一种能够表达人抗体的转基因动物的制备方法【专利摘要】本发明涉及能产生人抗体的小鼠的制备方法，该方法包括将携带包含人抗体重链基因座的部分片段的转基因小鼠，与携带插入到小鼠基因组DNA中具有未经重排的人抗体轻链基因座部分片段的小鼠杂交，所述人抗体重链和轻链基因座在转基因小鼠中可以进行基因重排和基因转变，以产生各种人源免疫球蛋白。其中小鼠内源抗体重链基因座、小鼠内源抗体κ轻链基因座和Lamda轻链基因座被失活。【专利说明】一种能够表达人抗体的转基因动物的制备方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及的是一种产生人抗体的小鼠的制备方法。【
背景技术：
】[0002]由细菌、真菌、病毒和寄生虫导致的感染性疾病的治疗很大程度基于抗生素的治疗。然而，抗药性的出现要求不断开发新的抗生素。患有恶性疾病和癌症的患者的治疗主要基于化疗，然而，这些治疗中的许多是无效的，并且患者的死亡率高，对于感染性疾病和癌症，需要改进和创新的治疗。抗移植器官排斥的甾体类治疗需要使用生物试剂(单克隆或多克隆抗体制剂)，该生物试剂在移植受体中逆转正在进行的同种异体免疫应答。从动物获得的抗体制剂的主要问题是人类患者中非人免疫球蛋白的免疫原性。为了减少非人免疫球蛋白的免疫原性，提出了在动物中对抗体基因进行改构.例如，已经证明通过融合鼠源抗体可变(V)区外显子和人恒定(C)区外显子，可以获得嵌合抗体基因。然而，该方法只能去除由非人Fe区导致的免疫原性，而其余的非人Fab序列仍然可以是免疫原性的。在另一种方法中，将人免疫球蛋白重链和轻链基因导入了小鼠基因组中。已经有几种将人免疫球蛋白基因导入小鼠基因组中使人各种抗体所有组成组件在基因工程化小鼠中的表达的方法。我们提供了一种利用细菌人工染色体载体(BAC)将人免疫球蛋白重链和轻链基因导入了小鼠基因组中的方法。在小鼠血清中可以检测到人抗体的分泌。【
发明内容】[0003]本发明提供包含两个人免疫球蛋白基因座部分片段的转基因非人类哺乳动物，其中所述两个人免疫球蛋白基因座中的一个是人重链基因座，而另一个基因座是人轻链基因座的。在某些转基因非人类哺乳动物中，所述人免疫球蛋白基因座包含人类14号和2号染色体的片段，所述人免疫球蛋白重链与轻链基因座随机整合在非人哺乳动物基因组DNA中。在这些转基因非人类哺乳动物中，所述人重链和轻链基因座的被克隆到细菌人工染色体(BAC)载体中，所克隆的人免疫球蛋白重链基因座部分片段包含至少一个非重组过的可变区基因(V)、D区基因(D)、连接区基因(J)和恒定区基因(C)以及重链基因座的3增强子核心序列，所述序列可以在不同的BAC载体中。所克隆的人免疫球蛋白轻链基因座部分片段包含至少一个非重组过的可变区基因(V)、连接区基因(J)和恒定区基因(C)以及轻链基因座的3增强子核心序列，所述序列可以在不同的BAC载体中。在某些转基因非人类哺乳动物中，所述转基因非人类哺乳动物是小鼠。在转基因非人类哺乳动物中，所述内源哺乳动物重链基因座和至少一个哺乳动物轻链基因座被失活。在某些这样的转基因非人类哺乳动物中，所述内源哺乳动物重链基因座(IgH)和K轻链基因座(IgK)和Lamda轻链基因座(IgL)被失活。[0004]本发明还提供检测转基因非人哺乳动物血清中人抗体表达的方法，所述方法包括:小鼠血清的制备，酶联免疫竞争的方法检测小鼠血清中人抗体IgM的浓度。[0005]本发明还提供用于产生多种表达人抗体序列的B细胞的方法，所述方法包括:提供包含两个人免疫球蛋白基因座部分序列的转基因非人类哺乳动物，其中所述两个人免疫球蛋白基因座中的一个是人重链基因座，而另一个基因座是人轻链基因座；并且其中所述基因座中至少一个是由BAC载体导入的；并且对所述转基因非人类哺乳动物免疫，可以产生多种表达人抗体序列的B细胞并收集多种表达人抗体表达序列的B细胞。这些方法还包括使所述多种B细胞与骨髓瘤细胞融合形成可以分泌人单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法。