专利名称：油菜含油量性状主效基因位点及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域。更具体涉及一种油菜含油量性状主 效基因位点及主效基因位点紧密连锁的分子标记，同时还涉及分子标记在油菜含油量育种 中的应用。
背景技术：
作为世界四大油料作物之一，油菜生产对保障我国食用植物油脂和饲用蛋白质的 有效供给，对改善食物结构，促进养殖业和加工业发展等诸方面均有重要影响。虽然我国油 菜种植面积和产量均居世界第一，但远不能满足国内的消费需求，63%左右的食用植物油 依赖进口。随着人口数量的增长和人民生活水平的提高，预计到2010年我国食用植物油消 费量将增加到2，500万吨，按目前的生产规模，缺口将更加巨大。尽管油料市场需求如此， 农民种植油菜的积极性却不高。造成这种局面的主要原因之一是我国的油菜籽比主要出口 国加拿大生产的油菜籽含油量5个百分点左右，且成本高，市场竞争力相对较弱。因此，从 保障食物油供给安全和增加农民收入的角度考虑，较大幅度增加单位面积菜籽油的产出量 是解决目前状况的对策之一。我国油菜研究和育种工作具有较深厚的基础，一些领域处于世界领先地位。油菜 高油分育种的途径主要有多世代的单株选择、种间杂交、黄籽油菜育种和诱变选育。近年来，随着基因组学研究取得一系列突破，以分子标记选择、转基因和品种分子 设计为代表的分子育种技术的成功应用，大大提高了作物遗传育种水平。与常规育种相比， 该技术可以通过分析与目标性状基因紧密连锁的分子标记判断目的基因的存在与否，并进 行精细定位。同时，利用分子标记进行辅助选择育种，减少了盲目性，缩短育种年限，大大提 高了选择效率。分子标记辅助选择育种技术的关键是与重要农艺性状紧密连锁的DNA分子 标记的鉴定。美国、日本、西欧各国等国家近年都投入巨资开展这方面的工作。伴随着水稻， 小麦、玉米、棉花、大豆等重要作物的一些农艺性状的分子标记的开发，利用鉴定到的分子 标记进行辅助选择育种主要包括种质资源的鉴定、基因定位、基因累加或聚合、异源目的基 因的筛选和鉴定以及遗传图谱的构建等，育种目标包括抗病、抗虫、抗旱、高产、品质改良等 各个方面。随着生物技术的发展，油菜分子标记的研究日渐受到关注，研究的领域涉及遗传 图谱的构建、基因标记和基因定位、亲缘关系分析、品种纯度鉴定、标记辅助选择等多方面， 并取得了重要进展。但与发达国家相比，我国的油菜分子育种研究工作还有较大差距，主要 体现在不能有效地发掘和利用种质资源中的有利基因，缺乏有自主知识产权及育种价值 的基因和标记等。目前常用的分子标记技术大致可分为两种，一种是基于southern杂交技术， 另一种则以PCR技术为核心。Grodzicker等(1974)创立了限制性片段长度多态性 (restrictionfragment length polymorphism, RFLP)标记技术。Botstein 等(1980)首先 提出用限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，简称RFLP) 作为遗传标记构建遗传图谱的设想，从而开创了利用分子标记作为遗传标记的新时期。随后几十种基于Southern杂交或聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)的DNA 分子标记技术陆续建立，这些DNA分子标记所检测的多态性在基因组的位置大多为随机分 布，因此可以通称为随机DNA分子标记(random DNA markers, RDMs)。RDMs的发展大大提 高了人们对基因组多样性、遗传作图等的研究效率，并广泛的应用于植物科学的研究中。大多数重要的农艺性状均表现数量性状的遗传特点，如产量性状、成熟期、品质、 抗旱性等。数量性状易受环境条件的影响，因此选择效果不好。传统育种方法周期长，主要 是由数量性状造成的。由于分子标记技术的发展，人们已可将复杂的数量性状进行分解，象 研究质量性状基因一样对控制数量性状的多个基因进行研究。QTL是在高密度的遗传图谱 基础上，通过一定实验设计，获得分子标记，借助Mapmarker软件分析确定控制某一性状的 基因在染色体上的位置。当目标性状由少数几个基因控制时用标记选择，对发掘遗传潜力 非常有效。目前对油菜种子含油量的QTL定位研究也有一些报道，通常检测出的QTL数目较 多，但效应值较小，较难在油菜育种中应用。本研究通过遗传分析及QTL定位，旨在筛选对 种子含油量具有正向效应的QTL，用于油菜含油量的标记辅助选择。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种油菜含油量性状的两个主效基因位点。