专利名称：发菜细胞的固态培养方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞培养技术，特别涉及一种发菜细胞培养技术，具体为可直接接种于沙粒或荒漠土壤自然沙土表层的发菜细胞固态培养方法。
背景技术：
发菜(Nostoc flagelliforme)，是一种原核生物，隶属于原核生物界(Procaryotae)，蓝藻门(Cyanophyta)，蓝藻纲(Cyanophyceae)，段殖体目(Hormogonales)、念珠(Nostocaceae)、念珠藻属(Nostoc)。其营养丰富，并具有一定的药用价值，极具经济开发价值和潜力，并因发音与“发财”相似长期受到人们的青睐。发菜在我国主要分布于西北和华北部分省区的荒漠半荒漠地带，发菜既能进行光合作用，又能固氮，是一种在特殊生态条件下生活的陆生蓝藻，对干旱、高温、紫外辐射、贫瘠等恶劣环境具有很强的适应性。是荒漠生态环境中主要的固氮资源，具有重要的生态恢复作用。由于在野外发菜生长极其缓慢，加之大规模无节制的毁灭性采收不仅使其资源量锐减，而且严重破坏了草原生态系统。为了保护发菜资源和生态环境，长期以来，人们一直试图采用人工培养的方法，增加其生物量和资源量，以满足日益增长的市场需求，并开展了大量的生理生态学研究，例如，申请号为0213882808和03119101.0的中国专利申请，进行了发菜细胞液体悬浮培养工作，取得了一些进展。但是，完全人工培养一直没有实现。目前的培养工作基本以野外采集的发菜藻体为材料，倘无利用发菜细胞进行固态培养的报道。
发明内容
本发明是针对上述问题进行的研究，其目的是提供一种方法简单易行，操作方便，有利于发菜这一濒危物种的保护和人工生产，以期在目前发菜藻体人工培养进展缓慢的情况下，实现完全人工培养，并能在接近自然的条件下或直接接种于沙粒或荒漠土壤自然沙土表层扩大生产，使其能相对快速地生长的发菜细胞的固态培养方法。
为达到上述目的，本发明解决所述发菜细胞的固态培养方法技术问题的技术方案是，采取了以下技术措施1、培养液配方为NaNO30.5-1.5g/L，MgSO4·7H2O 75mg/L，CaCl2·2H2O 30-40mg/L，NaSiO3·9H2O 55-65mg/L，K2HPO435-40mg/L，pH7.5-8.0。培养液营养盐使用化学纯，溶解于自来水中即可。配制时，尽量避免沉淀生成，微有沉淀析出亦可，培养液无需进行高温灭菌。
2、发菜细胞液的制备将液体培养的发菜细胞液4000rpm离心或过滤，弃去上清液，添加新鲜培养液，使之重新悬浮，或者将干燥发菜细胞用培养液浸泡，使其恢复活性，作为固态培养用种。
3、沙粒预处理40目筛网将沙粒过筛，用水洗净，100℃烘干，平铺于浅盘中，厚约0.5-1.5cm。
4.发菜细胞培养将发菜细胞液按400ml/m2的接种量接种于沙粒表层，按1-1.5L/m2的总用量分3次每天在光照期间喷施培养液或水分，沙盘上覆盖透明塑料薄膜保持沙粒表层湿润。在无光照时揭去薄膜，使沙粒表层干燥，进行干湿节律培养。野外培养时，白天地表温度低于40℃时喷施培养液或水，保持土层表层湿润，夜晚或地表温度高于40℃时则保持干燥状态。
5、培养条件温度24-26℃，光照60-180μmol·m-2s-1，光暗周期12h12h；或是野外自然条件培养。
6、收获当沙盘上发菜细胞生长成团或野外培养到达收获季节时去沙采收。
7、干燥于45℃以下晒干、风干或烘干。
8、保藏室温干燥保存。
9、继续培养干燥发菜细胞于新的培养液中复水，可进行继续培养。
