑酶、转录因子(例如TBP)或者其他潜在的抑制性体细胞成分。从供体体细胞染色质上去除TBP可能将在SLOT胚胎中促进对体细胞特异的基因的抑制或下调，这可能降低发育能力。从供体细胞核中去除因子意味着，将方便母本成分加载到染色质上，随后重塑到生理性原核中。
总之，可能在细胞提取物中直接重塑体细胞核，并生产活的后代。对于任选的对细胞核再编程机制的进一步研究来说，用于克隆或者转分化目的对细胞核的体外操作是一种有用的工具(Landsverk等，EMBO Rep.3384-389，2002和H kelien等，Nat.Biotechnol.20460-466，2002)。染色质转移显示了增强发育到足月和提高克隆生存能力的证据。对该系统的额外操作可能会进一步提高哺乳动物克隆的效率。
实施例17采用链球菌溶血素O转移(SLOT)进行更加完全的细胞核再编程的其他证据当在遗传转移之前供体被透化处理的细胞未被再封闭时，实施例12中所述的SLOT方法得到了改进的结果。此外，使用G1期的供体细胞替代汇合细胞可能会增强重构的卵母细胞和生成的胚胎的生存能力。这些试验将在下文中作进一步描述。
缓冲液的制备通过将1ml水置于微量离心管中，加入154mg冷却的DTT，通过旋转充分混合，来制备1摩尔的DTT溶液。将溶液等分到10个1体积中，在-20℃下冷冻。等分试样可以被解冻冷冻数次。用于制备用于细胞核装配/分解分析的100ml体积的细胞溶解缓冲液含有NaCl(50mM，1ml 5M母液)、MgCl2(5mM，0.5ml 1M母液)、Hepes，pH8.2(20mM，2ml 1M母液，pH8.2)和水(96.5ml)。等分缓冲液并在4℃下存储。在制备溶解产物时，pH下降约1。对于有丝分裂提取物的制备，加入10mM EGTA(1ml 1M母液)，加入95.5ml水，而不是96.5ml。使用前，加入如下物质DTT(1μl/ml溶液，保存在-20℃下的1M母液，1mM最终浓度)、PMSF(10μl/ml溶液100mM母液，1mM最终浓度)、CAL混合物(在-20℃下每毫升溶液中含10μl CAL混合物，即最终浓度为10μg/ml的各个抑凝乳蛋白酶抑制剂、抑酶肽和抑亮酶肽)、抑肽素A(-20℃下每毫升溶液中10μl母液，10μg/ml的最终浓度)和细胞松弛素D(来自-20℃下的1mg/ml母液的1μl/ml，1μg/ml的最终浓度)。对于洛克达唑1000X母液溶液，在DMSO中制备1mg/ml的洛克达唑，并以160μl的等分试样存储。
为了制备链球菌溶血素O母液(SLO)，将一瓶SLO(Sigma S-5265；25,000单位以粉末形式存储在4℃下)溶解在400μl水中，充分混合。将所有内容物转移到1.5ml圆锥形管中，分成10μl的等分试样，冷冻在-20℃下。母液浓度为“1OX”。为了制备蛋白酶溶液，将3ml TLHepes和9mg蛋白酶(Sigma P-8811)添加到1.5ml圆锥形管中，通过旋转混合。通过0.22μm注射器滤器将该溶液直接过滤到TL Hepes中。由于细胞使体积加倍，最终浓度为1.5mg/ml。对于HECM Hepes，组合了NaCl(114mM，6.662g)，KCl(3.2mM，0.239g)，CaCl22H2O(2.0mM，0.294g)，MgCl26H2O(0.5mM，0.102g)，Pen/Strep(10ml，Sigma P3539Pen/Strep，100U/ml和100μg/ml的最终浓度)，酚红(5μg/ml，1ml)和水(足以将总体积加大到990ml的含量)。然后，加入100X A.A.(10ml)，乳酸钠(10mM，1.44ml)，丙酮酸钠(0.1mM，0.011g)，NaHCO3(2mM，0.168g)和HEPES(10mM，2.38g)。最终溶液具有260-270mOsM的渗透摩尔浓度。然后加入3g牛血清白蛋白(馏分V)，并将pH调节为7.4。通过0.22μM滤器来过滤溶液，并存储在4℃下。
对于ATP母液溶液(Sigma A3377100mM母液，100x)的制备，组合水(1ml)和ATP(0.055g)，并在-20℃下冷冻10μl等分试样。对于磷酸肌酸(Sigma P79361M母液，100x)的制备，组合水(1ml)和磷酸肌酸(0.255g)，并在-20℃下冷冻10μl等分试样。为了制备肌氨酸激酶(Sigma C37552.5mg/ml母液，100x)，组合水(1ml)和肌氨酸激酶(0.0025g)，在-20℃下冷冻10μl等分试样。对于ATP生成体的制备，用水制备等比例的100mM ATP母液、1M磷酸肌酸和2.5mg/ml肌氨酸激酶母液(100x)，混合，并作为冷冻溶液存储。将ATP生成体系保持在冰上直到使用。将ATP生成体系(1.2μl)添加到提取物中(40μl)，旋转混合该溶液。ATP生成体系在提取物中的最终浓度为1mM ATP、10mM磷酸肌酸和25μg/ml肌氨酸激酶。
有丝分裂提取物的制备解冻一瓶1.5-2百万个细胞。将细胞分到两个T75烧瓶中，生长两天或者直到它们汇合。细胞在6-8个T75烧瓶中传代，生长到汇合。细胞被胰蛋白酶化，并用血球计计数，将3百万个细胞加入到每个T150烧瓶中，将尽可能多的T150烧瓶与可获得的细胞数量一起使用。用标准方法(例如，Collas等，J.Cell Biol.1471167-1180，1999及其中的参考文献)，用0.5-1μg/ml洛克达唑同步化细胞系(例如，成纤维细胞例如原代成纤维细胞，上皮细胞或者无限生殖和无病的细胞例如MDBK细胞)17-20小时，70-80％汇合在有丝分裂期。通过有丝分裂期的抖落，收获被同步化的细胞。用一只手重复拍打来猛烈地摇晃各个含有细胞的烧瓶。有丝分裂细胞脱离并漂浮在培养液中。在4℃下，将所收获的细胞在50ml的圆锥形管中以500xg离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬在总共50ml的冷的无Ca/Mg的磷酸缓冲的生理盐水中(PBS)。如果需要，可以将多个细胞沉淀汇集到一个50ml的试管中。在4℃下，以500xg离心细胞10分钟，并重复上述洗涤步骤。确定细胞沉淀的体积，将细胞沉淀重悬在约20体积的含有蛋白酶抑制剂(即DTT和PMSF)的冰冷的细胞溶解缓冲液中。