其它这样的方法还包括从所述杂交瘤细胞中克隆和纯化所述人抗体序列，所述编码人抗体的序列是全长的。在某些方法中，所述编码人抗体的序列在转染细胞中表达。在某些这样的方法中，所述人轻链基因座包含得自天然人K轻链基因座的未经重排的序列。在某些这样的方法中，所述人K轻链基因座是插入的BAC载体介导的人轻链基因座片段转基因。在某些这样的方法中，所述多种B细胞至少包含编码具有选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM中某种抗体类型的B细胞。在某些方法中，所述IgA同种型是IgAl或IgA2。在某些方法中，所述IgG同种型是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在某些这样的方法中，所述多种B细胞至少包含编码具有选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的不同于所述第一同种型的第二同种型的抗体的第二B细胞。在某些方法中，所述多种B细胞至少包含5种B细胞，每种B细胞编码一种具有不同同种型的抗体，其中所述抗体的类型分别为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。[0006]本发明的一种实施方案中，本发明提供了改进的BAC转基因构建体或载体，所述转基因构建体或载体含有至少一种人抗体重链和轻链基因座的部分片段，其中该片段或片段的部分经或未经基因修饰而含有至少一种人抗体重链和轻链基因座的片段。这些片段具有在非人动物中进行基因重排和基因突变的能力，从而产生多样的人源免疫球蛋白所有组成成分.[0007]本发明提供的一种人源Ig基因座是含有一个或多个V基因片段、一个或多个D基因片段、一个或多个J基因片段、以及一个或多个恒定区基因片段的人源化重链基因座，其中至少一个基因片段是人重链基因片段。人源化重链基因座中的基因片段以未重排、部分或完全重排的构型彼此并列。优选的人源化重链基因座含有人恒定区基因片段，优选含Ca或Cy。更优选的人源化基因座含有多个V基因片段和至少一个人V基因片段，以及一个人重链恒定区片段。人V基因片段位于非人V基因片段下游。[0008]另一种人源Ig基因座是含有一个或多个V基因片段、一个或多个J基因片段、以及一个或多个恒定区基因片段的人源化轻链基因座，其中至少一个基因片段是人轻链基因片段。人源化轻链基因座中的基因片段以未重排或重排的构型彼此并列.优选的人源化轻链基因座含有人恒定区基因片段，优选含Ca或Cy。更优选的人源化轻链基因座进一步含有多个V基因片段和至少一个人V基因片段。人V基因片段位于非人V基因片段下游。甚至更优选的人源化轻链基因座含重排的人VJ片段，置于许多(如10-100)非人或人来源的VL基因片段下游。[0009]本发明的另一种实施方案涉及通过从非人动物分离Ig基因座或Ig基因座的一部分，并且将需要的人Ig基因片段整合至分离的动物Ig基因座或Ig基因座的分离部分而制备含人源化Ig基因座的转基因载体的方法。通过以保持基因座在非人动物中进行有效基因重排和基因转变的方式进行连接或同源重组，将人Ig基因片段整合至分离的动物Ig基因座或Ig基因座的分离部分。通过同源重组进行的人Ig基因片段的整合可以通过使用本发明的重组载体而完成。[0010]在另一种实施方案中，本发明提供了制备能够产生人源抗体的转基因动物的方法。该转基因动物可以通过将含人源Ig基因座的转基因载体或含人Ig基因片段的重组载体导入受体细胞或动物细胞，并且从基因修饰的受体细胞或细胞得到动物而获得。[0011]提供了含一种或多种人源Ig基因座的转基因动物和来源于所述转基因动物的细胞(例如来自于免疫的转基因动物的B细胞).本发明的转基因动物可以对转基因的人源Ig基因座进行基因重排和基因转变，以产生多样的人源免疫球蛋白分子所有组成成分。[0012]人免疫球蛋白重链基因座位于人14号染色体上，全长1.5mb，有50个左右的可变区基因，D区和J区基因以及9种恒定区(C)区基因组成。