本发明的优点和积极效果是由于采用细胞固体培养法，改变了传统的藻体培养方式，方法简单易行，操作方便；培养液无需进行高温灭菌，与传统发菜藻体培养相比，发菜的增殖速度更快，有利于发菜这一濒危物种的保护和人工生产。由于进行了干湿节律培养，因此，本发明培养获得的发菜细胞培养物，具有与野生发菜相类似的较强的耐干旱能力，并可在干燥条件下长期保藏，经扩大培养可直接用于生产，接种于沙粒或荒漠土壤自然沙土表层；应用该技术培养发菜细胞，可以吸收空气中的二氧化碳并可固氮，向大气中释放氧气，有净化空气的作用，并且不同于现代农业生产要用到农药和除草剂，生产中无需任何农药和除草剂，其培养过程中不会产生任何毒害物质；该技术突破了传统的发菜藻体培养方式，其扩大培养有利于维持干旱半干旱地区的生态平衡和荒漠化土壤的改良，对草原生态系统的平衡具有一定的现实意义，并且具有很高的经济价值和环保价值。
具体实施例方式
实施例1发菜细胞沙盘固态培养，其具体方法为A.配制培养液NaNO30.5g/L，MgSO4·7H2O 75mg/L，CaCl2·2H2O 30mg/L，NaSiO3·9H2O55mg/L，K2HPO435mg/L，pH7.5，混匀备用。
B.制备发菜细胞液发菜细胞培养液离心或过滤，收集发菜细胞。按10g(湿重)发菜细胞加1L培养液的比例，使之重新悬浮，或者采用干发菜细胞，按2.5g细胞粉加1L培养液的比例浸泡24h，使之恢复活性，作为固态培养用种。
C.沙粒预处理40目筛网将沙粒过筛，用水洗净，100℃烘干至恒重。平铺于玻璃、塑料、金属或木制浅盘上，厚度0.5cm。
D.细胞培养将发菜细胞液按400ml/m2的接种量接种于沙粒表层，按1L/m2的总用量分3次每天在光照期间喷施培养液或水分，沙盘上覆盖透明塑料薄膜保持沙粒表层湿润。在无光照时揭去薄膜，使沙粒表层干燥，进行干湿节律培养。
E.培养条件温度24℃，光照60μmol·m-2s-1，光暗周期12h12h。
F.收获当发菜细胞生长成团或长满沙盘表层时去沙采收。
G.干燥于45℃以下晒干、风干或烘干。
H.保藏将收集的发菜细胞培养物于室温干燥通风环境下保存。
I.继续培养将干燥的发菜细胞于新的培养液中复水，可进行继续培养。
实施例2A.配制培养液NaNO31.0g/L，MgSO4·7H2O 75mg/L，CaCl2·2H2O 35mg/L，NaSiO3·9H2O60mg/L，K2HPO437.5mg/L，pH7.25(pH7.8)，混匀备用。
C.沙粒预处理40目筛网将沙粒过筛，用水洗净，100℃烘干至恒重。平铺于玻璃、塑料、金属或木制浅盘上，厚度1.0cm。
D.细胞培养将发菜细胞液按600ml/m2的接种量接种于沙粒表层，按1.2L/m2的总用量分3次每天在光照期间喷施培养液或水分，沙盘上覆盖透明塑料薄膜保持沙粒表层湿润。
E.培养条件温度25℃，光照120μmol·m-2s-1，光暗周期12h12h。
其余同实施例1。
实施例3A.配制培养液NaNO31.5g/L，MgSO4·7H2O 75mg/L，CaCl2·2H2O 40mg/L，NaSiO3·9H2O65mg/L，K2HPO4 40mg/L，pH8.0，混匀备用。
C.沙粒预处理40目筛网将沙粒过筛，用水洗净，100℃烘干至恒重。平铺于玻璃、塑料、金属或木制浅盘上，厚度1.5cm。
D.细胞培养将发菜细胞液按800ml/m2的接种量接种于沙粒表层，按1.5L/m2的总用量分3次每天在光照期间喷施培养液或水分，沙盘上覆盖透明塑料薄膜保持沙粒表层湿润。
E.培养条件温度26℃，光照180μmol·m-2s-1，光暗周期12h12h；其余同实施例1。