然后，在4℃下以500xg离心5分钟来沉淀细胞。弃去上清液，确定细胞沉淀的体积。将细胞沉淀重悬在不超过1体积的含有所有蛋白酶抑制剂的细胞溶解缓冲液中。将细胞在冰上培养1小时，使细胞膨胀。使用尖端超声波仪，对细胞悬浮液进行超声波处理，直到所有的细胞破裂。在相差显微镜下监控细胞溶解。期望地，在进行下一个步骤之前，90％的细胞被溶解。超声波处理可以被延长到所需的长度；超声波处理时间将随着用于制备提取物的细胞类型而改变。可替代地，用玻璃研钵和杵(匀浆机)进行Dounce匀浆来溶解细胞，期望地，直到至少90％的细胞被溶解。将细胞溶解产物置于1.5ml离心管中，并在4℃下，用台式冷冻离心机以-15,000xg离心15分钟。将离心机置于冷的腔室内或冰箱中，进行平衡。从冰箱中取出试管，并立即放置在冰上。用200μl移液管尖头小心收集上清液。该上清液是有丝分裂胞质提取物。将提取物放置在冰上的另一个试管中。将从多个试管中收集的提取物汇集在一起。
在该阶段存在两种可替代的选择。将细胞提取物等分到冰上的试管中，每管41μl。立即在液氮中迅速冷冻提取物，并存储在-80℃的冷冻仪中直到使用。这种从15,000xg离心制备的提取物被称作MS15(或者有丝分裂胞质提取物)。可替代地，将MS15提取物置于冰上的超速离心试管中(例如适合于SW55 Ti转子；Beckman)。如果需要防止超速离心时试管被压碎，则用矿物油覆盖试管直到顶端。在4℃下，以200,000xg离心提取物3小时，以沉淀MS15中含有的膜囊。在离心末期，弃去矿物油。小心地收集上清液，并置于冰上的冷的1.5ml试管中。如果需要，使用多种上清液。这种上清液被称作MS200(或者有丝分裂胞质的提取物)。等分MS200提取物，并如用于MS15提取物所述的那样进行冷冻。
染色质转移在克隆操作的前一天，制备一个含有100万个成纤维细胞的35mmNunc或者6个含有500,000细胞的T75烧瓶，用于抖落。在克隆操作的早晨，将所有烧瓶中的含有15％被照射的FBS的αMEM完全培养基更换，以去除细胞碎片和死亡细胞。在进行细胞透化处理和有丝分裂提取物反应之前，通过连续稀释SLO母液(例如，1X，0.5X，0.3X和0.1X稀释)，来确定用于透化80-90％细胞所需的最低SLO浓度，在约38.5℃的水浴中培养30分钟，然后用碘化丙锭进行染色。
用胰蛋白酶或细胞分离缓冲液将细胞从汇合培养物或者新转染的细胞培养物中分离，放置到15ml圆锥形管中，用无Ca/Mg的Hank氏平衡盐溶液(HBSS)通过离心洗涤1次。将细胞重悬在1ml HBSS中，对细胞进行计数以确定浓度。在室温下，将约50,000-100,000个细胞悬浮在100μl HBSS(Gibco BRL，cat.No.14170-120)中。加入先前确定浓度的5μl SLO母液。在约38.5℃水浴中培养混合物30分钟。在培养过程中轻轻拍打试管2-3次，以确保细胞仍处于悬浮状态。加入200μl体积的室温PBS(无Ca/Mg)，通过轻轻吹打来充分混合。在室温下，在台式离心机中，以500xg离心细胞5分钟。弃去全部上清液。沉淀很小，不能被清楚地看见。
加入40μl体积的含有ATP生成体系的有丝分裂提取物，充分混合该溶液。在上述30分钟的培养过程中，制备提取物。解冻一瓶40μl提取物，添加到1.2μl的ATP生成体系中。充分混合溶液，放置在室温下。在38.5℃水浴中培养混合物30分钟，偶尔轻轻拍打试管。加入500μl体积的室温完全培养基(αMEM+15％胎牛血清)，开盖存储在38.5℃的培养箱中直到使用。在室温下，在台式离心机中以500xg离心细胞5分钟。将细胞沉淀重悬在1ml室温TL Hepes中，并转移到15ml圆锥形管中。加入1ml体积的溶于TL Hepes的3mg/ml蛋白酶(过滤)，使得相对于细胞的最终蛋白酶浓度为1.5mg/ml，培养混合物30秒钟。加入TL Hepes以充满15ml圆锥形管，盖紧试管并以2300rpm离心5分钟。从细胞中去除TL Hepes，并将150μl TL Hepes加入到细胞中。根据适当的细胞系标记试管，放置在加热台上。
在制备细胞的期间，采用适当大小的细胞移植吸管来制备用于细胞移植的操作台。将约50个去核的卵母细胞置于100mm培养皿中的重矿物油下的50μl的TL Hepes液滴中。将洗涤后的细胞置于具有去核的卵母细胞的液滴中。将足够多的细胞用于遗传转移到所有卵母细胞中。小心地避免使用过多的细胞，使得它们在空间上阻塞了操作工具。将一个去核的卵母细胞置于固定器上，将一个细胞置于透明带下的卵周隙中，使得该细胞接触卵母细胞的质膜。为了便于融合，将细胞放置在接近于极体或者与极体相对。在所有去核的卵母细胞含有转移来的细胞后，从微滴中取出卵母细胞，放置到用于融合的预热的35mm培养皿中的HECM Hepes中。
结果比较下面的表12中供体细胞的结果与表11中供体细胞的结果，表12中的供体细胞的细胞膜在遗传转移之前未被再封闭，而表11中的供体细胞的细胞膜在遗传转移之前被再封闭，结果表明，不再封闭被透化处理的细胞膜可以提高克隆效率。此外，表12的用G1期的供体细胞替代汇合细胞会提高重构的卵母细胞和生成的胚胎的生存能力。表11中的数据用来自牛原代成纤维细胞和供体牛胎儿的成纤维细胞的提取物来获得。MDBK细胞也被成功用于生产再编程提取物。
表11使用HAC细胞系的胚胎发育具有再封闭供体细胞的NT与SLOT相比
表12使用ΔHAC和ΔΔHAC细胞系的胚胎的发育无再封闭供体细胞的汇合供体细胞(CTC)与G1期供体细胞(CTD)相比
实施例18用于生产嵌合哺乳动物的方法一般认为，许多在采用传统方法来克隆哺乳动物的过程中发生的自然流产是由于胎盘畸形而产生的，而不是胎儿的问题。因此，用主要来自一个来源(例如体外受精的、天然的或者孤雌生殖激活的胚胎)的胎盘组织与主要来自另一个来源(例如，编码异种抗体的核移植胚胎)的胎儿组织生产嵌合胚胎的方法已经被开发出来。具有主要从体外受精的、天然的或者孤雌生殖激活胚胎的细胞获得的胎盘组织的嵌合胚胎更类似于天然的胎盘组织，并且生产更多可存活的后代。优选地，后代细胞的大部分来源于来自核移植胚胎的细胞，从而具有实质上与用于生产核移植胚胎的供体细胞相同的基因组。