用于显微注射的BAC克隆I为人工构建的含6个可变区基因的Ig序列；BAC2和BAC3分别带有原始的和/或人工构建的人抗体重链基因座D区、J区和C区基因序列，可以带有人工克隆的人抗体重链基因座3‘_增强子核心序列或基因组序列(红色部分)(见图1)。[0013]人免疫球蛋白轻链基因座K位于人2号染色体上，由多个V区基因、J区基因和I个C区基因组成。BAC3是人工构建的带有6个人抗体轻链基因座Kappa(IgK)可变区基因的DNA序列，BAC4是带有原始的和/或人工构建的带有人轻链基因座Kappa(IgK)J区和C区的DNA序列，可以带有人工构建的人抗体轻链基因座(IgK)3’_端增强子核心序列或基因组序列(如图2所示)[0014]经纯化的BACDNA在脉冲场凝胶电泳场中分离鉴定其大约浓度和完整性。这个纯化的BACDNA分子带有人抗体重链基因座中的D区和J区基因(如图3所示)。[0015]4号、5号和7号转基因小鼠同时带有人人抗体重链和轻链基因座片段(如图4、图5所示)。[0016]3只小鼠血清中中人IgM的浓度分别达到36.5ug/ml,44.lug/ml和45.7ug/ml(如图6所示)。[0017]本发明的一个实施方案提供了可以产生人源免疫球蛋白(抗体)的转基因小鼠。[0018]“人源抗体”或“人源免疫球蛋白”表示具有完全人免疫球蛋白多肽序列(或由人Ig基因片敷编码的多肽序列)的免疫球蛋白分子。本发明的人源免疫球蛋白分子可以从经基因工程化而产生人源免疫球蛋白分子的转基因非人哺乳动物中分离。相对于从动物制备或从来源于动物的细胞制备的非人源免疫球蛋白，这些人源免疫球蛋白分子对灵长类动物，特别是人的免疫原性较低。[0019]此处用到的“非人哺乳动物”包括，但不限于，大鼠、小鼠、兔、猪、绵羊、山羊、牛和马。优选的非人哺乳动物是主要依赖于组成抗体各组分，如V区、D区、J区和C区的基因重排，基因转变和或体细胞超变而产生抗体多样性的哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、猪、绵羊、山羊、和牛。特别优选的非人动物是小鼠和大鼠。[0020]在人和小鼠等动物中，在重链基因座上有多个拷贝的V，D(只在重链基因座中)和J基因片段，在轻链基因座上有多个拷贝的V和J基因片段。这些动物中的抗体多样性主要由基因重排产生，即由基因片段的不同组合形成重排的重链可变区和轻链可变区。重排的Ig基因的进一步多样化通过基因转变而完成，基因转变是一种过程，其中来源于上游V基因片段的短序列替代了重排Ig基因中V基因片段内的短序列。[0021]此处用到的“Ig基因片段精是指编码Ig分子各部分的DNA的片段及非编码的启动子和增强子序列，这些片段存在于动物和人的种系中，并且一起进入B细胞以形成重排的Ig基因。因此，此处用到的Ig基因片段包括V基因片段、D基因片段(轻链基因座中不含)、J基因片段和C区基因片段，以及非编码的启动子和增强子序列。[0022]本发明的优选人源抗体来自于转基因非人哺乳动物，该动物的抗体多样性主要由基因重排和基因突变产生，该动物如大鼠、小鼠、兔、绵羊和牛；优选为小鼠。[0023]一旦制备了能够产生多样化的人源免疫球蛋白分子的转基因非人哺乳动物，通过用抗原免疫该动物就可以容易获得抗该抗原的人源免疫球蛋白和人源抗体制剂.可以用各种抗原免疫转基因宿主动物。这些抗原包括，存活的、减毒的或死亡的微生物，如病毒和单细胞生物(如细菌和真菌)，微生物片段或从微生物分离的抗原性分子。[0024]可以采用任意方便的方式将这些抗原可以给予转基因宿主动物，可以使用或不使用佐剂，并且可以根据预定的方式给药。[0025]免疫后，可以对被免疫的转基因动物的血清进行分级分离，以便纯化特异于抗原的药物级多克隆抗体，可以通过层析(亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等)，用硫酸铵等盐、乙醇等有机溶剂或聚乙二醇等聚合物进行选择性沉淀而获得浓缩的、纯化的免疫球蛋白级分。[0026]为制备单克隆抗体，从被免疫的转基因动物分离脾细胞，用于与转化的细胞系融合产生杂交瘤，或通过标准分子生物学技术克隆编码抗体的cDNA并且在转化的细胞中表达。