专利名称：含有氧化氮产生剂的农业组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有至少一种氧化氮产生剂的组合物用于增加植物的生产力和其产物的质量的应用，所述应用通过控制花和果实的脱离；增加花和果实的产量和质量；增加裂芽和开花的早熟，特别是在葡萄藤和落叶树果实中；和延长果实和观赏花卉的寿命，特别是鲜切花的寿命来实现。
背景技术：
被称作脱离(器官分离)的叶、花和果实的脱落是一种植物中常见的调节现象。植物部分包括生殖部分和营养体部分的脱落对于繁殖、植物防御、对干旱和洪水的抵抗力以及多年生植物生长的连续性是很重要的。
当离层中的原生细胞壁和围绕细胞的胞间层退化，则出现脱离，所述离层形成于通常被称为离区的细胞的一个宽阔区域内。尽管控制植物所有部分的脱离并不相同，但一种调节脱离的常规模式是乙烯诱导和增强该过程，然而生长素强烈抑制该模式。
来自例如豆科的植物(例如菜豆或豌豆)的裂果是种荚。虽然每株植物的种荚数是由遗传设定的受精花的数目决定，但受到过早脱离的花的数目的显著影响。花和荚脱离的高比率导致作物产量有限，这是作物如豆科植物(例如菜豆(Phaseolus vulgaris))的常见问题。环境压力的存在使此问题恶化。
历史上已采取了一些方法以克服这种由于脱离导致的产量降低。所述方法包括育种/选择提高产量的新品种，改善农业实践，施用肥料，通过插入转基因引入新性状和用农药如杀虫剂和除草剂喷洒。
WO02/061042和WO03/088738均公开了遗传操纵植物以便减少器官脱离的实例。WO02/061042公开了一种降低器官或花脱离率的方法，其中修饰了基因例如NEVERSHED基因的ARF GAP区。WO03/088738公开了组织特异性操纵EIN2和或EIN3乙烯信号基因。
通过降低乙烯、控制器官脱离中特别涉及的激素的水平降低脱离率已证明是可行的，WO01/37663和US5100462均公开了向植物施用化学药品以抑制乙烯反应的方法。在WO01/37663中，将环丙烯衍生物和组合物施用于植物以阻断乙烯受体，而US5100462公开了一种向植物施用有效量的二氮杂环戊二烯(DACP)的方法，DACP是一种竞争性乙烯结合抑制剂。
尽管上述方法中许多是成功的，但其各有局限性。例如，有环境问题，如与施用肥料、杀虫剂和除草剂和化学组合物有关的地下水污染问题。此外，虽然可以遗传操纵植物和鉴别荚数增加的新基因型，所述策略的困难在于新基因型需要保持多产性，即使是在环境压力下，因此虽然一种基因型可能在多水的环境下有良好的产量，但其可能在干旱条件下表现得特别差。对所有这些方法还要考虑成本和最终用户(例如农民)使用的简易性的问题。
在US6242384B1中公开了氧化氮(NO)能增强植物的生长，特别是导致提高作物性能。NO施用，特别是以硝普酸钠的形式施用，已证明能增加叶绿素水平，因而导致植物细胞光合作用能力更强，以及增加保护色素如花青甙和类黄酮的水平。在此文献中未建议施用NO或NO产生系统影响花、果实和/和荚的保留(脱离)。也未提及对裂芽、开花、座果的影响。
近来已确定氧化氮是在与重要的植物调节剂如脱落酸(AbA)和乙烯、脱离中的关键调节剂有关的信号通道内发挥作用的分子，因此增加植物内的NO水平被认为是一种调节植物的脱离现象的可能方式。然而，NO是气态的，因此不能用于叶面喷洒。