在一种这种方法中，来自体外受精胚胎的细胞被注射到编码异种抗体的致密胚胎的外围(例如在透明带和胚胎本身之间)，该胚胎用传统核移植方法或者在此描述的其他克隆方法中的任何一种进行生产。在一种可替代的方法中，在来自各个胚胎的细胞相互识别以生产单一的嵌合胚胎的条件下，将来自致密前的体外受精胚胎的细胞与来自编码异种抗体的致密胚胎的细胞一起培养，该致密胚胎用本发明的克隆方法之一生产(例如，采用再编程的染色质或被透化处理的细胞作为供体来源)(Wells和Powell，Cloning 29-22，2000)。在这两种方法中，来自体外受精胚胎的细胞优选被结合到胎盘中，而来自核移植方法的细胞优选被结合到胎儿组织中。这些方法将在下文被进一步描述。使用不含异种抗体基因的核移植胚胎，获得这些结果；但是，含有异种抗体基因的和/或在朊病毒基因中含有突变的核移植胚胎也有望获得类似的结果。
G1期成纤维细胞的分离对于作为供体来生产核移植胚胎的G1期成纤维细胞的分离，使用先前描述的“抖落”方法(Kasinathan等，Nature biotech.191176-1178，2001)。简而言之，在分离前的24小时，将5.0×105个细胞置于含有10ml添加了FCS的α-MEM的100mm组织培养板上。第二天，用PBS洗涤该板，在分离前的1-2小时更换培养基。然后在Vortex-Genie 2(Fisher Scientific，Houston，TX，中速)上振荡平板30-60秒钟。去除培养基，以500xg离心5分钟，将沉淀重悬在250μl的添加了FCS的MEM中。该细胞悬浮液由通过胞质桥连接的新分裂的细胞双联体、部分单细胞和中期或后期的细胞组成。通过胞质桥连接的细胞双联体被用作核移植的供体细胞。
核移植、激活和胚胎培养基本上按照先前的描述，用分离的G1期成纤维细胞进行核移植(Cibelli等，Nature Biotech.16642-646，1998；Kasinathan等，Biol.Reprod.641487-1493，2000)。在成熟后约18-20小时，将体外成熟的卵母细胞去核，在UV光下通过双苯甲亚胺(Hoechst 33342，Sigma)标记来证实染色体被去除。采用单个2.4kV/cm的脉冲处理20微秒(Electrocell manipulator 200，Genetronics，San Diego，CA)，来融合这些胞质-供体细胞双联体。如先前所述，在成熟后30小时，将重构的卵母细胞和对照用钙离子载体(5μM)(Cal Biochem，San Diego，CA)激活4分钟和用溶解在ACM培养基(100mM NaCl、3mM KCl、0.27Mm CaCl2、25mM NaHCO3、1mM乳酸钠、0.4mM丙酮酸、1mML-谷氨酸盐、3mg/ml BSA(不含脂肪酸)1％BME氨基酸和1％MEM非必需氨基酸；都购自Sigma)中的10μg放线菌酮和2.5μg细胞松弛素D(Sigma)激活6小时(Liu等，Mol.Reprod.Dev.49298-307，1998；Presicce等，Mol.Reprod.Dev.38380-385，1994)。激活后，在HEPES缓冲仓鼠胚胎培养基(HECM-HEPES、114mM NaCl、3.2mM KCl、2mM CaCl2、10mM乳酸钠、0.1mM丙酮酸钠、2mM NaHCO3、10mMHEPES和1％BME氨基酸；Sigma)中洗涤卵子5次，并置于含有小鼠胎儿成纤维细胞和0.5ml胚胎培养基的4-孔组织培养板中培养，培养基上覆盖0.2ml经过胚胎试验的矿物油(Sigma)。每个孔中放置25-50枚胚胎，于38.5℃下，在5％CO2的气体环境中培养。在第4天，往培养基中加入10％FCS。在第7和8天，记录发育到囊胚阶段的发育情况。
牛体外受精如较早之前描述的用于生产牛体外受精胚胎那样实施体外受精(Collas等，Mol. Reprod.Dev.34224-231，1993)。用精液TL母液制备45％和90％等渗Percoll梯度(Parrish等，Theriogenology 24537-549，1985)。将来自一头公牛的冷冻-解冻牛精液加到梯度的顶层，以700xg离心30分钟(2000rpm，使用6.37英寸的端头半径)。确定沉淀中的精子密度，在精液TL(精液TL母液、1mM丙酮酸盐、6mg/ml BSA和1％PS)中稀释精子，使得受精时的最终浓度为106精子/ml。成熟后22小时，在TL HEPES中洗涤卵母细胞3次，置于Nunc孔中的480μl受精TL(Bavister等，Biol.Reprod.28235-247，1983)中，其中含有6mg/ml BSA、0.2mM丙酮酸盐、20μM青霉胺、10μM亚牛磺酸、1mM肾上腺素(Leibfried等，J.Reprod.Fertil.6687-93，1982)以及0.004μg/ml肝素。加入20μl精液以产生106精子/ml对50个卵母细胞的最终浓度。培养条件与上述用于核移植的条件相同。根据原核发育而得的受精率超过90％。
嵌合核移植胚胎在受精后约96小时，在致密前，收获8-细胞阶段的体外受精胚胎(6-12个卵裂球)。用蛋白酶(3mg/ml溶于TL-HEPES)去除透明带。用解剖显微镜仔细监控透明带的溶解。当透明带开始出现溶解时(约2分钟)，取出胚胎并在TL-HEPES中洗涤，转移到含有Hank氏平衡溶液的30mm培养皿中，在37.5℃下培养30分钟。将来自这些致密前胚胎的卵裂球转移到100mm培养皿中的矿物油下的TL-HEPES微滴(50μl)中。在第4天，选择8-16细胞阶段的核移植胚胎，转移到含有卵裂球的同一微滴中。这些核移植胚胎包括致密前的胚胎(例如，8细胞阶段的胚胎)和致密胚胎(例如，16细胞阶段的胚胎)。然后，采用标准的显微操作技术，用斜面微管(35μm直径)将4-6个卵裂球转移到核移植胚胎中。在转移卵裂球后，如用于核移植胚胎的方法所述的那样培养胚胎。