制备单克隆抗体的程序是本领域公知的。例如欧洲专利申请O583980Al("MethodForGeneratingMonoclonalAntibodiesFromRabbits”)，美国专利N0.4,977,081("StableRabbit-MouseHybridomasAndSecretionProductsThereof”)，WO97/16537("StableChickenB-cellLineAndMethodofUseThereofu).和EP049105781(uHybridomaWhichProducesAvianSpecificImmunoglobulinGu),在此引入其公开内容作为参考，从克隆的cDNA分子体外产生单克隆抗体的方法描述于Andris-ffidhopfetal.,"Methodsforthegenerationofchickenmonoclonalantibodyfragmentsbyphagedisplay",TmmunolMethods242:159(2000),和Burton,D.R.,"Phagedisplay"，Immunotechnology1:87(1995),在此引入其公开内容作为参考。[0027]本发明进一步涉及新的核苷酸序列和载体，以及该序列扣载体在制备产生人源化免疫球蛋白的转基因非人动物中的用途。简言之，非人哺乳动物的基因工程包括将一个或多个人Ig基因片段整合至动物基因组，以产生一个或多个人源Ig基因座。应该理解的是，根据基因修饰中所使用的方法，人Ig基因片段可以被整合在动物的内源性Ig基因座(例如作为定向插入的结果)，或整合在动物的不同基因座。也就是说，人源Ig基因座可以位于动物内源性Ig基因座通常所在的染色体位置，或位于动物内源性Ig基因座通常所在位置以外的染色体位置。不论在染色体上的什么位置，本发明的人源Ig基因座具有在非人哺乳动物中进行基因重排和基因转变的能力，从而能够产生多样化的人源化免疫球蛋白分子所有组成成分。具有进行基因重排和基因转变的能力的Ig基因座此处也称作“功能性”Ig基因座，由功能性Ig基因座产生的具有多样性的抗体此处也称作“功能性抗体”。[0028]在一种实施方案中，本发明提供了含人源Ig重链基因座的转基因载体，所述人源Ig重链基因座含有一个或多个V基因片段、一个或多个D基因片段、一个或多个J基因片段、以及一个或多个恒定区基因片段，一个或多个3端增强子的核心序列。这种人源重链基因座中的基因片段是未经重排的基因组序列。人源重链基因座在非人动物中具有进行基因重排(如果基因片段没有完全重排)和基因转变的能力，从而产生具有人多肽序列的多样化的重链所有组成成分，或“人源重链”。[0029]在一种优选实施方案中，人源重链基因座含有5种C区基因片段，该片段为人恒定区基因片段，分别为C、C、C，C和C(包括C亚类1，2，3和4的任意一种)。[0030]在另一种实施方案中，本发明提供了含人源轻链基因座的转基因载体，所述人源轻链基因座能够在宿主动物中进行基因重排和基因转变，从而产生具有人多肽序列的多样化的轻链所有组成成分，或“人源轻链”。[0031]人源轻链基因座含有一个或多个V基因片段、一个或多个J基因片段、以及一个或多个恒定区基因片段。这种人源轻链基因座中的基因片段以未重排的方式彼此并列。[0032]在一种优选实施方案中，人源轻链基因座含有至少一种C区基因片段，该片段为人恒定区基因片段，优选为C。[0033]本发明的另一方面涉及制备含人源Ig基因座的转基因载体的方法。这些方法包括从人基因组DNA中分离人Ig基因座或其一部分，并将这些DNA片段连接成具有有效基因重排和基因转变的能力的人源Ig基因座的方法。[0034]优选地，这些大的DNA片段可以通过筛选从人基因组DNA制备的质粒、粘粒、YACs或BACs等文库而分离。具有功能的的人源Ig基因座可以包含在一个或多个质粒或粘粒克隆中。YAC克隆可以携带最多至2兆碱基的DNA片段，因此完整的人重链基因座和轻链基因座可以在一个YAC克隆中分离。