在人类中，已发现可将联合充当NO产生系统的维生素C(抗坏血酸；AsA)和亚硝酸钠(NaNO2)的混合物作为凝胶施加到皮肤上，用作对基础NO缺乏病症的治疗。例如，含有KY jellyTM、NaNO2(5％重量/体积)和AsA(5％重量/体积)的凝胶被用于治疗雷诺氏综合征中的内皮功能障碍，该病症由内皮衍生的松弛因子的合成降低或失活加速导致(Tucker AT，第The Lancet 1999；3541670-1675)。
意外的是，我们已发现施用含有至少一种氧化氮产生剂如NaNO2的组合物可导致荚数和/或豆产量增加，因而是一种解决由于花和果实的低产量和/或其高脱离率而使作物产量降低的问题的简单、便宜、有效、无毒和无环境危害的办法。
我们还已发现与未喷洒的芽相比，向休眠的葡萄芽施用含有至少一种氧化氮产生剂例如NaNO2的组合物，显著地诱导早期裂芽。因此，这是一种简单、便宜、有效、无毒和环境友好的方法，可替代落叶果树和藤本植物开花和产生果实通常需要的冷期。替代此类物种的低温要求可令地中海地区较早结果和沙漠或热带地区产生更高质量的果实。
发明内容
本发明一方面提供了含有至少一种氧化氮产生剂的组合物用于增加植物器官的产量和/或保留的应用。
抑制器官脱离导致荚产量增加，荚是有商业价值的终产物，特别是在豆科植物中。如上所述，抑制器官的脱离可通过降低乙烯水平和/或增加NO水平来实现。
因此，在本发明的优选实施方案中，组合物抑制植物的器官脱离。更优选器官选自花、果实、荚和种子。
在本发明另一优选实施方案中，组合物诱导种子萌发和/或植物裂芽。
NO不能直接作为叶面喷洒施用，然而已发现将含有充当NO产生剂的亚硝酸钠(NaNO2)的组合物施用于植物可增加作物产量，同时是无毒且节省成本的解决办法。
优选NaNO2的浓度低于约2mM。更优选NaNO2的浓度低于约500μM。更优选NaNO2浓度为约200μM。
在本发明的可供选择的实施方案中，可使用其他亚硝酸盐，例如亚硝酸钾(KNO2)。
在本发明的另一实施方案中，氮产生剂是尿素(CH4N2O)。
在本发明的可供选择的实施方案中，NO产生剂是氮供体试剂，所述氮供体试剂产生化合物，间接产生NO。
当使用氢供体试剂以还原NaNO2时，NaNO2对作物产量增加的作用是在统计上显著的。
因此，在本发明的另一优选实施方案中，组合物含有氢供体试剂。
适宜的氢供体试剂的实例是抗坏血酸(AsA；C6H8O6；维生素C)。NaNO2和AsA间产生NO的化学反应如下所示NaNO2+C6H8O6→NaC6H6O6+H2O+NO在本发明的优选实施方案中，AsA的浓度低于约2mM。更优选AsA的浓度低于约500μM。更优选AsA浓度为约100μM。
在本发明的另一优选实施方案中，组合物含有NaNO2和AsA组合。
替代AsA的其它氢供体试剂是本领域技术人员已知的。
在本发明的另一优选实施方案中，组合物在开花前施用于植物。更优选组合物的施用持续至座荚。
在本发明的可供选择的实施方案中，在开花时将组合物施用于植物。更优选组合物的施用持续至座果和/或座荚。
本发明的组合物还可用于在收获后加工的不同阶段中保持花、叶、果实或其他器官，所述不同阶段如包装、运输、储藏等。优选，对于产生乙烯的跃变期果实，将组合物装于小袋或小球中，令反应试剂与冷藏室或容器的环境湿度接触。另一种延长花、叶、果实或其他器官寿命的方法是在收获后加工的不同阶段防止细菌和真菌感染和控制乙烯产生以及色素和细胞壁分解，因此本发明另一方面提供了一种含有AsA和NaNO2组合的小袋。
在本发明的另一优选实施方案中，组合物被喷雾施用于植物。更优选组合物是水溶性的，因而喷雾液是水基的。喷雾液可施用于叶、苗、果实或植物的任何其他地上生长部分或这些部分的组合。