在第7和8天，对嵌合胚胎向囊胚阶段的发育进行评价。还分析囊胚中是否存在细胞膜染料DiI，在来自体外受精胚胎的细胞被注射到核移植胚胎之前，往该细胞中加入染料DiI。在第4天标记细胞，并在第7天进行观察。该染料在最初被染色的细胞的后代的少数细胞分化中被保持，使得可以在少数细胞分化后分析嵌合胚胎。基于该分析，来自体外受精胚胎的细胞被结合到嵌合胚胎中。如果需要，可以采用标准方法，用特异于体外受精胚胎或者核移植胚胎的核酸的探针进行荧光原位杂交(FISH)(参见，例如，Ausubel等，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley&Sons，纽约，14.7.1-14.7.12，1995)。这种FISH分析可以被用于确定来源于各种胚胎的细胞在体外培养的嵌合胚胎(例如，确定多少比例细胞被结合到内细胞团中，和多少比例的细胞被结合到滋养层中)、胎儿或者由该胚胎生产的后代中的分布情况。可替代地，可以将报导基因如绿色荧光蛋白添加到来自胚胎之一的细胞中，并用于监控嵌合胚胎的细胞结合到胎盘和各种胎儿组织中的情况。
胚胎移植在第7和8天，将来源于核移植胚胎和嵌合的核移植胚胎的1级和2级核移植囊胚移植到第6和7天的同期化处理的受体母牛中。采用单次注射Lutalyse(Parmacia&Upjohn，Kalamazoo，MI)来同期化处理受体，接着进行发情观察。在胚胎移植后第30和60天，通过超声波扫描来检查孕体的存在，此后每30天进行直肠检查，直到第240天。在表13中，比较了嵌合胚胎和通过融合转基因牛成纤维细胞和卵母细胞生产的对照胚胎在第40天的妊娠情况。这些结果表明，较多的嵌合胚胎存活到第40天。
表13胚胎移植和妊娠情况
用于生产嵌合胚胎的可替代方法可以采用标准方法来改进上述用于生产嵌合胚胎的方法。例如，从哺乳动物(例如牛)中手术获取天然的胚胎，或者用标准技术将卵母细胞孤雌生殖激活，并且使用该卵母细胞替代体外受精的胚胎。如果需要，将较少的来自体外受精的、天然的或者孤雌生殖激活的胚胎的细胞(例如1、2、3、4或5个细胞)注射到核移植胚胎中，来减少所注射细胞的比例，这些细胞的后代掺入到胎儿组织中。可替代地，可以注射较多细胞(例如6、7、8、9、10、11或更多个细胞)，来提高被注射细胞和掺入到胎盘组织中的细胞后代的比例。此外，可以使用处于其他细胞阶段的来自胚胎的细胞。例如可以将处于4细胞、8细胞、16细胞、32细胞、64细胞、128细胞、256细胞、512细胞阶段或者后期细胞阶段的体外受精的、天然的或者孤雌生殖激活的胚胎注射到处于4细胞、8细胞、16细胞、32细胞、64细胞、128细胞、256细胞、512细胞阶段或者后期细胞阶段的核移植胚胎中。被注射的细胞和核移植胚胎可以处于相同的细胞阶段或者处于不同的细胞阶段。在一个实施方案中，体外受精的、天然的或者孤雌生殖激活的胚胎具有比核移植胚胎更高的倍性(例如，DNA含量为4n)，这进一步使被注射的细胞偏向于滋养层(即，胚胎的最外层细胞，主要形成胎盘组织)。如果需要，在被注射细胞周围保留了全部或者部分透明带，而不是在注射前被去除。
在其他可替代方法中，在允许来自各种胚胎的细胞相互识别以生产单一的嵌合胚胎的条件下，将来自致密前的或致密的体外受精的、天然的或孤雌生殖激活的胚胎的细胞与来自致密前的核移植胚胎的细胞一起培养(Wells和Powell，Cloning 29-22，2000)。来自体外受精的、天然的或孤雌生殖的胚胎的细胞被认为主要形成了滋养层，最终形成胎盘组织，而来自核移植胚胎的细胞被认为主要形成内细胞团，最终形成胎儿组织。来自两种胚胎的细胞可以处于相同细胞阶段或者处于不同细胞阶段。相同或不同数量的来自各种胚胎的细胞相结合形成聚集胚胎(aggregation embryo)。
如果需要，将来自生成的克隆胎儿或者克隆后代的细胞用于第二轮核移植中，以生产额外克隆的后代。来自首次克隆胎儿或克隆后代的细胞也可被冷冻，形成用作生产额外克隆的有蹄类动物的供体细胞来源的细胞系。
实施例19对人Ig表达的检测可以在出生后立即对保留了HAC或者其他编码异种抗体的核酸的小牛进行检测，包括评价(1)异种Ig表达，(2)对免疫接种的反应，(3)亲合成熟，和(4)HAC在后代中的传递。
可以通过从动物中采血，通过ELISA、RT-PCR或FACS分析(参见，例如PCT公开WO01/35735)，检测是否存在人重链和轻链的表达，来监控人Ig的表达。一旦确定动物生成人Ig，用溶于佐剂中的破伤风毒素免疫接种动物。在免疫接种后，对动物进行每周一次的采血，并通过ELISA或FACS确定对抗原的反应，与免疫接种前收集的先前的血样比较。在首次免疫接种后1个月，用水溶液形式的抗原对动物进行加强免疫。在加强免疫后1周，从动物上采血，并通过ELISA或FACS确定对抗原的反应，与先前的血样比较。ELISA或FACS分析使得可以测定大部分的反应滴度以及生成的重链同种型。这些数据使得可以确定抗体滴度的升高以及是否发生种类转换。还估计了平均亲合性来确定在对抗原反应的过程中是否发生亲合成熟。
在如上所述获得转基因牛之后，这些牛被用于生产转基因Ig，优选为人的Ig，也可能是其他物种的Ig，例如狗、猫、非人类灵长类，其他有蹄类动物，例如绵羊、猪、山羊、鼠科如小鼠、大鼠、豚鼠、兔等。如所指出，已知在物种间，Ig基因是保守的。
含有异种抗体的转基因抗血清和牛奶牛(或其他有蹄类动物)生产抗血清，该抗血清抵抗内源性暴露的任何抗原或者抵抗外源施用的抗原。例如，将抗原施用给有蹄类动物，以生成与该抗原反应的期望抗体，抗原包括如病原体(例如细菌、病毒、原生动物、酵母或真菌)、肿瘤抗原、受体、酶、细胞因子等。用于抗体生产的示例性病原体包括，但是不限于，肝炎病毒(例如，丙肝病毒)、免疫缺陷病毒(例如HIV)、疱疹病毒、细小病毒、肠道病毒、埃博拉病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、牛痘病毒、链球菌(例如肺炎链球菌)、嗜血杆菌(流感嗜血杆菌)、奈瑟球菌(脑膜炎奈瑟球菌)、白喉棒杆菌、嗜血杆菌(百日咳嗜血杆菌)、梭菌(肉毒梭菌)、葡萄球菌、假单胞菌(例如铜绿假单胞菌)、呼吸道合胞病毒(RSV)。
可以将一种或多种病原体施用给转基因的有蹄类动物，以生产可用于预防、稳定或治疗特定疾病的超免疫血清。例如，与儿童患有的呼吸道感染相关的病原体被施用给转基因有蹄类动物，以生产与这些病原体反应的抗血清(例如，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和/或脑膜炎奈瑟球菌)。可选择地，在施用给有蹄类动物之前，处理这些病原体，以降低它们的毒性(例如，通过加热或者暴露于化学试剂如甲醛)。