BAC克隆携带的DNA片段较小，约150_250kb，而且操作简便，因此含Ig基因座的重·叠片段的多个BAC克隆可以被同时注射至动物受精卵细胞，其中重叠片段整和到动物基因组中后可以重组,从而产生完整的Ig基因座,其中的各DNA组分可以通过基因重排和基因转变导致多样化的人源抗体所有组成成分的产生。[0035]可以通过各种方法将人Ig基因片段整合至载体(如BAC克隆)上的Ig基因座中，所述方法包括通过同源重组连接DNA片段或采用经典的分子生物学方法将不同的片段插入到BAC载体中。[0036]优选地，通过同源重组将人Ig基因片段整合至Ig基因座中.同源重组可以在细菌、酵母和其它细胞中通过高频率的重组事件而进行。例如，用含有人Ig基因座或其大部分的BAC转化大肠杆菌细胞。随后，用前面所描述的重组载体进一步转化所述大肠杆菌细胞，该载体携带与人的可变区序列或3’-端增强子序列。重组载体中的5和3’-端序列与BAC上的人Ig基因片段的侧翼序列同源。作为同源重组的结果，可以形成有基本功能的人Ig基因座。人源的YACs和BACs可以容易从细胞分离，并且用于制备转基因动物。[0037]在本发明的另一方面，提供了制备能够产生人源免疫球蛋白的转基因动物的方法。[0038]根据本发明，可以将上述一种或多种携带人源Ig基因座的转基因载体导入动物的一个或多个受体细胞，并且从一个或多个受体细胞衍生动物，然后通过随机整合或定向整合而整合至一个或多个受体细胞的基因组，从而制备能够产生人源免疫球蛋白的转基因动物。[0039]对于随机整合，可以通过标准转基因技术将舍有人源Ig基因座的转基因载体导入动物的受体细胞。例如，可以将转基因载体直接注射至受精卵的原核中。也可以通过在卵受精之前将精子与转基因载体共孵育而导入转基因载体。可以从受精卵发育成转基因动物。导入转基因载体的另一种方式是通过转染胚胎干细胞(ES)或诱导型多能干细胞(iPS)并且随后将基因修饰的胚胎干细胞或诱导型多能干细胞(iPS)注射至发育中的胚胎。替代地，可以直接将转基因载体(裸露的或与促进剂结合)注射至发育中的胚胎。最终，从含有整合至转基因动物的至少一些体细胞的基因组中的人源Ig转基因的胚胎产生嵌合的转基因动物。[0040]在一种优选实施方案中，将含有人源Ig基因座的转基因随机整合至来源于内源性免疫球蛋白基因失活的动物的受体细胞(如受精卵或发育中的胚胎)的基因组中。这些动物的使用允许来自于人源转基因Ig基因座的免疫球蛋白分子的优先表达。这些动物的例子包括Alicia和Basilea兔，内源性抗体重链和轻链基因座敲除的小鼠和大鼠等。可以使具有人源免疫球蛋白转基因或基因座的转基因动物与内源性免疫球蛋白表达受损的动物交配，获得对于失活的内源性Ig基因座和人源转基因Ig基因座为整合的后代。[0041]对于定向整合，可以将转基因载体导入适当的动物受体细胞，如胚胎干细胞或已经分化的体细胞。此后，可以通过标准方法选择其中的转基因被整合至动物基因组并且通过同源重组被相应的内源性Ig基因座替代的细胞。然后可以将所选择的细胞与去核的受体细胞，如卵母细胞融合，这些细胞为全能的，可以形成有功能的新生动物。然后将得到的卵的细胞收获于适当培养基中，并且转移至同步的受体中，用于产生转基因动物。替代地，可以将所选择的基因修饰的细胞注射至发育中的胚胎，该胚胎随后发育成嵌合动物。[0042]类似于转基因载体的定向插入，适于作为该方法中的受体细胞的细胞包括胚胎干细胞或已经分化的体细胞。携带人Ig基因片段的重组载体可以通过任何可行的方法，如转染，被导入这些受体细胞中。此后，可以通过标准方法选择其中通过同源重组用人Ig基因片段取代了相应的内源性Ig基因片段的细胞。这些基因修饰的细胞可以作为核转移程序中的核供体细胞，用于克隆转基因动物。替代地，可以将所选择的基因修饰的胚胎干细胞注射至发育中的胚胎，该胚胎随后发育成嵌合动物。[0043]由前述任一种方法产生的转基因动物形成了本发明的另一种实施方案。转基因动物在基因组中具有至少一个，即一个或多个人源Ig基因座，由其产生功能性的人源抗体所有组成成分。[0044]在一种优选实施方案中，本发明提供了基因组中具有一个或多个人源Ig基因座的转基因小鼠。