在本发明的可供选择的实施方案中，将组合物内吸施用于植物，例如通过根系。组合物可以例如水溶性球/胶囊的形式施用于栽培介质(例如土壤或溶液培养的培养物)。由于NaNO2和AsA间的反应是自发的，并且导致立即产生NO，因此NaNO2和AsA必须分别保存在小球/胶囊中，仅在需要产生NO时合并。例如，AsA本身可密封在水溶性胶囊中，而所述水溶性胶囊处于基本(primary)的球/胶囊中。
在本发明的可供选择的实施方案中，组合物可包含溶液，将其施用于栽培介质例如土壤或溶液培养的培养物。
在本发明的另一可供选择的实施方案中，将组合物以凝胶的形式施用于例如根、茎、芽和分生组织。
组合物的内吸施用也已证明对根发育有显著作用。
优选本发明的植物是作物。
在本发明的优选实施方案中，作物是豆科植物。豆科植物包括菜豆和豌豆、瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆。更优选豆科植物是菜豆(Phaseolusvulgaris)。
在本发明的另一优选实施方案中，作物是结果的作物。优选果实是软皮的，选自苹果、梨、仙人掌、桃、李子、杏、葡萄、樱桃、橙、黑莓、大扬莓、覆盆子、草莓、醋栗、柠檬、桔、来檬、葡萄柚、橄榄、海枣、香蕉、葫芦科(例如甜瓜和西瓜)、凤梨、鳄梨、无花果、番荔枝(chirimolla)、guayava、芒果、橄榄、木瓜、西红柿、胡椒。
在本发明的另一优选实施方案中，果实是硬壳的(即坚果)。优选坚果选自胡桃、杏仁、开心果、松子、山核桃、胡桃、巴西坚果、腰果、澳大利亚坚果、榛子、椰子、可可豆、咖啡豆。
在本发明的另一优选实施方案中，作物是藤本植物，优选葡萄藤(Vitis vinifera L)。本发明的组合物已证明能促进葡萄的裂芽，因而使得藤上早结葡萄。
在本发明的另一优选实施方案中，植物是谷物，例如玉米(Zeamays)、小麦(Tritium asestivum)、大麦、稻(Orzya sativa)、高梁(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、黑麦(Secale cereale)、燕麦等。
在本发明的另一优选实施方案中，植物是含油种子植物，例如棉花(Gossypium hirsutum)、大豆(Glycine max)、红花、向日葵(Helianthus annus)、芸苔、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。
本发明适用的其他园艺作物包括莴苣、菠菜、菊苣、芸苔植物(例如卷心菜、椰菜、菜花)、烟草、胡萝卜、马铃薯、甘薯、木薯、茶、糖用甜菜。
本发明的组合物还可用于保持观赏植物的花，尤其是例如用于保持花瓶中的鲜切观赏植物的开花时间。因此，在本发明的另一优选实施方案中，植物是观赏植物。优选，对于鲜切观赏花卉，组合物保持粉末或丸的形式，所述粉末或丸可溶解于展示花卉所在的水或营养溶液中。
本发明另一方面提供了一种抑制植物中器官脱离的方法，包括i)向植物施用含有至少一种氧化氮产生剂的组合物。
在本发明的优选方法中，氧化氮产生剂是NaNO2或其功能变体。
更优选组合物还含有氢供体试剂。更优选此氢供体试剂是AsA。
优选NaNO2的浓度低于约2mM，AsA的浓度低于约2mM。更优选NaNO2浓度是大约200μM，AsA浓度是大约100μM。
本发明另一方面提供了一种含有AsA和NaNO2组合的组合物。优选NaNO2浓度低于约2mM，AsA浓度低于约2mM。更优选NaNO2浓度是大约200μM，AsA浓度是大约100μM。