为了生产广谱Ig，将各种病原体(例如，多种细菌的和/或病毒的病原体)施用给转基因有蹄类动物。这种超免疫抗血清被用于预防、稳定或治疗哺乳动物(例如人)中的传染病，特别可以用于治疗患有遗传性或者获得性的免疫缺陷的哺乳动物。
此外，通过本发明的方法生产的抗体可以被用于抑制免疫系统，例如治疗神经病，以及消除特定的人类细胞和调节特定分子。例如，抗特应性抗体(即抑制其他抗体的抗体)以及与T细胞、B细胞或细胞因子反应的抗体可以被用于治疗自体免疫性疾病或者神经病(例如，由炎症引起的神经病)。这些抗体可以从未施用抗原的转基因有蹄类动物中获得，或者从被给予了如B细胞、T细胞或细胞因子(例如TNFα)的抗原的转基因有蹄类动物中获得。
由未施用抗原的转基因有蹄类动物生产的转基因抗血清可以被用于生产药物，该药物包含人多克隆抗体，优选人IgG分子。这些人类抗体可以被用于替代从人类分离的抗体，作为静脉内免疫球蛋白(IVIG)治疗剂。任选地，可以富集转基因抗血清中的与一种或多种感兴趣的抗原反应的抗体。例如，可以用标准技术，如Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology，第2卷，11.13.1-11.13.3，John Wiley&Sons，1995)中所描述的那些方法来纯化抗血清。优选的纯化方法包括用抗原或者抗体包被的珠进行沉淀、柱层析如亲合层析、磁珠亲合纯化，以及用结合了抗原的平板进行淘选。此外，转基因抗血清与一种或多种感兴趣的抗原接触，根据抗体/抗原复合物尺寸的增加来将结合抗原的抗体与未被结合的抗体分开。还可以用蛋白A和/或蛋白G来纯化IgG分子。如果内源性抗体的表达未被去除，可以用蛋白A和/或抗人Ig轻链λ(Pharmingen)的抗体来将期望的人抗体与内源性有蹄类动物的抗体或者有蹄类动物/人嵌合抗体分开。蛋白A对人Ig重链的亲和力高于对牛Ig重链的亲和力，可以被用来将含有两条人重链的期望Ig分子与含有一条或两条有蹄类动物重链的其他抗体分开。抗人Ig轻链λ的抗体被用于将具有两条人Igλ链的Ig分子与那些具有一条或两条有蹄类动物Ig轻链的分子分开。另外地或可替代地，一种或多种特异于有蹄类动物Ig重链或轻链的抗体被用于阴性筛选步骤，以去除含有一条或两条有蹄类动物的重链和/或轻链的Ig分子。
获得的抗血清本身可以被用于抵抗一种抗原的被动免疫。可替代地，该抗血清具有诊断性的、预防性或纯化的用途，例如用于对抗原进行纯化。
可替代地，在施用抗血清后，从转基因牛中分离B细胞，用于制备杂交瘤。例如，采用标准技术将来自转基因有蹄类动物的B细胞与骨髓瘤细胞融合来生产分泌感兴趣的单克隆抗体的杂交瘤(Mocikat，J.Immunol.Methods 225185-189，1999；Jonak等，Hum.AntibodiesHybridomas 3177-185，1992；Srikumaran等，Science 220522，1983)。优选杂交瘤包括那些由B细胞与来自与转基因有蹄类动物相同的种属或物种的哺乳动物的骨髓瘤细胞融合而生产得到的杂交瘤。其他优选的杂交瘤来自Balb/C小鼠或人。在这种情况下，生成一种产生抗特定抗原的异种单克隆抗体的杂交瘤。例如，这种技术被用于生产人、猫、狗等(取决于特定的人工染色体)的单克隆抗体，该抗体特异于病原体。用于筛选生产具有期望特性的抗体的杂交瘤的方法是已知的，这些特性即增强的结合亲合性、亲和力。
可替代地，来自转基因有蹄类动物的B细胞被遗传修饰，以表达致癌基因，例如ras、myc、abl、bcl2或neu，或者用DNA或RNA病毒，例如EB病毒或者SV40病毒转染(Kumar等，Immunol.Lett.65153-159，1999；Knight等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 853130-3134，1988；Shammah等，J.Immunol.Methods 160-19-25，1993；Gustafsson和Hinkula，Hum.Antibodies Hybridomas 598-104，1994；Kataoka等，Differentiation 62201-211，1997；Chatelut等，Scand.J.Immunol.48659-666，1998)。生成的无限生殖的B细胞还可以被用于生产理论上无限量的抗体。由于Ig还被分泌在有蹄类动物的乳汁中，有蹄类动物乳汁也可以被用作异种抗体的来源。
其他实施方案从上述描述中，可以明显地看出，可以对本文描述的发明进行各种变化和改进，以使其适合于各种用途和情况。例如，可以采用其他培养时间或温度(例如25、30、35、37、38.5或40℃或更高或更低的温度)来透化处理细胞膜、再编程供体遗传材料、再封闭细胞膜，和/或将遗传物质转移到卵母细胞中。这些实施方案也在如下的权利要求书的范围内。
在本说明书中提及的所有出版物均在此引入作为参考，其程度与每个独立的出版物或专利申请被明确而分别地指明引入作为参考一样。
权利要求
1.在内源性朊病毒核酸的一个或两个等位基因上包含非天然发生的突变的牛。
2.权利要求1的牛，其中所述突变降低了功能性朊病毒蛋白的表达。
3.权利要求2的牛，其中所述突变基本上消除了功能性朊病毒蛋白的表达。
4.权利要求1的牛，其中所述突变是半合子的。
5.权利要求1的牛，其中所述突变是纯合子的。
6.权利要求1的牛，其中所述突变包括将阳性选择标记插入到朊病毒核酸中。
7.权利要求6的牛，其中所述阳性选择标记是抗生素抗性基因。
8.权利要求6的牛，其中所述阳性选择标记被可操作地连接到异种启动子上。
9.权利要求5的牛，其中各个等位基因包括相同的抗生素抗性基因。
10.权利要求5的牛，其中各个等位基因包括不同的抗生素抗性基因。
11.权利要求5的牛，其中所述突变包括将STOP密码子插入到朊病毒核酸中。
12.权利要求11的牛，其中将所述STOP密码子插入到所述朊病毒核酸的外显子3中的起始ATC密码子的下游。
13.权利要求10的牛，其中将所述STOP密码子以所述STOP密码子的10个之内的核苷酸插入。
14.权利要求1的牛，其中所述突变包括删除朊病毒核酸中的一个或多个核苷酸。
15.权利要求1的牛，其中所述突变不包括在朊病毒核酸中删除一个或多个核苷酸。
