专利名称：一种植物叶倾角调控基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及一种植物叶倾角调控基因、其用途以及调控植物叶倾角大小的基因工程方法。
背景技术：
水稻是重要的粮食作物，同时也是单子叶植物的模式植物。育种实践表明，水稻株型与产量密切相关，理想的株型是高产的形态和物质基础。水稻叶倾角通常是指叶片和植株茎杆之间的夹角，是构成水稻株型的重要组成部分。叶倾角的大小特别是剑叶倾角的大小对水稻的光合生产量有很大影响研究表明，叶片直立有利于叶片两面受光，减少阳光反射率，增加透光度，并促进种子灌浆时期的氮源储藏增加，从而增加产量，剑叶直立更是被看作改善群体光照的重要条件，直接影响到稻穗的营养转化，因此剑叶直立是理想株型的一个指标。水稻的第一片叶为不完全叶，仅有叶鞘，以后各叶都具有叶片和叶鞘。叶片基部存在白色缺少叶绿素的带状部分，叫叶枕。这部分组织主要由中脉组成，也有少量叶片组织存在。在水稻发育过程中，叶片和叶鞘充分伸长之后，叶枕部位近轴面的细胞开始延伸，从而使叶片从叶鞘的垂直轴弯向远轴端，弯向叶鞘形成叶倾角。已有的研究表明叶倾角发育受到分子水平和激素特别是油菜素内酯等多方面的调控，对倾角形成的分子机理研究有利于指导育种实践。因此，找到调节叶倾角大小的调控基因对于植物改良育种是有积极意义的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物叶倾角调控基因及其用途。在本发明的第一方面，提供一种调节植物的叶倾角大小的方法，所述方法包括调节植物中LCl蛋白的表达。在另一优选例中，所述的植物选自(但不限于)禾本科植物。在另一优选例中,所述的禾本科植物是水稻,小麦,大麦，玉米,高粱。在另一优选例中，所述的LCl蛋白是(a)如SEQ ID NO 2氨基酸序列的蛋白；(b)将SEQ ID NO 2氨基酸序列经过一个或多个(如1_20个；较佳地1_10 ;更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)与(a)限定的蛋白序列有90%以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。在另一优选例中，所述的LCl的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。在另一优选例中，所述方法包括提高植物中LCl蛋白的表达；从而调节植物的叶倾角增大。
在另一优选例中，所述方法包括将编码LCl蛋白的多核苷酸转入植物，获得转化入所述多核苷酸的植物。在另一优选例中，所述方法包括(SI)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有多核苷酸，其编码LCl蛋白；(S2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(SI)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物。在另一优选例中，所述方法还包括(S3)选择出转入了所述的多核苷酸的植物细胞、组织、器官；和(S4)将步骤(S3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。在另一优选例中，所述方法包括降低植物中LCl蛋白的表达；从而调节植物的叶倾角减小。在另一优选例中，所述降低植物中LCl蛋白的表达包括将下调所述LCl蛋白的编码序列表达(或转录)的干扰分子(包括反义分子)转入植物细胞、组织、器官，从而下调植物中LCl蛋白的表达。在另一优选例中，所述方法包括(i)提供携带可干扰基因表达的载体的农杆菌，所述的载体选自下组(a)含有反方向启动的LCl蛋白的编码基因或基因片段(反义分子)的载体；(b)含有可在植物体内形成特异性干扰LCl蛋白的编码基因表达(或转录)的成分的干扰分子的载体；(ii)将植物的细胞、组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物细胞、组织或器官。在另一优选例中，所述方法还包括(iii)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和(iv)将步骤(iii)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。在本发明的另一方面，提供一种植物，由前述任一所述的方法制备获得。在本发明的另一方面，提供一种LCl蛋白或其编码基因的用途，用于调节植物的叶倾角；或用于制备调节植物的叶倾角的材料。在另一优选例中，所述的LCl蛋白或其编码基因用于调节植物的叶倾角增大；或所述的LCl蛋白或其编码基因用于制备调节植物叶倾角减小的材料。在另一优选例中,所述的调节植物叶倾角减小的材料。在本发明的另一方面，提供一种降低LCl蛋白表达的物质的用途，用于调节植物的叶倾角减小。在另一优选例中，所述的降低LC I蛋白表达的物质是干扰所述LCl蛋白的编码序列表达(或转录)的干扰分子(包括反义分子)；或是LCl蛋白的抑制剂、拮抗剂、下调剂。
在另一优选例中，所述的降低LCl蛋白表达的物质是含有反方向启动的LCl蛋白的编码基因或基因片段(反义分子)的载体。在本发明的另一方面，提供一种调节植物的叶倾角减小的物质，其是含有反方向启动的LCl蛋白的编码基因或基因片段(反义分子)的载体。
在本发明的另一方面，提供一种调节植物的叶倾角增大的物质，其是含有编码LCl蛋白的多核苷酸的表达载体。在本发明的另一方面，提供一种LCl蛋白或其编码基因用途，用于作为鉴定植物的叶倾角大小的分子标记。在另一优选例中，若经检测植物组织中LCl蛋白表达高于一个特定值，则相对而言，所述植物的叶倾角减小；若经检测植物组织中LCl蛋白表达低于该特定值，则相对而言，所述植物的叶倾角增大。其中，除非另外说明，所述的“特定值”是指该植物(较佳地为野生型的该植株)中LCl蛋白表达量的平均值。在另一优选例中，检测相同物种不同品种的植物组织中LCl蛋白表达水平，则相对而言，LCl蛋白表达水平较低的植物品种叶倾角较大，LCl蛋白表达水平较高的植物品种 叶倾角较小。此例可作为育种中亲本筛选的方法之一来应用。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图I是水稻叶倾角突变体Icl (右)与野生型(左)材料的表型。图2是突变体Icl中T-DNA的插入位置示意图及PCR验证。图3是突变体Icl中LCl基因表达情况的PCR鉴定。图4 是 pCAMBIA2301-A-LCl 载体图谱。图5是功能互补实验Ttl转基因水稻植株的表型。图6是突变体Icl与互补转基因水稻植株的旗叶的叶倾角的角度统计。图7 是 pCAMBIA1302-LCl 载体图谱。图8是LCl基因过表达转基因水稻植株的表型。图9是LCl基因的DNA核苷酸序列。图10是LCl基因编码的蛋白的氨基酸序列。
具体实施例方式本发明人经过深入的研究，发现LCl基因对植物叶倾角的大小具有调控作用。因此，可以将LCl基因应用于植物的培育中，选育出具有特定品质性状的品种，如选育出高产品种、株型理想的品种或观赏性好的品种。如本文所用，所述的“植物(或作物、农作物)”包括任何种类的植物，只要该植物适合进行基因的转化操作(转基因操作)，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。例如但不限于禾本科的水稻、小麦、大麦、高粱、玉米、黑麦；十字花科芸薹属的大白菜、小白菜；十字花科鼠耳芥属植物，此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更具体地，所述的植物包括(但不限于)小麦、大麦、黑麦、7JC稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、梓檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笑、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝
卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。作为本发明的优选方式，所述的植物是禾本科植物，包括但不限于水稻、小麦、大麦、高粱、玉米、黑麦。如本文所用，所述的“叶倾角”是指植物完全展开的叶子主脉与植株中心轴之间形成的角度。通常，叶倾角以“度(° )”为单位。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的LCl蛋白”或“分离的LCl多肽”是指LCl蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化LCl蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。 本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括LCl蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的LCl蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。任何一种LCl蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，LCl蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的LCl蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长LCl蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长LCl蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。在本发明中，术语“LC1蛋白”指具有LC I蛋白活性的SEQ ID NO 2序列的多肽。该术语还包括具有与LCl蛋白相同功能的、SEQ ID NO :2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括LCl蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与LCl蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗LCl蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含LCl蛋白或其片段的融合蛋白。任何与所述的LCl蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO 2所示的序列的同源性为70%或更高；优选的，同源性为80%或更高；更优选的，同源性为90%或更高，如同源性95%，98%或99% )的、且具有LCl蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。发明还提供LCl蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然LCl蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，“LC1蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO 2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。表I
氨基酸残基代表性的取代优选的取代
Ala(A)Val ；Leu ；IleVal
Arg(R)Lys ；Gln ；AsnLys
Asn (N)Gln ；His ；Lys ；ArgGln
Asp (D)GluGlu
Cys(C)SerSer
Gln (Q)AsnAsn
Glu(E)AspAsp
Gly(G)Pro ；AlaAla
His (H)Asn ；Gln ；Lys ；ArgArg
He (I)Leu ；Val ；Met ；Ala ；PheLeu
权利要求
1.一种调节植物的叶倾角大小的方法，所述方法包括调节植物中LCl蛋白的表达。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的LCl蛋白是 (a)如SEQID NO 2氨基酸序列的蛋白； (b)将SEQID NO :2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或 (C)与(a)限定的蛋白序列有90%以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法包括提高植物中LCl蛋白的表达；从而调节植物的叶倾角增大。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，包括将编码LCl蛋白的多核苷酸转入植物，获得转化入所述多核苷酸的植物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，包括 (51)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有多核苷酸，其编码LCl蛋白； (52)将植物的细胞或组织或器官与步骤(SI)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法包括降低植物中LCl蛋白的表达；从而调节植物的叶倾角减小。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述降低植物中LCl蛋白的表达包括 将下调所述LCl蛋白的编码序列表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官，从而下调植物中LCl蛋白的表达。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括 (i)提供携带可干扰基因表达的载体的农杆菌，所述的载体选自下组 (a)含有反方向启动的LCl蛋白的编码基因或基因片段的载体； (b)含有可在植物体内形成特异性干扰LCl蛋白的编码基因表达的成分的干扰分子的载体； (ii)将植物的细胞、组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物。
9.一种LCl蛋白或其编码基因的用途，用于调节植物的叶倾角；或用于制备调节植物的叶倾角的材料。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的LCl蛋白或其编码基因用于调节植物的叶倾角增大；或 所述的LCl蛋白或其编码基因用于制备调节植物叶倾角减小的材料。
11.一种降低LCl蛋白表达的物质的用途，用于调节植物的叶倾角减小。
12.—种调节植物的叶倾角减小的物质，其是含有反方向启动的LCl蛋白的编码基因或基因片段的载体。
13.—种调节植物的叶倾角增大的物质，其是含有编码LCl蛋白的多核苷酸的表达载体。
14.一种LCl蛋白或其编码基因用途，用于作为鉴定植物的叶倾角大小的分子标记。
全文摘要
本发明涉及一种植物叶倾角调控基因及其用途。本发明首次发现LC1基因对于植物的叶倾角起到了调节作用。因此，可以将LC1基因应用于植物的改良培育中，选育出具有特定品质性状的品种。
文档编号A01H5/00GK102732551SQ20111008723
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月7日 优先权日2011年4月7日
发明者薛红卫, 赵淑青 申请人:中国科学院上海生命科学研究院