本发明另一方面提供了一种含有AsA和NaNO2组合的组合物，其中该组合物不是凝胶。在本发明的优选实施方案中，NaNO2浓度低于约2mM，AsA浓度低于约2mM。更优选NaNO2浓度是大约200μM，AsA浓度是大约100μM。
当鲜切花展示于容器如花瓶中时，通常将植物养料/花卉防腐剂(一般以小袋形式提供)溶解于水中以图延长花卉的寿命。当花卉在花瓶中时，所述花卉防腐剂通常含有糖和酸化剂以尽可能长时间地“喂养”鲜切花，和杀生剂(例如氯气)以防止细菌使花卉腐烂。另一种延长花卉寿命的方法是抑制花卉脱离，因而本发明另一方面提供了一种含有AsA和NaNO2组合的小袋。在本发明的优选实施方案中，AsA的浓度范围是大约50μM至150μM，NaNO2的浓度范围是约150μM-250μM。更优选AsA浓度是大约100μM，NaNO2浓度是大约200μM。优选AsA和NaNO2是粉末形式并且可溶解于水。
尽管AsA和NaNO2可以小袋形式施用，但将其结合植物养料/花卉防腐剂一起提供是有利的，因此本发明另一方面提供了一种含有AsA和NaNO2组合的植物养料。
当将含有NaNO2和AsA的组合物施用于大面积植物例如田间作物时，优选将组合物与其他试剂如农药(例如杀菌剂或杀虫剂)或肥料/花卉营养素同时施用。在本发明的优选实施方案中，植物养料是农药。
本发明的实施方案将通过实例仅进行举例说明，参考下列材料、方法和实施例。
图1说明喷洒NaNO2、AsA和AsA/NaNO2混合物对每株菜豆栽培品种Orfeo植物的豆荚数的影响(两试验分别示于
图1a和1b)。
图2说明AsA/NaNO2混合物的不同的喷洒次数对两种菜豆品种的影响；Arroz Tuscola和Orfeo INIA，根据(A)累积生物量；茎干重(图2a)；叶干重(图2b)和豆荚干重(图2c)；(B)产量组成部分；豆荚数(图2d)；每荚的谷粒数(图2e)；100颗谷粒的重量(图2f)和(C)谷物产量；每株植物的种子重量，即谷物产量(图2g)。
图3说明施用于葡萄藤栽培品种Sultana的AsA/NaNO2混合物的两种不同喷洒剂量对裂芽开始的影响(以总芽百分比表示)。
图1说明当喷雾施用于菜豆栽培品种Orfeo INIA时，AsA或NaNO2单独都对产量没有任何影响，但AsA/NaNO2混合物使产量显著增加(荚数/植株和种子数/植株)。
图2说明了在开花前用AsA(100μM)和NaNO2(200μM)的混合物喷洒4周后，菜豆栽培品种Arroz Tuscola和Orfeo INIA的茎干重(图2a)；叶干重(图2b)；荚干重(图2c)；荚数(图2d)；每荚谷粒数(图2e)；100颗谷粒重量(图2f)；和谷物产量(图2g)。喷洒按照下列频率进行对照(T1)无喷洒；(T2)用AsA/NaNO2混合物喷洒3次；(T3)用AsA/NaNO2混合物喷洒5次；(T4)用AsA/NaNO2混合物喷洒7次。喷洒每周进行，开花前±30天开始。当大约50％花开放时，认为是开花时间。当豆荚变黄并干燥(14％湿度)时为收获时间。
图3说明了在喷洒后22天(a)、27天(b)和32天(c)时，施用于葡萄藤栽培品种Sultana的AsA/NaNO2混合物的两种不同喷洒剂量对裂芽开始的影响(以总芽百分比表示)。AnRos1＝AsA(100μM)+NaNO2200μM；AnRos2＝AsA(100μM)+NaNO2500μM。对照不接受任何处理。还显示了氰胺(H2CN2)的作用。AsA/NaNO2使葡萄藤的裂芽开始时间提前几天。22天后，对照组无芽裂，但喷洒组有10％，27天后喷洒组有60％，而对照组仅有20％。效果不如氰胺那么强，氰胺是一种目前工业化的处理，但此试剂是有毒的并且在使用时需要严格的防护措施。