本发明的转基因小鼠可以对人源Ig基因座进行重排和基因转变，并且表达功能性的人源抗体所有组成成分。[0045]来自于本发明的转基因动物的细胞，如来自于用一种抗原免疫的转基因动物所建立的B细胞或细胞系也是本发明的一部分。【专利附图】【附图说明】[0046]图1:人抗体重链基因座的结构，人免疫球蛋白重链基因座位于人14号染色体上，全长1.5mb，有50个左右的可变区基因，D区和J区基因以及9种恒定区(C)区基因组成。[0047]图2:人抗体轻链基因座IgK的结构，人免疫球蛋白轻链基因座K位于人2号染色体上，由多个V区基因、J区基因和I个C区基因组成。[0048]图3:脉冲场凝胶电泳方法检测纯化的BACDNA,经纯化的BACDNA在脉冲场凝胶电泳场中分离鉴定其大约浓度和完整性。[0049]图4:人抗体轻链基因座转基因小鼠的PCR检测。[0050]图5:人抗体重链基因座转基因小鼠的PCR检测。[0051]图6:人抗体IgM在转基因小鼠血清中的平均浓度检测，3只小鼠血清中人IgM的浓度分别达到36.5ug/ml,44.lug/ml和45.7ug/ml【具体实施方式】[0052]实施例1[0053]含有人抗体基因座BACDNA的纯化[0054]UBAC菌种小培养。挑取划线单菌落接种到15mL离心管中，培养体积3mL，管盖略松。200rpm，30°C培养16-20h。氯霉素终浓度12.5ug/mL。[0055]2、BAC菌种大培养。将小培养的菌液按照1:500的比例接种到摇瓶中，培养体积400mL，200rpm,30°C培养16_20h。氯霉素终浓度12.5ug/mL。[0056]3、使用MN试剂盒大提BACDNA。相关步骤参照《Endoto-freePlasmidDNAPurificationUserManual—NucleobondXtraMidiEF))?BACDNA放4°C保存。[0057]4、使用Nanodrop测量提取的BACDNA浓度。PFGE分析。[0058]5、纯化的BACDNA可以直接进行显微注射，或者线性化以后，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后用于显微注射。例如，可以采用NotI(选用高浓度，50000U/uL)过夜酶切BACDNA,酶切体系不超过300uL，底物BACDNA应20_30ug。每Iug底物对应5U的酶量。[0059]BACDNA的显微注射[0060]1、受精卵的准备:[0061]将可育雌鼠注射孕马血清促性腺激素(PMSG)与人绒毛促性腺激素(HCG)后，与可育雄鼠交配从而得到超排卵。次日从输卵管内收集受精卵备用。[0062]2、假孕母鼠的准备:[0063]同时，将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，刺激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为转基因后受精卵的代孕母亲。[0064]3、显微注射得到转基因受精卵:[0065]显微注射装置中的固定针利用负压将受精卵固定，注射针同时将纯化的BACDNA导入受精卵雄性原核内，，注射浓度为0.5-lng/ml。若见雄性原核膨胀，则成功完成一次显微注射。[0066]4、胚胎移植:[0067]将已成功转入基因的受精卵移入假孕母鼠身体两侧的输卵管内(20卵/侧)，使胚胎在代孕母体内发育，经一个完整的发育周期则会产下小鼠。[0068]转基因小鼠的PCR检测[0069]剪去0.5厘米大小的15-21天大的小鼠尾巴，用眼科剪充分剪碎后，加500微升含有50微克/毫升蛋白酶K的消化缓冲液，55度消化过夜。加入等体积的Tris平衡的苯酚抽提，4度10000转/分离心5分钟，取上清加入等体积的氯仿/异戊醇抽提，4度10000转/分离心5分钟，取上清加2倍体积无水乙醇，4度10000转/分离心10分钟，去上清，DNA沉淀用I毫升70%乙醇洗涤后晾干，用500微升TE溶液或水溶解，4度保存。