16.权利要求1的牛，包括一条或多条包括一个或多个转基因并且表达一种mRNA或由所述转基因编码的蛋白质的核酸。
17.权利要求1的牛，包括一条或多条包括异种免疫球蛋白(Ig)基因的全部或部分的核酸，该免疫球蛋白基因发生重排并表达不只一种异种Ig分子。
18.权利要求16或17的牛，包括一条或多条编码异种抗体的核酸。
19.权利要求18的牛，其中所述蛋白或所述异种抗体是来自另一种属的抗体。
20.权利要求19的牛，其中所述异种抗体是人抗体。
21.权利要求18的牛，其中所述抗体是多克隆抗体。
22.权利要求18的牛，其中所述抗体被表达在血清和/或乳汁中。
23.权利要求16或17的牛，其中所述核酸被包含在染色体片段中。
24.权利要求23的牛，其中所述染色体片段是ΔHAC。
25.权利要求23的牛，其中所述染色体片段是ΔΔHAC。
26.权利要求16或17的牛，其中所述核酸独立于宿主染色体而被维持。
27.权利要求17的牛，其中所述核酸包括未被重排的抗体轻链核酸片段，其中通过一个或多个核苷酸将所有编码V基因片段的核酸片段与所有编码J基因片段的核酸片段分离。
28.权利要求17的牛，其中所述核酸包括未被重排的抗体重链核酸片段，其中(i)通过一个或多个核苷酸将所有编码V基因片段的核酸片段与所有编码D基因片段的核酸片段分离和/或(ii)通过一个或多个核苷酸将所有编码D基因片段的核酸片段与所有编码J基因片段的核酸片段分离。
29.权利要求1的牛，包括降低内源性抗体表达的突变。
30.权利要求29的牛，其中所述突变降低了功能性IgM重链的表达。
31.权利要求30的牛，其中所述突变基本上消除功能性IgM重链的表达。
32.权利要求29的牛，其中所述突变降低了功能性Ig轻链的表达。
33.权利要求32的牛，其中所述突变基本上消除了功能性Ig轻链的表达。
34.权利要求29的牛，其中所述突变降低了功能性IgM重链和功能性Ig轻链的表达。
35.权利要求32的牛，其中所述突变基本上消除了功能性IgM重链和功能性Ig轻链的表达。
36.权利要求1的牛，它在编码α-(1，3)-半乳糖基转移酶的内源性核酸的一个或两个等位基因中包括突变。
37.权利要求1的牛，它在编码J链的内源性核酸的一个或两个等位基因中包括突变。
38.权利要求1的牛，包括编码异种J链的核酸。
39.权利要求38的牛，其中所述J链是人J链。
40.在内源性朊病毒核酸的一个或两个等位基因上包含非天然发生的突变的牛细胞。
41.权利要求40的细胞，其中所述突变降低了功能性朊病毒蛋白的表达。
42.权利要求41的细胞，其中所述突变基本上消除了功能性朊病毒蛋白的表达。
43.权利要求40的细胞，其中所述突变是半合子的。
44.权利要求40的细胞，其中所述突变是纯合子的。
45.权利要求40的细胞，其中所述突变包括将阳性选择标记插入到朊病毒核酸中。
46.权利要求45的细胞，其中所述阳性选择标记是抗生素抗性基因。
47.权利要求45的细胞，其中所述阳性选择标记被可操作地连接到异种启动子上。
48.权利要求44的细胞，其中各个等位基因包括相同的抗生素抗性基因。
49.权利要求44的细胞，其中各个等位基因包括不同的抗生素抗性基因。
50.权利要求40的细胞，其中所述突变包括将STOP密码子插入到朊病毒核酸中。
51.权利要求50的细胞，其中所述STOP密码子插入到所述朊病毒核酸的外显子3中的起始ATC密码子的下游。
52.权利要求51的牛，其中所述STOP密码子以所述STOP密码子的10个之内的核苷酸插入。
53.权利要求40的细胞，其中所述突变不包括在朊病毒核酸中删除一个或多个核苷酸。
54.权利要求40的细胞，其中所述突变包括在朊病毒核酸中删除一个或多个核苷酸。
55.权利要求40的细胞，包括一条或多条包括一个或多个转基因并且表达一种mRNA或由所述转基因表达的蛋白质的核酸。
56.权利要求40的细胞，包括一条或多条包括异种免疫球蛋白(Ig)基因的全部或部分的核酸，其中所述基因能在B细胞中发生重排并表达一种或多种异种Ig分子。
57.权利要求55或56的细胞，包括一条或多条编码异种抗体的核酸。
58.权利要求57的细胞，其中所述蛋白或所述异种抗体是来自另一种属的抗体。
59.权利要求58的细胞，其中所述异种抗体是人抗体。
60.权利要求57的细胞，其中所述抗体是多克隆抗体。
61.权利要求57的细胞，其中所述抗体被表达在血清和/或乳汁中。
62.权利要求55或56的细胞，其中所述核酸被包含在染色体片段中。
63.权利要求62的细胞，其中所述染色体片段是ΔHAC。
64.权利要求62的细胞，其中所述染色体片段是ΔΔHAC。
65.权利要求55或56的细胞，其中所述核酸独立于宿主染色体而被维持。
66.权利要求56的细胞，其中所述核酸包括未被重排的抗体轻链核酸片段，其中通过一个或多个核苷酸将所有编码V基因片段的核酸片段与所有编码J基因片段的核酸片段分离。
67.权利要求56的细胞，其中所述核酸包括未被重排的抗体重链核酸片段，其中(i)通过一个或多个核苷酸将所有编码V基因片段的核酸片段与所有编码D基因片段的核酸片段分离和/或(ii)通过一个或多个核苷酸将所有编码D基因片段的核酸片段与所有编码J基因片段的核酸片段分离。
68.权利要求40的细胞，包括降低内源性抗体表达的突变。
69.权利要求68的细胞，其中所述突变降低了功能性IgM重链的表达。
70.权利要求69的细胞，其中所述突变基本上消除了功能性IgM重链的表达。
71.权利要求68的细胞，其中所述突变降低了功能性Ig轻链的表达。
72.权利要求71的细胞，其中所述突变基本上消除了功能性Ig轻链的表达。
73.权利要求68的细胞，其中所述突变降低了功能性IgM重链和功能性Ig轻链的表达。
74.权利要求73的细胞，其中所述突变基本上消除了功能性IgM重链和功能性Ig轻链的表达。
75.权利要求40的细胞，它在编码α-(1，3)-半乳糖基转移酶的内源性核酸的一个或两个等位基因中包括突变。
76.权利要求40的细胞，它在编码J链的内源性核酸的一个或两个等位基因中包括突变。
77.权利要求40的细胞，包括编码异种J链的核酸。
78.权利要求77的牛，其中所述J链是人J链。
79.权利要求55或56的细胞，其中所述核酸独立于宿主染色体而被维持在牛细胞中。