材料和方法实施例1在2001年南半球春季(Southern Spring)期在圣地亚哥的智利大学的试验站，将菜豆栽培品种Orfeo INIA植物种植在相隔80cm的苗行中，密度为10株植物/m。每周两次用足量的水浇灌植物以避免任何发育阶段缺水。按照经济作物推荐标准控制植物卫生、杂草和肥料情况。
对一月龄的植物每周进行喷洒，持续两个月，直至座荚，喷洒用200μM的NaNO2；100μM的AsA和100μM/200μM的AsA/NaNO2混合物。对照植物用水喷洒。结果示于
图1a和1b。
实施例2在2002年南半球春季期在圣地亚哥的智利大学的试验站，将菜豆栽培品种Arroz Tuscola和Orfeo INIA植物种植在相隔80cm的苗行中。每周两次用足量的水浇灌植物以避免任何发育阶段缺水。按照经济作物推荐标准控制植物卫生、杂草和肥料情况。
开花前4周按照下列频率喷洒AsA 100μM和NaNO2200μM的混合物●对照(T1)无喷洒●T2用AsA/NaNO2混合物喷洒3次
●T3 5次●T4 7次喷洒每周进行，在开花前±30天开始。当大约50％花开放时，认为是开花时间。当豆荚变黄并干燥(14％湿度)时为收获时间。
统计设计4个处理，分布在两个田块中，重复4次。每次重复是收获6株植物用于分析。因此，每个处理总计收获24株植物。数据进行方差分析，当发现差异时，进行邓肯试验以检测特定处理间的差异。结果示于图2(a-g)。
实施例3在2003年5月末(南半球的秋季)，从位于智利大学的Antumapu实验站的葡萄园中采集葡萄藤栽培品种Sultana的插条，每个插条上有三个休眠的芽。插条用杀菌剂处理后，用塑料包起来，在黑暗和7℃冷藏室白天/黑夜条件下放置一周。之后用下面的溶液喷洒a)AsA(100μM)+NaNO2200μM(图，AnRos1)b)AsA(100μM)+NaNO2500μM(图，AnRos2)c)H2CN22.5％对照插条不接受任何处理。
喷洒后，将每个处理的12个插条放在生长室内，置于溶液培养条件下，并保持在白天和夜间25℃±1℃温度下和12小时光照期内100μmol量子m-2s-1的光照强度下以促进其发芽。
自发现第一个芽开始生长开始，每天登记芽裂数目。此时刻视为芽裂的起始。
权利要求
1.一种含有至少一种氧化氮产生剂的组合物用于增加植物器官的产量和/或保留的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中的组合物抑制器官脱离。
3.如权利要求1所述的用途，其中的组合物诱导植物芽裂。
4.如权利要求1所述的用途，其中的植物器官选自花、果实、荚或种子。
5.如权利要求1所述的用途，其中的氧化氮产生剂是亚硝酸钠(NaNO2)或其功能变体。
6.如权利要求5所述的用途，其中的NaNO2的浓度低于约2mM。
7.如权利要求6所述的用途，其中NaNO2的浓度低于约500μM。
8.如权利要求7所述的用途，其中NaNO2的浓度为约200μM。
9.如权利要求1所述的用途，其中氧化氮产生剂是尿素。
10.如权利要求1所述的用途，其中组合物还含有氢供体试剂。
11.如权利要求10所述的用途，其中的氢供体试剂是抗坏血酸(AsA；C6H8O6；维生素C)或其功能变体。
12.如权利要求11所述的用途，其中AsA的浓度低于约2mM。
13.如权利要求12所述的用途，其中AsA的浓度低于约500μM。
14.如权利要求13所述的用途，其中AsA的浓度为约100μM。