[0070]取2微升DNA用于转基因小鼠的PCR鉴定，重链检测引物为primer_F:ggactgttgaagccttcgg和PrimmerR:ggttcttggacgtgtctactg,轻链检测引物为PClprimer-F:gagaagtggcaagacagtgatc和PCIprimer-R:agatgggacacttacaggtgtg。PCR反应体系如下:[0071]DNA2ul[0072]IOXPCR缓冲液5ul[0073]IOmM的dNTPIul[0074]20uM引物混合物2ul[0075]TaqDNA聚合酶0.5ul[0076]水补至总体积50ul。[0077]PCR条件:94度40秒，56度40秒，72度40秒，30个循环。PCR产物用琼脂糖电泳方法进行鉴定。共鉴定出同时含有人重链和轻链基因座的转基因小鼠3只(图4)。[0078]转基因小鼠中人IgM浓度的检测[0079]通过小鼠的眼眶用毛细管取血100微升，室温放置1-2小时使血液凝固，2000转/分钟4度离心10分钟分离血清。取上层血清并置于一个干净的1.5毫升离心管中，4度保存备用。[0080]按照人IgM检测试剂盒说明书的要求，使用试剂盒提供的人IgM标准品建立0，1，5，10，50，100微克/毫升的标准曲线孔，取50微升小鼠血清加入已包被抗人IgM抗体的96孔板的样品孔中，37度孵育I小时，PBS-土温20缓冲液洗涤96孔板5_7次，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的人IgM，37度孵育I小时，PBS-土温20缓冲液洗涤96孔板5_7次后，扣干96孔板,加入50微升显色液,室温避光放置15-20分钟,加入50微升终止液,在酶标仪上读取数据并计算人IgM在转基因小鼠血清中的浓度。三只转基因小鼠的血清中人IgM的表达水平分别为36.5ug/ml，44.lug/ml和45.7ug/ml(图5)。[0081]转基因小鼠B细胞的分离[0082]取小鼠脾脏加PBS后研磨,过200目细胞筛,滤过细胞悬液1500转/分钟室温离心5分钟，加10毫升PBS洗涤，再次离心后，沉淀用PBS重悬，则大部分细胞为小鼠B细胞。还可以使用磁珠法和流式细胞分选法，利用B细胞表面的特异标志分子，如CD19抗原，采用生物素标记或荧光标记的抗小鼠CD19抗体进行纯化。获得的B细胞可以与骨髓瘤细胞融合制备分泌人单克隆抗体的杂交瘤细胞株。【权利要求】1.能产生人抗体的小鼠的制备方法，所述小鼠携带转基因，所述转基因已经插入到小鼠基因组DNA中且具有未经重排是人抗体重链和轻链基因座，该方法包括将携带包含人抗体重链基因座的部分片段的转基因小鼠，与携带插入到小鼠基因组DNA中具有未经重排的人抗体轻链基因座部分片段的小鼠杂交，所述人抗体重链和轻链基因座在转基因小鼠中可以进行基因重排和基因转变，以产生各种人源免疫球蛋白。其中小鼠内源抗体重链基因座、小鼠内源抗体K轻链基因座和Lamda轻链基因座被失活。2.权利要求1的方法，其中所述转基因是含未经重排的人抗体重链基因座的部分片段，被克隆到人细菌人工染色体(BAC)中，并导入小鼠基因组中。3.权利要求1的方法，其中具有未经重排的人抗体轻链基因座的转基因的用BAC载体导入小鼠基因组中。4.权利要求1的方法，其中未经重排的人抗体轻链基因座片段是人抗体轻链K基因座片段。5.权利要求1的方法，所述小鼠来自于人抗体重链基因座转基因小鼠和人抗体K轻链基因座转基因小鼠的杂交，其中小鼠内源抗体重链基因座和抗体K轻链基因座和/或Lamda轻链基因座(IgL)被失活。6.权利要求1的方法，其中所述转基因小鼠的制备方法，可以通过所述人抗体受精卵的显微注射的方法获得。7.权利要求1的方法，其中所述转基因小鼠的制备方法，可以通过对小鼠胚胎干细胞(ES)、诱导型干细胞(iPS)或体细胞(如皮肤成纤维细胞)的转染而获得。【文档编号】A01K67/027GK103571872SQ201210281415【公开日】2014年2月12日申请日期:2012年8月9日优先权日:2012年8月9日【发明者】冯东晓,戴洁,张卉,徐从伦,董创创,刘红申请人:山东国际生物科技园发展有限公司