主效基因 位点不但有助于深入了解zy036品系中含油量QTL位点的作用和分布，同时为今后主效基 因的克隆提供了一定的基础。本发明的另一个目的在于提供了一种油菜含油量性状两个主效基因位点紧密连 锁的分子标记。与含油量紧密连锁的分子标记对今后zy036及其衍生品系的含油量性状育 种提供了极大的便利。本发明的再一个目的是在于提供了一种油菜含油量性状的主效基因位点 Bn0CN22-l在油菜高含油量性状育种中的应用。本发明的还一个目的是在于提供了一种油菜含油量性状的主效基因位点 Bn0CN22-2在油菜高含油量性状育种中的应用。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施一种油菜含油量性状主效基因位点的发掘方法，它包括如下步骤a)利用油菜高低含油量组合zy036(51%)和Y817(35%)进行杂交，Fl代自交产 生F2代分离群体；b)提取亲本zy036和Y817、F1代及F2代分离群体的叶片总DNA，过程中所用到的 试剂包括CTAB提取液(0. 2M Tris-Cl, 0. 25NaCl,25mM EDTA,0. 5% (质量比)SDS，pH 7. 5)、 氯仿、异戊醇、无水乙醇；c)搜集油菜 SSR标记公开数据库(http://www. ukcrop. net/Brassica DB)并自主 开发SSR标记、含油量相关的基因标记，利用亲本筛选多态性引物。过程中所用到的主要试 剂包括Taq酶、dNTP、丙烯酰胺、尿素、冰醋酸、AgN03等；d)通过在F2代分离群体中的分布构建遗传图谱，借助含油量数据进行QTL位 点分析，并得到与含油量性状主效基因紧密连锁的SSR标记或者含油量相关的基因标记， 得到了 Bn0CN22-l和Bn0CN22_2。过程中所用到的主要软件包括Joinmap3. 0、WinQTLcart4. 0 (商业途径获得)。本研究中所用的亲本材料为含油量相差近15个百分点的zy036(51 % )和 Y817(35%)，均由中国农科院油料所生物技术育种课题组技术人员在王汉中研究员带领下 育成。zy036品系是由中双4号、中双7号、中双9号、华双3号、油研9号构建轮回选择群 体，轮回选择两代后选优良单株进行小孢子培养轮回选择第三代，最终经高油定向选择得 到(所有权归本课题组所有)。Y817是杂交品种中油杂1号的保持系(中油杂一号制种技 术研究与应用，农村经济与科技，2001年第10期)。油菜两亲本、Fl及F2分离群体单株含 油量的测定由近红外分析仪完成，植物叶片总DNA的提取、PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳均为 常用的分子生物学技术，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或 Draper 等人(Blackwell 禾斗学出 版社，1988)所述的条件进行。实验过程中涉及的所有试剂成分如均可从商业途径获得，并 按照实验手册中的条件或所用试剂制造厂商所建议的条件使用。利用上述技术措施，申请人最终获得了含油量性状相关两个主效基因位点，具体 如下Bn0CN22-l，该主效基因位点位于第22连锁群，由BN6A2-1 (自主开发SSR 标记)定位，其引物序列为 BN6A2-1F CTTTGTGTGGACTTTTAGAACTTTA, BN6A2-1R CGCAGCTTTTGGCCCACCTG。利用Joinmap3. O软件分析测得与含油量性状不相关的概率P值 为0. 000，贡献率为12. 39% ； Bn0CN22-2，该主效基因位点位于第22连锁群，由标记0a55_l (自主开发 基因标记)定位，其引物序列分别为0a55-lF GGTTCCAAAGGAAGGAATGCC, 0a55_lR CCGACCAAACAGGATACAAC。利用Joinmap3. 0软件分析测得与含油量性状不相关的概率P值 为0. 000，贡献率为8. 46%。含油量主效位点Bn0CN22-l和Bn0CN22_2在油菜含油量育种中的应用利用中油036高油品系与另一抗倒伏高产但含油量仅为38%左右的品系杂交后 种植F2代，在F2代苗期利用Bn0CN22-l和Bn0CN22_2两位点的分子标记BN6A2-1和0a55_l 引物进行分子鉴定。种子收获后的含油量测试结果表明，通过分子标记辅助选择得到的植 株含油量超过45%的占57%。在保留下来的植株中再借助抗倒仪和测千粒重的方法筛选 抗倒伏高产的株系。通过鉴定上述主效基因位点来预测油菜种子含油量，可迅速提高油菜 高含油量品种的育种进程。本发明的优点在于本发明首次定位了油菜品系zy036中的2个影响含油量性状主效基因位点，它们 可共同解释含油量20%的变化，使得油菜含油量性状主效基因位点的定位工作居于同领域 前列。传统育种方法中，表型鉴定要等到收获种子测定含油量，且受环境影响较大。因此含 油量育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测含油量性状主效QTL位点，可以在苗期 进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本发明中含油量主效基因位点位置 明确，主效基因位点的检测方便快速，不受环境影响。通过检测与含油量性状相关的分子标 记，即可以预测含油量的高低，进而可以快速筛选高含油量株系用于油菜含油量育种，辅助 育种选择目标明确，节约成本。