15.如权利要求11-14中任一项所述的用途，其中组合物含有NaNO2和AsA的结合或其功能变体的组合。
16.如权利要求15所述的用途，其中NaNO2的浓度是大约200μM，AsA的浓度是大约100μM。
17.如权利要求1-16中任一项所述的用途，其中将组合物在开花前施用于植物。
18.如权利要求17所述的用途，其中将组合物持续施用于植物直至座果/座荚。
19.如权利要求1-16中任一项所述的用途，其中组合物最初在开花时施用。
20.如权利要求17所述的用途，其中将组合物持续施用于植物直至座果/座荚。
21.如权利要求1-20中任一项所述的用途，其中在收获后施用组合物。
22.如权利要求1-21中任一项所述的用途，其中的组合物是水溶性的。
23.如权利要求1-22中任一项所述的用途，其中的植物是作物。
24.如权利要求23所述的用途，其中的作物是豆类植物。
25.如权利要求24所述的用途，其中的豆类植物是菜豆(Phaseolus vulgaris)。
26.如权利要求23所述的用途，其中的作物是产果实的。
27.如权利要求26所述的用途，其中的植物是藤本植物。
28.如权利要求27所述的用途，其中的藤本植物是葡萄藤。
29.如权利要求1-22中任一项所述的用途，其中的植物是观赏植物。
30.一种抑制植物中的器官脱离的方法，包括如下步骤i)向所述植物施用含有至少一种氧化氮产生剂的组合物。
31.如权利要求30所述的方法，其中的氧化氮产生剂是NaNO2或其功能变体。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中的组合物还含有氢供体试剂。
33.如权利要求32所述的方法，其中的氢供体试剂是AsA。
34.如权利要求33所述的方法，其中NaNO2的浓度低于约2mM，AsA的浓度低于约2mM。
35.如权利要求34所述的方法，其中NaNO2的浓度是大约200μM，AsA的浓度是大约100μM。
36.一种含有AsA和NaNO2组合的组合物，其中NaNO2的浓度低于约2mM，AsA的浓度低于约2mM。
37.如权利要求36所述的方法，其中NaNO2的浓度是大约200μM，AsA的浓度是大约100μM。
38.一种含有NaNO2和AsA组合的组合物，其中该组合物不是凝胶。
39.如权利要求38所述的组合物，其中NaNO2的浓度低于约2mM，AsA的浓度低于约2mM。
40.如权利要求39所述的组合物，其中NaNO2的浓度是大约200μM，AsA的浓度是大约100μM。
41.一种含有AsA和NaNO2组合的小袋。
42.如权利要求41所述的小袋，其中NaNO2的浓度低于约2mM，AsA的浓度低于约2mM。
43.如权利要求42所述的小袋，其中NaNO2的浓度是大约200μM，AsA的浓度是大约100μM。
44.如权利要求41-43中任一项所述的小袋，其中AsA和NaNO2是粉末的形式。
45.一种含有AsA和NaNO2组合的植物养料。
46.如权利要求45所述的植物养料，其中NaNO2的浓度低于约2mM，AsA的浓度低于约2mM。
47.根据所附说明书和实施例所述的用途、方法、小袋或植物养料。
全文摘要
本发明公开了含有至少一种氧化氮产生剂的组合物用于增加植物器官的产量和/或保存的用途。
文档编号A01N59/00GK101056536SQ200580031000
公开日2007年10月17日 申请日期2005年7月20日 优先权日2004年7月27日
发明者A·A·里奎尔米埃斯克巴, M·平拖, P·赫顿 申请人:设菲尔德大学, 智利大学