实施例4发菜细胞野外培养，其具体方法为发菜细胞液按500ml/m2的接种量喷洒于荒漠-半荒漠草原或丘陵裸地的沙土表层，自然条件下培养。每年4月底或5月初播种，11月底采收。夏季高温季节培养地上覆盖遮阳网，以遮蔽过于强烈的光照并降低地表温度。白天地表温度低于40℃时喷施培养液或水，保持土层表层湿润，夜晚或地表温度高于40℃时则保持干燥状态。其余同实施例1(不包括人工控制的培养条件、沙粒预处理等内容)。
实施例5发菜细胞野外培养，其具体方法为发菜细胞液按750ml/m2的接种量喷洒于荒漠-半荒漠草原或丘陵裸地的沙土表层，其余同实施例4。
实施例6发菜细胞野外培养，其具体方法为发菜细胞液按1000ml/m2的接种量喷洒于荒漠-半荒漠草原或丘陵裸地的沙土表层，其余同实施例4。
权利要求
1.一种发菜细胞的固态培养方法，其特征在于将液体悬浮培养获得的发菜细胞培养物接种于固态培养基质表层，在人工控制或自然条件下培养发菜细胞，包括以下步骤A.培养液配制NaNO30.5-1.5g/L，MgSO4·7H2O 75mg/L，CaCl2·2H2O 30-40mg/L，NaSiO3·9H2O55-65mg/L，K2HPO435-40mg/L，pH7.5-8.0，混匀备用；B.发菜细胞液制备发菜细胞培养液离心或过滤，收集发菜细胞，添加新鲜培养液，使之重新悬浮，或者将干燥发菜细胞用培养液浸泡，使其恢复活性，作为固态培养用种；C.沙粒预处理40目筛网将沙粒过筛，用水洗净，100℃烘干至恒重，平铺于玻璃、塑料、金属或木制浅盘上，厚度0.5-1.5cm；D.发菜细胞培养将发菜细胞液接种于固态培养基质表层；室内培养时，每天光照阶段按1-1.5L/m2总用量分3次喷施培养液或水，沙盘表层覆盖薄膜使基质表层保持湿润，无光照时则去除薄膜，使基质表层干燥，进行干湿节律培养；野外培养时，白天地表温度低于40℃时喷施培养液或水，保持土层表层湿润，夜晚或地表温度高于40℃时则保持干燥状态；E.培养条件培养温度24-26℃，光照60-180μmol·m-2s-1，光暗周期12h12h；或野外自然条件培养；F.收获当沙盘上发菜细胞生长成团或野外培养到达收获季节时去沙采收；G.干燥于45℃以下晒干、风干或烘干；H.保藏将收集的发菜细胞室温干燥通风环境下保存；I.继续培养将干燥发菜细胞于新的培养液中复水，可进行继续培养。
2.根据权利要求1所述的发菜细胞的固态培养方法，其特征在于将液体悬浮培养获得的发菜细胞培养物接种于人工预处理的沙粒表层，在人工控制条件下培养发菜细胞。
3根据权利要求1所述的发菜细胞的固态培养方法，其特征在于将液体悬浮培养获得的发菜细胞培养物接种于自然沙土表层，且在自然条件下培养发菜细胞。
全文摘要
本发明公开了一种发菜细胞的固态培养方法。解决了发菜在人工控制或自然条件下相对快速生长的问题。其技术方案是将活化的发菜细胞悬液，接种于固态培养基质表层，喷洒一定量事先配制好的培养液，在人工控制或自然条件下培养发菜细胞，并进行干湿节律培养，控制适宜的培养条件，实现完全人工培养或野外扩大培养。该技术突破了传统培养方式，加快了增殖速度。本发明获得的发菜细胞培养物具有较强的耐干旱能力，可长期保藏；生长中吸收空气中的二氧化碳并可固氮，向大气中释放氧气，有净化空气的作用；无需农药，不产生毒害物质；其扩大培养有利于维持干旱半干旱地区的生态平衡和荒漠化土壤的改良，具有很高的经济价值和环保价值。
文档编号A01G33/00GK1793314SQ200510122059
公开日2006年6月28日 申请日期2005年12月1日 优先权日2005年12月1日
发明者贾士儒, 苏建宇, 何茜, 陈雪峰, 于海峰 申请人:天津科技大学