80.权利要求40的细胞，其中所述细胞是体细胞。
81.权利要求80的细胞，其中所述细胞是胎儿成纤维细胞。
82.权利要求40的细胞，其中所述细胞是B细胞。
83.由权利要求82的细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤。
84.用于生产功能性朊病毒蛋白表达降低的转基因牛细胞的方法，包括在允许所述第一个载体与所述细胞中的内源性朊病毒核酸的第一个等位基因发生同源重组的条件下，将第一个朊病毒打靶载体导入牛细胞中，从而在所述细胞中导入半合子突变。
85.权利要求84的方法，还包括在允许第一个载体与内源性朊病毒核酸的第二个等位基因之间在细胞内发生同源重组的条件下，将所述第一个载体导入所述细胞中，从而在所述细胞中导入纯合子突变。
86.权利要求84的方法，还包括在允许第二个载体与内源性朊病毒核酸的第二个等位基因之间在细胞内发生同源重组的条件下，将具有不同于第一个载体的抗生素抗性基因的第二个朊病毒基因打靶载体导入所述细胞中，从而在所述细胞中导入纯合子突变。
87.权利要求84-86中任何一项的方法，其中所述细胞是牛成纤维细胞。
88.权利要求87的方法，其中所述细胞是牛胎儿成纤维细胞。
89.用于生产功能性朊病毒蛋白表达降低的转基因牛的方法，所述方法包括下列步骤(a)将细胞、来自细胞的染色质或者来自细胞的细胞核插入到卵母细胞中，其中所述细胞在内源性朊病毒核酸中包含第一个突变；和(b)在使所述卵母细胞或所述胚胎发育成胎儿的条件下，将所述卵母细胞或者由所述卵母细胞形成的胚胎移植到宿主牛的子宫中。
90.权利要求89的方法，其中所述胎儿发育为可存活的后代。
91.权利要求89的方法，其中所述细胞通过一种方法制备，该方法包括将包含表达盒的核酸插入到细胞中，该表达盒包括被可操作地连接到编码可选择的标记的核酸上并且被可操作地连接到一条或多条具有与所述朊病毒核酸基本上相同的序列的核酸上的启动子；从而将该表达盒整合到所述朊病毒核酸的一个内源性等位基因上。
92.权利要求89的方法，其中所述细胞是通过一种包括下列步骤的方法制备的(a)将包括第一个盒的核酸插入到所述细胞中，该盒包括被可操作地连接到编码第一个可选择的标记的核酸上并且被可操作地连接到第一条具有与所述内源性朊病毒核酸基本上相同的序列的核酸上的第一个启动子；从而将该第一个盒整合到所述朊病毒核酸的第一个内源性等位基因上，生成第一个转基因细胞；和(b)往该第一个转基因细胞中插入包括第二个盒的核酸，该第二个盒包括被可操作地连接到编码第二个可选择的标记的核酸上并且被可操作地连接到第二条具有与所述朊病毒核酸基本上相同的序列的核酸上的第二个启动子；其中所述第二个可选择的标记区别于所述第一个可选择标记；从而将所述第二个盒整合到所述朊病毒核酸的第二个内源性等位基因上，生成第二个转基因细胞。
93.权利要求89的方法，还包括下列步骤(c)从所述胚胎、所述胎儿或者由所述胎儿生产的后代中分离细胞；(d)在所述细胞的内源性朊病毒核酸中导入第二个突变；(e)将所述细胞、来自所述细胞的染色质或来自所述细胞的细胞核插入到卵母细胞中；和(f)在允许所述卵母细胞或所述胚胎发育为胎儿的条件下，将所述卵母细胞或由所述卵母细胞形成的胚胎移植到宿主牛的子宫中。
94.权利要求89的方法，其中所述细胞包括一条或多条核酸，该核酸包括异种Ig基因的全部或部分，其中所述基因能在B细胞中发生重排并表达一种或多种异种Ig分子。
95.权利要求94的方法，其中所述的核酸编码异种抗体。
96.权利要求95的方法，其中所述异种抗体被表达在所述牛的血液或乳汁中。
97.用于生产功能性朊病毒蛋白的表达降低的转基因牛的方法，所述方法包括下列步骤(a)在允许从细胞核、染色质或权利要求40的被透化处理的细胞的染色体中去除一种因子或者将来自所述再编程培养基的一种因子添加到所述细胞核、染色质或染色体中的条件下，在再编程培养基中培养所述被透化处理的细胞，从而形成被再编程的细胞；(b)将所述再编程细胞插入到有核的或去核的卵母细胞中，从而生成核移植卵母细胞；和(c)在允许所述核移植卵母细胞或者所述胚胎发育为胎儿的条件下，将所述核移植卵母细胞或由所述核移植卵母细胞形成的胚胎移植到宿主牛的子宫中。
98.权利要求97的方法，其中所述再编程培养基是一种细胞提取物。
99.权利要求97的方法，其中所述被透化处理的细胞的细胞核仍然是膜结合的，并且所述细胞核中的染色质在所述再编程培养基中培养的过程中不浓缩。
100.权利要求97的方法，其中染色质是由在所述再编程培养基中培养所述被透化处理的细胞而形成的。
101.权利要求97的方法，其中在允许所述再编程细胞的细胞膜再封闭的条件下培养所述的再编程细胞。
102.权利要求97的方法，其中在插入到所述核移植卵母细胞之前，从所述再编程培养基中纯化所述的再编程细胞。
103.权利要求97的方法，其中所述胎儿发育成可存活的后代。
104.权利要求103的方法，还包括交配两个后代，以生产在朊病毒核酸的两个等位基因中都具有突变的转基因牛。
105.权利要求97的方法，其中在允许细胞分化条件下培养来自步骤(b)的所述核移植卵母细胞，所得的细胞之一被再克隆一次或多次。
106.权利要求97的方法，其中所述被透化处理的细胞和所述核移植卵母细胞来自同样的物种。
107.用于生产功能性朊病毒蛋白的表达降低的转基因牛的方法，所述方法包括下列步骤(a)在允许染色质形成而不引起DNA复制的条件下，将来自权利要求40的细胞的供体细胞核与再编程培养基接触；(b)将所述染色质插入到卵母细胞中，从而生成核移植卵母细胞；和(c)在允许所述核移植卵母细胞或所述胚胎发育为胎儿的条件下，将所述核移植卵母细胞或者由所述核移植卵母细胞形成的胚胎移植到宿主牛的子宫中。
108.权利要求107的方法，其中再编程培养基是有丝分裂提取物、去垢剂和盐溶液、去垢剂溶液、盐溶液或蛋白激酶溶液。
109.权利要求107的方法，其中在插入到所述核移植卵母细胞中之前，从所述提取物中纯化来自步骤(a)的所述染色质。
110.权利要求107的方法，其中所述胎儿发育为可存活的后代。
111.权利要求107的方法，其中在允许细胞分裂的条件下培养来自步骤(b)的所述核移植卵母细胞，并且生成的细胞之一被再克隆一次或多次。