图1武汉F2群体含油量分布图。结果表明含油量表现分布呈连续性分布，变异分 布呈正态分布，且变异范围很宽，证明含油量属于数量性状。图2位于第22连锁群上的QTL位点。图中*号表示分别为第22条连锁群上的 Bn0CN22-l和Bn0CN22-2两个主效基因位点，其中Bn0CN22-2的连锁分子标记为IFLP标记， Bn0CN22-l 为 SSR 标记。图3为Bn0CN22-l和Bn0CN22-2两个含油量性状主效基因位点的分析。图4分子标记marker0a55-l在F2代株系中的筛选。图中1、2、5、8号为高含油量株系。
具体实施例方式通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)，gJc Draper 等入(Blackwell 禾斗学出片反社， 1988)所述的条件，或按照所用试剂制造厂商所建议的条件。实施例1.高低含油量油菜品系组合F2分离群体的构建及含油量的测定本实施例中使用的群体为高低含油量亲本(含油量分别为51%的zy036和35% 的Y817)杂交后代一F2代。亲本、Fl及F2种子含油量由近红外分析仪测定。F2代分离群 体含油量数据分布结果表明含油量表现分布呈连续性分布，变异分布呈正态分布，且变异 范围很宽，证明含油量属于数量性状(图1)。实施例2.亲本、Fl及F2分离群体叶片总DNA的提取利用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下A.适量叶片样品取自超低温冰箱(-70°C )，立即放入冰冻过的研钵中，加入液 氮研磨成粉状；快速装入50ml离心管中，加入在60°C的水浴锅中预热过的提取液(0.2M Tris-Cl, 0. 25NaCl,25mM EDTA,0. 5% (质量比)SDS，ρΗ 7.5)，混合均匀，放入 60°C 的水浴 锅中水浴40min ；B.取出离心管，加入等体积氯仿异戊醇(24 1，V/V)，缓慢上下颠倒离心管 30-50次，使充分混匀，1300g离心10分钟；C.取上清于另一离心管中，加入等体积氯仿异戊醇(24 1，V/V)，重新抽提 一次。取上清加入0.6倍体积冰冷异戊醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结为止。 静止30min，挑出沉淀，70% (体积比)酒精洗2-3次，无水乙醇洗一次，干燥后加无菌水 650C 20min 溶解；D.再次加入等体积氯仿异戊醇(24 1，V/V)，重新抽提。取上清，加入0.1倍 NaAc (3mol/L, PH5. 2)，混勻后缓慢加入2倍体积的冰无水乙醇，静止5min后缓慢转动离心 管直至絮状沉淀出现，挑出沉淀转入1.5ml离心管中，70%(体积比)酒精洗2-3次，无水乙醇洗一次，干燥后加无菌水溶解，于-20°C冰箱中保存备用。实施例3.引物的开发及多态性的筛选根据已报道的SSR标记引物以及自主开发的含油量相关的功能基因设计的分子 标记进行引物的筛选。筛选结果表明，有180对引物在双亲间有差异。多态性筛选程序如 下
(1)自父母本中各随机选择5株的DNA模板等量混合，构成两个亲本的DNA样本用来筛选引物。
(2)PCR体系及程序
i0 X buffer(MgCl2 free)lul
dN／Ps mixture(IOmM)0．2ul
Left primer(50ng／u1)lul
Right primer(50ng／u1)lul
／aq polymerase(5U／u1)0．1u
MgCl2(25mM)0．8ul
油菜总DNA2ul
ddH205．9ul
一一
total10ul
PCR反应程序
94℃4min
94℃30s
60℃30s
72℃lmin 10cycles(一0．5℃／cycle)
940C30s
55℃30s
72℃lmin 30cycles
72℃5min
(3)凝胶电泳
试剂配制
6％(质量比)PAGE胶6％(质量比)丙烯酰胺，7mol／L尿素，0．5 X TBE缓沖液，灌胶前加入300ul 10％(质量比)NH4S204，30ulTEMED；10 X／BE／ris—base 108g，硼酸55g，0．5MEDTA(PH8．0)40ml，定容至1000m1．使用时稀释为0．5 X TBE工作液。
PAGE胶制备
胶板用lo％(质量比)NaOH溶液浸泡24小时，洗淨，凉干。长胶板用餐巾纸均匀涂抹反硅烷化剂(AMMMRESCO)，短胶板涂抹lml硅烷化剂{0．5％(体积比)冰醋酸，1．5m195％(体积比)乙醇，卜2ul硅烷化剂}，放置5分钟后，用95％(体积比)的乙醇轻轻洗擦以除去多余的反硅烷化剂和硅烷化剂。将玻璃装好，并以边条隔开，小心套入制胶夹(GIBCOflBRL)中。准备就绪后在短胶板上用注射器将50ml(长胶板80m1)变性胶混合液，缓慢注入，以免产生气泡。插入梳子，并用夹子夹牢，凝聚2小时后即可电泳。
电泳
从制胶夹中取出胶板，擦淨玻璃外侧，固定于电泳槽上，上下槽各加500ml0．5 X TBE缓沖液，将梳子拔出后立即冲洗点样孔，接通电源1500伏恒压预热30min。在PCR产物中加入等体积的上样缓沖液[98％(体积比)去离子甲酰胺，10mmol／L EDTA，0．005％(质量比)二甲苯青FF，0．005％(质量比)溴酚蓝]，95℃变性5分钟，冰浴冷却，上样5ul，1800伏恒压电泳80min。当二甲苯青FF到达2/3胶板时停止电泳。染色采用银染法进行染色10% (体积比)冰醋酸固定至胶板无色，ddH20漂洗两次，每次2-3分钟。然后染色0. lAgN03，0. 56%甲醛(体积比)30分钟。取出胶板，在ddH20 漂洗10s，再在预冷(4°C )的显影液[3% (质量比)Na2C03，0. 56 (体积比)％ HCHO, 2mg/ LNa2S203. 5H20]中轻轻摇动至条带清晰可见，然后倒入中止液[10% (体积比)冰乙酸] 中，停止显影。用蒸馏水漂洗3分钟，室温(20-25°C以下相同)下自然凉干，拍照保存。实施例4.多态性引物在F2群体中的分布及连锁性分析在亲本中筛选到有多态性的引物后，分析其在F2群体中的分布。通过在F2代分 离群体中的分布进行数据分析，根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建油菜的遗传 图谱，所用软件为J0inmap3. 0，最小LOD值设为2. 5，获得连锁图谱(图2为第22条连锁群 图谱)。将F2群体的200个单株的含油量数据及多态性引物的分布情况输入计算机，运行 WinQTL cart4. 0软件对数据进行关联性分析，单向方差分析测得与含油量性状相关的概率 P值和位点对含油量性状的贡献率(表2，图3)。结果表明，P < 0. 01的分子标记即与一个 主效基因位点连锁(表1)。表1标记引物的序列
权利要求
一种分离油菜含油量性状的基因位点，其特征在于BnOCN22 1主效基因位点位于第22连锁群，主效基因位点为BN6A2 1，其引物序列为BN6A2 1FCTTTGTGTGGACTTTTAGAACTTTA，BN6A2 1RCGCAGCTTTTGGCCCACCTG。
2.一种分离油菜含油量性状的基因位点，其特征在于Bn0CN22-2主效基因位 点位于第22连锁群，标记主效基因位点为0a55-l，其引物序列分别为0a55-lF GGTTCCAAAGGAAGGAATGCC, 0a55_lR :CCGACCAAACAGGATACAAC。
3.权利要求1所述的一种油菜含油量性状的主效基因位点Bn0CN22-l在油菜高含油量 性状育种中的应用。
4.权利要求2所述的一种油菜含油量性状的主效基因位点Bn0CN22-2在油菜高含油量 性状育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种油菜含油量性状主效基因位点及应用，步骤包括1)利用高低含油量组合zy036(51％)和Y817(35％)杂交获得含油量性状分离的F2代群体；2)利用亲本筛选多态性引物，通过在F2代分离群体中的分布构建遗传图谱，根据F2群体的含油量数据获得含油量性状紧密连锁的分子标记并得到主效基因位点。本发明公开了同一连锁群上两个控制油菜zy036高含油量性状主效基因位点BnOCN22-1和BnOCN22-2，同时公开了与主效基因位点紧密连锁的2个分子标记。通过紧密连锁的分子标记检测zy036及其衍生品种(系)中是否含有该主效QTL位点，可预测其含油量高低，大大提高了含油量育种的选择效率。
文档编号A01H1/04GK101988118SQ20091006348
公开日2011年3月23日 申请日期2009年8月7日 优先权日2009年8月7日
发明者刘贵华, 刘静, 华玮, 孙美玉, 杨庆, 王新发, 王汉中, 黄顺谋 申请人:中国农业科学院油料作物研究所