112.权利要求107的方法，其中所述供体细胞核和所述核移植卵母细胞来自相同的物种。
113.权利要求107的方法，其中其中所述供体细胞核是双倍体的。
114.权利要求84、89、97或106的方法，其中所述供体细胞核来自成纤维细胞、上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质细胞、造血细胞、黑素瘤细胞、软骨细胞、B-淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胎儿细胞、胎盘细胞、雌性生殖系统细胞或者胚胎细胞。
115.权利要求84、89、97或106的方法，其中所述细胞是胎儿成纤维细胞。
116.用于生产功能性朊病毒蛋白的表达降低的转基因牛的方法，所述方法包括下列步骤(a)将权利要求40的细胞、来自所述细胞的细胞核或来自所述细胞的染色质插入到卵母细胞中，从而形成第一种胚胎；(b)将一个或多个来自所述第一种胚胎的细胞与一个或多个来自第二种胚胎的细胞接触；从而生成第三种胚胎；其中所述第二种胚胎是体外受精的胚胎、天然的胚胎或者孤雌生殖激活的胚胎，并且其中至少所述的第一种胚胎和所述的第二种胚胎之一为致密胚胎；和(c)在允许所述第三种胚胎发育为胎儿的条件下，将所述第三种胚胎移植到宿主牛的子宫中。
117.用于生产功能性朊病毒蛋白的表达降低的转基因牛的方法，所述方法包括下列步骤(a)将权利要求40的细胞、来自所述细胞的细胞核或来自所述细胞的染色质插入到卵母细胞中，从而生成第一种胚胎；(b)将一个或多个来自所述第一种胚胎的细胞与一个或多个来自第二种胚胎的细胞接触；从而生成第三种胚胎；其中所述第二种胚胎是体外受精的胚胎、天然的胚胎或者孤雌生殖激活的胚胎，其中所述的第一种胚胎和所述的第二种胚胎处于不同的细胞阶段；和(c)在允许所述第三种胚胎发育为胎儿的条件下，将所述第三种胚胎移植到宿主牛的子宫中。
118.用于生产功能性朊病毒蛋白的表达降低的转基因牛的方法，所述方法包括下列步骤(a)在允许形成染色质的条件下，将来自权利要求40的细胞的供体细胞核与再编程培养基接触；(b)将所述染色质插入到卵母细胞中，从而形成第一种胚胎；(c)将一个或多个来自所述第一种胚胎的细胞与一个或多个来自第二种胚胎的细胞接触；从而形成第三种胚胎；其中所述第二种胚胎是体外受精的胚胎、天然的胚胎或者孤雌生殖激活的胚胎，其中所述第一种胚胎和所述第二种胚胎处于不同的细胞阶段；和(d)在允许所述第三种胚胎发育为胎儿的条件下，将所述第三种胚胎移植到宿主牛的子宫中。
119.权利要求118的方法，其中步骤(a)包括在允许形成染色质而不引起DNA复制的条件下，将具有少于四套同源染色体的供体细胞核与再编程培养基接触。
120.用于生产功能性朊病毒蛋白的表达降低的转基因牛的方法，所述方法包括下列步骤(a)在允许从权利要求40的被透化处理的细胞的细胞核、染色质和染色体中去除一种因子或者允许将来自所述再编程培养基的一种因子加入所述细胞核、染色质或染色体中的条件下，在再编程培养基中培养所述被透化处理的细胞，从而形成再编程细胞；(b)将所述再编程的细胞插入到卵母细胞中，从而形成第一种胚胎；(c)将一个或多个来自所述第一种胚胎的细胞与一个或多个来自第二种胚胎的细胞接触；从而形成第三种胚胎；其中所述第二种胚胎是体外受精的胚胎、天然的胚胎或者孤雌生殖激活的胚胎，其中所述第一种胚胎和所述第二种胚胎处于不同的细胞阶段；和(d)在允许所述第三种胚胎发育为胎儿的条件下，将所述第三种胚胎移植到宿主牛的子宫中。
121.权利要求120的方法，其中所述再编程细胞不是在允许所述再编程细胞再封闭的条件下被培养的。
122.权利要求116-118和120的任何一项的方法，其中所述胎儿发育为可存活的后代。
123.权利要求116-118和120的任何一项的方法，其中所述胎儿的胎盘中的至少10％的细胞来源于所述第二种胚胎。
124.一种用于生产抗体的方法，所述方法包括下列步骤(a)将一种或多种感兴趣的抗原施用给权利要求17的牛，该牛包括编码异种抗体基因座的核酸，其中所述基因座中的核酸片段发生重排，导致生成特异于所述抗原的抗体；和(b)从所述牛中收获所述抗体。
125.权利要求124的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
126.权利要求124的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。
127.权利要求124的方法，其中从所述牛的血清或乳汁中回收所述抗体。
128.生产抗体的方法，所述方法包括从权利要求17的牛中收获异种抗体，该牛包括编码异种抗体基因座的核酸，其中所述基因座中的核酸发生重排，导致生成异种抗体。
129.权利要求128的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
130.权利要求128的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。
131.权利要求128的方法，其中从所述牛的血清或乳汁中回收所述抗体。
132.权利要求124或128的方法，其中所述Ig是针对期望的抗原的。
133.一种包括盒的核酸，该盒沿5′到3′方向包括，具有与牛细胞的内源性朊病毒核酸的第一个区域基本上相同的序列的第一个同源区域、阳性选择标记和具有与所述朊病毒核酸的第二个区域基本上相同的序列的第二个同源区域，其中所述第一个同源区域比所述第二个同源区域长，并且其中所述盒能够整合到所述细胞的内源性朊病毒核酸中。
全文摘要
本发明提供克隆的转基因有蹄类动物(例如牛)，其中朊病毒蛋白的活性被一个或多个基因工程突变所降低。期望地，这些转基因牛还被基因修饰以表达外源性(例如人)抗体。由于它们对与朊病毒有关的疾病例如牛海绵状脑病(也称为疯牛病)，这些牛是用于医药用途的人抗体的更安全的来源和农产品的更安全的来源。
文档编号A01K67/027GK1742088SQ200380108416
公开日2006年3月1日 申请日期2003年11月10日 优先权日2002年11月8日
发明者J·罗布尔, Y·库罗伊瓦, P·科拉斯, E·叙利文, P·卡西纳坦, K·托米祖卡, I·伊施达 申请人:赫马技术有限公司, 麒麟麦酒株式会社